中国人B7-H5表达阳性胰腺癌细胞系sipanc-1076建立方法与流程

本发明涉及一种胰腺癌原代肿瘤细胞建系的方法，主要是一种中国人b7-h5表达阳性胰腺癌细胞系sipanc-1076建立方法。

背景技术：

胰腺导管腺癌(pancreaticductaladenocarcinoma,pdac)是最常见的胰腺肿瘤，早期即发生转移，而症状不明显，发现时多数已是晚期，预后极差，确诊后五年生存率往往不足5％，被称为“癌中之王”^[1-3]，位于我国男性癌症患者死亡率的第六位^[4]。过去基础和临床研究中所用到的胰腺癌细胞系多来源于国外atcc细胞库，比如panc-1，bxpc-3，miapaca-2，aspc-1等，其细胞系来源于白种人胰腺癌患者，对我国胰腺癌研究来讲，可能存在一定的种群结构、基因等水平差异。由于胰腺癌本身乏血供^[5]、且多肿瘤相关成纤维细胞(cancerassociatedfibroblasts，caf)富集的特性，传统的肿瘤原代细胞建系方法在胰腺癌中的应用受到极大的限制。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种中国人b7-h5表达阳性胰腺癌细胞系sipanc-1076建立方法，公开了新的中国人源化胰腺导管腺癌(humanpancreaticductaladenocarcinoma)细胞系及其建系方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种中国人b7-h5表达阳性胰腺癌细胞系sipanc-1076建立方法，该方法包括如下步骤：

(1)、标本采集并制成组织块；

(2)、组织消化：将上述小组织块用5mlpbs重悬，加入700ul灭菌水配置的iv型胶原酶，工作浓度1437u/ml，25ul的无菌cacl2溶液，工作浓度1m，25-30mgbsa粉末，摇床37℃，200转/分，孵育15分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlpbs洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlpbs洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后待用；

(3)、胰腺癌organoid类器官建立与培养：前一天将低生长因子基质胶于4℃解冻。取500ul液态基质胶，重悬胰腺癌原代细胞沉淀，待基质胶凝固后，置于玻片小室或培养板中，添加5ml完全培养基；4-6天时，基质胶中长出圆环形类器官结构；10-12天时，取出基质胶，10mlpbs反复冲洗，胰酶消化基质胶，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlpbs洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清；

(4)、细胞传代与培养：将上述细胞沉淀加入新的无菌细胞培养基，培养基采用imdm培养基配置，含终浓度10％fbs(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，放置培养箱培养，培养条件为37℃，5％co2(v/v％)，定期观察细胞生存情况，细胞长满至70-80％经胰酶消化后转移至25cm²培养瓶培养传代。

所述的标本采集：无菌法收集新鲜胰腺癌肿瘤样本，立即浸入20ml普通培养基，普通培养基采用rpmi1640配置，含终浓度10％fbs(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，安全通风柜内使用20mlpbs反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm³大小组织块。

organoid类器官完全培养基配置：addmem/f12培养基，10mmhepes，2mmglutamax，青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，1乘b27，1mg/ml原代细胞抗生素primocin，1mmn-乙酰半胱氨酸，50％(v/v)wnt3a条件培养基，10％(v/v)rspo1条件培养基，10％(v/v)noggin条件培养基，50ng/ml表皮生长因子egf，10nm胃泌素，100ng/ml成纤维生长因子10，10mm尼克酰胺，0.5uma83-01。

本发明的有益效果为：本发明构建的中国人胰腺癌细胞系sipanc-1076生物学特征为胰腺导管腺癌，具有b7-h5呈阳性表达的这一其他商业化人胰腺癌细胞系不具备的独特特点，且其成瘤性良好，可应用于胰腺癌肿瘤免疫逃逸及中国人胰腺癌相关基因谱系分析等研究。

附图说明

图1为胰腺癌organoid类器官建立示意图。

图2为sipanc-1076细胞系普通光镜下形态(不同物镜倍数下)。

图3为流式细胞术检测sipanc-1076表面b7-h5表达情况(一抗mouseantihumanb7-h5,clone5b6-2；二抗apcgoatantimouseigg1,k；isotypemouseigg1,k)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明做详细的介绍：

本发明的建系方法：

1.标本来源：标本取自浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科67岁男性患者，病理诊断：胰腺导管腺癌，tnm分期：t3n0m0。

2.organoid类器官完全培养基配置：addmem/f12培养基，10mmhepes，2mmglutamax，青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，1乘b27(b27是很多配方的合剂，厂家的浓度是工作浓度的100倍，使用的时候稀释成1倍用)，1mg/ml原代细胞抗生素(primocin)，1mmn-乙酰半胱氨酸，50％(v/v)wnt3a条件培养基，10％(v/v)rspo1条件培养基，10％(v/v)noggin条件培养基，50ng/ml表皮生长因子(egf)，10nm胃泌素，100ng/ml成纤维生长因子10，10mm尼克酰胺，0.5uma83-01^[6]。

3.标本采集：无菌法收集新鲜胰腺癌肿瘤样本，立即浸入20ml普通培养基(rpmi1640配置，含终浓度10％fbs(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml)，安全通风柜内使用20mlpbs反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm³大小组织块。

4.组织消化：将上述小组织块用5mlpbs重悬，加入700ul灭菌水配置的iv型胶原酶(工作浓度1437u/ml)，25ul的无菌cacl2溶液(工作浓度1m)，25-30mgbsa粉末，摇床37℃，200转/分，孵育15分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlpbs洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlpbs洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后待用。

5.胰腺癌organoid类器官建立与培养：前一天将低生长因子基质胶(gfrmatrigel)于4℃解冻。取500ul液态基质胶，重悬胰腺癌原代细胞沉淀，待基质胶凝固后，置于玻片小室或培养板中，添加5ml完全培养基。约5天左右(4-6天时)，基质胶中可长出圆环形类器官结构。约10-12天时，取出基质胶，10mlpbs反复冲洗，胰酶消化基质胶，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlpbs洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清。

6.细胞传代与培养：将上述细胞沉淀加入新的无菌细胞培养基(imdm培养基配置，含终浓度10％fbs(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml)，放置培养箱培养(37℃，5％co2(v/v％))，定期观察细胞生存情况，细胞长满至70-80％可经胰酶消化后转移至25cm²培养瓶培养传代，一般4-5天左右传代一次。目前该sipanc-1076传代次数已经超过50代。

此外，对于肿瘤免疫研究来讲，前述商业化人胰腺癌细胞系其表面b7-h5表达均呈现阴性，而本株sipanc-1076其b7-h5呈现强阳性表达。因此，本发明建立的中国人胰腺癌细胞系对于研究国人胰腺癌发病机制，肿瘤免疫逃逸、侵袭转移等生物学特征，以及开发抗胰腺癌治疗新药等均有十分重要意义。

可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。