一种改良的哺乳动物精子mRNA定位方法与流程

背景技术：
荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，fish)可以用适当的cdna制备探针，检查目的rna的存在，并推测相应基因的转录和表达情况，可对细胞(尤其是一些不易分裂或不能分裂的细胞)样本中的待测核酸进行准确定位和定性分析。这为分离精子的鉴定研究和应用提供了准确可靠的研究途径。本发明是涉及一种改良的fish技术，其改良后的优点是：1.能防止污染2.提高试验的精确性。

技术实现要素：
为了克服传统fish技术中的一些缺点，本发明通过来自没有体细胞污染的精子rna的逆转录酶-聚合酶链式反应(rt-pcr)扩增制备sry特异性探针，对精子进行fish，以期建立一种对mrna在精子中所处的位置进行精确定位。

附图说明：

图一为本发明分选x精子fish测定实验效果图；

图二为本发明常规精子fish测定实验效果图；

图三为本发明分选y精子fish测定实验效果图。

具体实施方式：

以下结合发明给出的具体制备实施例及效果实施例来进一步说明本发明的有益效果。

1.精子标本制备

细管冻精38℃解冻，使用光学显微镜明视野400倍放大率下检查样品来排除白细胞或其他细胞物质的任何污染，用血细胞计数器测定精子浓度。精液样品进行上游处理，具体为用2.5毫升dulbecco′s改良的eag培养基覆盖6×10⁷精子(约0.5毫升)，离心700转，持续10min，之后将样品在37℃培养45分钟，将上清液(约1.5ml)离心获得运动精子。取精子悬液在apes处理过的载玻片上滴片，55℃干燥；镜检观察精子分布情况，标记杂交位置。

2.探针的制备

所有rna样品的逆转录用含有2.5mm随机六聚体和200u上标逆转录酶的20μl反应体积的商业试剂盒(gibcobrl)在42℃下进行1h。逆转录酶在99℃变性5min，并将cdna冻结直至使用。使用cdna作为模板和商业合成的基因特异性引物通过pcr获得sry转录物的扩增。使用基于cdna和oligomrna的oligo6软件设计sry基因特异性引物(srybostaurus性别决定区，ymrna；cd44bostaurus透明质酸受体，mrna)。这些引物跨越sry基因的142bp。对于pcr，在终体积为25μlpcr混合物中扩增2μlcdna，所述混合物含有10mmtris/hcl缓冲液，ph8.3；50mmkcl；1.5mmmgcl2；每种引物30pmol；和2u的taq聚合酶。使用以下循环条件在pcr仪中进行扩增30个循环：95℃1min，60℃1min，72℃1min，最后在72℃延伸5min。每种产物4μl的体积在2％琼脂糖凝胶上运行，用溴化乙锭染色，并在紫外透射仪下观察。条带的特异性也通过pcr产物的测序证实。

3.精子fish

将来自哺乳动物的y分选的精子组合为单个样品，然后将其分成四组：提供不含探针的阴性对照dna的样品，srydna，用rna酶a处理的阴性对照rna，sryrna。对每组进行fish。srydna组的精子样品进行核解聚，蛋白酶k处理，和酒精脱水，然后将它们用rna酶a处理并连接至地高辛标记的sry探针。用于杂交的探针使用sry基因特异性引物(用于northern杂交)通过pcr扩增精子cdna来制备。凝胶洗脱(millipore，usa)根据制造商(roche，basel，switzerland)的说明，使用随机引物标记方法用地高辛标记pcr产物。标记后，通过乙醇沉淀去除游离核苷酸。

标本杂交前处理：将精子涂布在3-氨基-丙基三乙氧基硅烷包被的载玻片上，风干，并储存在-20℃直至使用。将载玻片在有2％乙酸和2.5％甲醛的磷酸盐缓冲液(pbs)中固定20min；在乙醇中脱水并在室温(25℃)下在二甲苯中温育15min；再水合后，将载玻片在0.01％胃蛋白酶(ph4.0；sigma，usa)中于37℃温育20min；细胞在无rna酶的水中洗涤并脱水。

变性：探针和靶标在78℃共变性5min。

杂交：将2μg/μl探针在杂交混合物(50％甲酰胺，4×ssc，10％硫酸葡聚糖，0.25％酵母trna和0.25％鲱鱼精子dna)中稀释并施用于载玻片；用橡皮泥密封盖玻片，并在42℃保持10min进行预杂交；杂交在加湿室中于42℃过夜进行。

杂交后洗涤和显色：在含有0.1％np-40的1×ssc中于68℃进行洗涤1min，然后在室温下在2×ssc中洗涤3min。在2％正常绵羊血清(sigma，usa)中封闭1h，然后在37℃下在稀释的(1∶100)异硫氰酸荧光素(fitc)缀合的抗地高辛配基抗体(roche)中温育2h。广泛地洗涤载玻片以除去未结合的抗体，然后用fitc信号扩增试剂盒(roche)进行信号放大。用含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)作为复染剂的抗褪色培养基(vysis，toulouse，法国)将细胞固定。

数据收集与分析：在荧光显微镜下用适当的滤光片(nikon90i，kawasaki，japan)观察信号，并且通过图像分析软件(imageproplus3.1，imagepro，mediacybernetics，republicofsingapore)采集数字化图像。记录显示绿色荧光信号的精子。

实验例：

sry基因：sry基因是位于y染色体短臂上的一段单拷贝基因，这个基因已知的生物学作用是在胚胎发育9.5-11.5d表达，作为开关打开胚胎睾丸基因表达路径，从而决定胚胎的性别。sry基因在单倍体y精子中表达，提示它存在有性别决定以外的生物学功能，探明该基因在y精子中定位、真核表达蛋白的性质和成熟精子表达该蛋白的实际状况都是必要的。在x精子中，sry基因应为0％；在y精子中，sry基因应为100％；而在常规精子中，sry基因理论为50％。

实验材料：分选x精子、分选y精子、常规精子均来自商品冻精。

实验方法：按照说明书中具体实施方式中叙述的方法进行，实验结果用卡方检验进行分析。

实验效果：精子中sry表达的fish分析

表1分选x、y精子及常规精子有杂交信号精子计数结果与fish测定

注：同行无字母出现表示差异不显著(p＞0.05)

由表1可知：分选x精子的纯度为93.9％，fish测定纯度为95.7％，两者差异不显著(p＞0.05)；分选y精子的纯度为94.6％与fish测定纯度95.6％差异不显著(p＞0.05)；常规精子的精子纯度为49.9％与fish测定纯度50.2％差异也不显著(p＞0.05)。证明本方法可对sry基因进行准确测定。