本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠肝脏巨噬细胞培养方法。
背景技术：
巨噬细胞是三大抗原提呈细胞之一，是参与非特异和特异性免疫的重要细胞。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。由于巨噬细胞具有较强的吞噬功能以及抗原提呈功能，所以在免疫学上具有较大的研究价值。
肝脏巨噬细胞，又称库普弗细胞（kupffercells,kc），存活于肝脏窦状管内，它可通过对病原体和转移细胞的反应来保护肝脏，同时也能忍受自身和外来抗体的损伤，其中，外来抗体可以通过门静脉和肝动脉进入血液。最近研究表明，肝脏巨噬细胞在纤维化、肝炎、肝肥胖疾病和肝移植的研究中有重要作用。肝脏巨噬细胞是一种研究正常生理和病理条件下巨噬细胞作用的较好的模型。
技术实现要素：
本发明提供了一种大鼠肝脏巨噬细胞培养方法，具体技术方案如下：
大鼠肝脏巨噬细胞培养法，包括以下步骤：
（1）将100mgvi胶原蛋白酶溶解于100mlkupffer细胞专用基础培养基中制成0.1%的消化液，40℃水浴锅内预热10min；
（2）将300mg肝素钠溶解于100mlkupffer细胞专用培养基中制成0.3%的清洗液液，40℃水浴锅内预热10min；
（3）取健康雌性sd大鼠1只，体重200g左右，异氟烷麻醉机麻醉大鼠，碘伏消毒液擦拭大鼠全身皮肤；
（4）大鼠呈仰卧位固定，十字型切口打开腹腔，将胃、肠推向大鼠左侧，暴露出肝脏；
（5）在肝门静脉插入留置针并用手术缝合线结扎注留置针软管，快速从下方切段下腔静脉，切段下腔静脉后3s内立刻从留置针灌注80ml清洗液液，灌注流速为12ml/min；
（6）灌注期间用无菌棉球堵住下腔静脉切口以便灌注充分，灌注期间没30s更换一次棉球；
（7）清洗完成后再灌入50ml消化液，流速为10ml/min，灌注期间每30s更换一次棉球；
（8）切取肝脏放置于培养皿内，眼科剪将肝脏剪至1.5mm3大小，转入30ml消化液中，37℃190rmp/ml摇动消化18min；
（9）70um细胞筛过滤消化好的细胞悬液，100g/min离心3min；
（10）取上清于新的50离心管中，400g/min离心8min，弃上清，10ml清洗液重悬细胞；
（11）取新的50ml离心管一个，加入10ml65%的percoll分离液，再往上层加入10ml35%的percoll分离液，最后将10ml细胞悬液加到最上层；
（12）950g/ml离心20min，用巴氏吸管小心吸取35%、65%percoll分离液交界处白膜层，用10ml清洗液重悬细胞，400g/min离心8min收集细胞，弃上清；
（13）用2mlkupffer专用完全培养基重悬细胞，计数，调整浓度至105个细胞/ml，接种5ml细胞悬液至100ug/ml多聚赖氨酸（15-30万单位）过夜包被过的t25瓶内，37℃、5%co2培养箱内培养；
（14）接种2.5h后弃去培养基，专用完全培养基轻轻清洗已贴壁细胞3次，再加入5ml完全培养基后继续培养。
通过提取培养大鼠肝脏巨噬细胞，建立肝脏巨噬细胞作用模型，对于肝脏巨噬细胞在纤维化、肝炎、肝肥胖疾病和肝移植的研究中有重要作用。
具体实施方式
实施例1：
大鼠肝脏巨噬细胞培养法，包括以下步骤：
（1）将100mgvi胶原蛋白酶溶解于100mlkupffer细胞专用基础培养基中制成0.1%的消化液，40℃水浴锅内预热10min；
（2）将300mg肝素钠溶解于100mlkupffer细胞专用培养基中制成0.3%的清洗液液，40℃水浴锅内预热10min；
（3）取健康雌性sd大鼠1只，体重200g左右。异氟烷麻醉机麻醉大鼠，碘伏消毒液擦拭大鼠全身皮肤；
（4）大鼠呈仰卧位固定，十字型切口打开腹腔，将胃、肠推向大鼠左侧，暴露出肝脏；
（5）在肝门静脉插入留置针并用手术缝合线结扎注留置针软管，快速从下方切段下腔静脉，切段下腔静脉后3s内立刻从留置针灌注80ml清洗液液，灌注流速为12ml/min；
（6）灌注期间用无菌棉球堵住下腔静脉切口以便灌注充分，灌注期间没30s更换一次棉球；
（7）清洗完成后再灌入50ml消化液，流速为10ml/min，灌注期间每30s更换一次棉球；
（8）切取肝脏放置于培养皿内，眼科剪将肝脏剪至1.5mm3大小，转入30ml消化液中，37℃190rmp/ml摇动消化18min；
（9）70um细胞筛过滤消化好的细胞悬液，100g/min离心3min；
（10）取上清于新的50离心管中，400g/min离心8min，弃上清，10ml清洗液重悬细胞；
（11）取新的50ml离心管一个，加入10ml65%的percoll分离液，再往上层加入10ml35%的percoll分离液，最后将10ml细胞悬液加到最上层；
（12）950g/ml离心20min，用巴氏吸管小心吸取35%、65%percoll分离液交界处白膜层，用10ml清洗液重悬细胞，400g/min离心8min收集细胞，弃上清；
（13）用2mlkupffer专用完全培养基重悬细胞，计数，调整浓度至105个细胞/ml，接种5ml细胞悬液至100ug/ml多聚赖氨酸（15-30万单位）过夜包被过的t25瓶内，37℃、5%co2培养箱内培养；
（14）接种2.5h后弃去培养基，专用完全培养基轻轻清洗已贴壁细胞3次，再加入5ml完全培养基后继续培养。