长链非编码RNA在慢性肾病诊断与筛查中的应用的制作方法

本发明涉及长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用技术领域，具体为一种长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用。

背景技术：

慢性肾病(ckd)的特征在于肾功能的进行性恶化，ckd起病隐匿，病程相对缓慢，知晓率低，因而通常不能被早期发现、早期诊断、早期治疗，最终可导致病情恶化进展或随病程迁延，发展为终末期肾病(esrd)，使得需要通过长链非编码rna对慢性肾病进行诊断与筛查工作。

现有的慢性肾病诊断与筛查手段通过肾活检来对肾脏损害程度及肾纤维化进行检查，由于其组织活检方法的侵入性和相关风险，部分患者会出现出血，疼痛，甚至死亡，导致肾活检不能连续进行。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用，以解决上述背景技术中提出一般的慢性肾病诊断与筛查手段通过肾活检来对肾脏损害程度及肾纤维化进行检查，由于其组织活检方法的侵入性和相关风险，部分患者会出现出血，疼痛，甚至死亡，导致肾活检不能连续进行的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用，其特征在于：所述长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用包括下述工艺步骤：

(1).血浆样品收集

1)采集外周血1ml(ckd病人组与正常人组)，迅速转入edta抗凝管中，通过涡旋或用移液器混匀；

2)然后在1h(室温条件下)或2h(0℃-5℃条件下)内进行下面的操作：800g-900g，0℃-5℃，离心10min-15min；

3)再吸取约0.5ml上清转至洁净的1.5ml离心管中，16000g-16200g，0℃-5℃，离心10min-15min，小心吸取上清到新的离心管中，置于-80℃保存备用。

(2).血浆样品totalrna提取

1)在-80℃冰箱取出血浆样本，冰上融化；

2)取0.2ml-0.3ml样本加入0.75mllsreagent，通过涡旋或用移液器混匀吹打混匀，静置5min-15min；

3)然后加入0.2ml-0.3ml氯仿，充分震荡15s-20s，常温静置5-15min；

4)0℃-5℃，12000xg-12200xg离心15min，移取上清液至新的1.5ml离心管；

5)向新离心管内加入1ulglycogen(10ug/ul)，并通过涡旋或用移液器充分混匀；

6)再加入0.5ml-0.8ml异丙醇，混匀，常温孵育10min-15min；

7)0℃-5℃，12000xg-12200xg离心10min-15min，弃上清液；

8)加入1ml-2ml的75％乙醇，混匀；

9)0℃-5℃，7500xg离心5min-15min，弃上清液；

10)离心管放置在超净台，并将其静置5min-10min，不要等完全晾干，加入depc水20-50ul；

11)将离心管放置在干式加热器上，使得温度加热至55℃-60℃，进行助融操作，且时间为10min-15min，最后，收集管中的液体即为提取的totalrna，置于-80℃保存备用。

(3).lncrnareal-timepcr引物

lncrna名称5’端引物seqid/3’端引物seqid；

gm4419ccacgtgcacatatttgaattg/tgcattccctgcttaatactca；

gas5gacggaggttgagatgaagc/attcggggctctgtagtcct；

b-actinttaatcttgcctggaccagc/tacctcaagccgactctcca。

(4).real-timepcr反应

1)应用appliedbiosystems7900fastreal-timepcrsystem的操作方法，按以下组份配置pcr反应液(反应液配置在冰上进行)：

试剂及其使用量；

2)进行real-timepcr反应两步法；

阶段1：预变性95℃30sec(reps1)

阶段2：pcr反应reps40，95℃5sec，60℃。

3)计算实验结果

由pcr反应曲线获得的ct值(thresholdcyclenumber，阈值循环数)，△ct为同一样本目的与内参基因ct值之差，即△ct＝ct(所选lncrna)-ct(b-actin)，某一样本lncrna的表达水平用2-δct表示，计算ckd病人血浆和正常人血浆中某一lncrna的相对表达量的差异的方法是：将两组中所有血浆样本的某一lncrna表达水平进行比较。

(5).统计

将本项目中病人血浆与正常对照血浆的某一lncrna表达水平比较采用t检验，ckd病人某一lncrna的相对表达水平与ckd临床指标之间的关系采用χ2检验，受试者工作特征曲线(roc)和线下面积auc用于评价每一个候选标志物的诊断价值，最佳标准值是使用youden’sindex(回归系数)判定，每一个lncrna回归系数是由逻辑回归模式得到的，并且作为权重构成了联合诊断预测值p，p<0.05定义为差异具有统计学意义。

(6).临床试验

在临床试验样本中验证了gas5与ckd疾病指标的高度相关性，我们检测了gm4419和gas5、肌酐、尿素氮、胱抑素c和egfr(肾小球滤过率)的血清水平，pearson的相关性分析揭示了升高的血清gas5与较高的血清肌酐，尿素氮，血清胱抑素c和较低的egfr显著正相关。

优选的，所述血浆样品收集时的温度为3℃-4℃下进行，并且离心操作时间为10min-12min。

优选的，所述血浆样品totalrna提取的工作温度为3℃-4℃，且对样本混匀后的静置时间为8min-12min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用，通过发现的lncrnagm4419和gas5可作为慢性肾病病人的特异性诊断标志物，其相对于由wfdc2基因编码的人附睾蛋白4(he4)的特异性高，且体现在其对患有癌症的患者的检测工作中，lncrnagm4419和gas5在患有癌症的患者的血清中不会增加，不受癌症的影响，使得其均具有较好的敏感度和特异度，并且替代传统的通过肾活检来对肾脏损害程度及肾纤维化进行检查，由于其组织活检方法的侵入性和相关风险，部分患者会出现出血，疼痛，甚至死亡，导致肾活检不能连续进行的方法，确保能够解决慢性肾病难以被早期发现、早期诊断、早期治疗，最终导致病情恶化进展发展为终末期肾病产生严重危害的问题。

附图说明

图1是lncrnagm4419和gas5在ckd病人中表达升高示意图。

图2是lncrnagm4419和gas5诊断ckd病人的roc曲线示意图。

图3是gas5与ckd病人临床指标的相关性示意图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用，其特征在于：所述长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用包括下述工艺步骤：

(1).血浆样品收集

1)采集外周血1ml(ckd病人组与正常人组)，迅速转入edta抗凝管中，通过涡旋或用移液器混匀；

2)然后在1h(室温条件下)或2h(0℃-5℃条件下)内进行下面的操作：800g-900g，0℃-5℃，离心10min-15min；

3)再吸取约0.5ml上清转至洁净的1.5ml离心管中，16000g-16200g，0℃-5℃，离心10min-15min，小心吸取上清到新的离心管中，置于-80℃保存备用。

(2).血浆样品totalrna提取

1)在-80℃冰箱取出血浆样本，冰上融化；

2)取0.2ml-0.3ml样本加入0.75mllsreagent，通过涡旋或用移液器混匀吹打混匀，静置5min-15min；

3)然后加入0.2ml-0.3ml氯仿，充分震荡15s-20s，常温静置5-15min；

4)0℃-5℃，12000xg-12200xg离心15min，移取上清液至新的1.5ml离心管；

5)向新离心管内加入1ulglycogen(10ug/ul)，并通过涡旋或用移液器充分混匀；

6)再加入0.5ml-0.8ml异丙醇，混匀，常温孵育10min-15min；

7)0℃-5℃，12000xg-12200xg离心10min-15min，弃上清液；

8)加入1ml-2ml的75％乙醇，混匀；

9)0℃-5℃，7500xg离心5min-15min，弃上清液；

10)离心管放置在超净台，并将其静置5min-10min，不要等完全晾干，加入depc水20-50ul；

11)将离心管放置在干式加热器上，使得温度加热至55℃-60℃，进行助融操作，且时间为10min-15min，最后，收集管中的液体即为提取的totalrna，置于-80℃保存备用。

(3).lncrnareal-timepcr引物

lncrna名称5’端引物seqid/3’端引物seqid；

gm4419ccacgtgcacatatttgaattg/tgcattccctgcttaatactca；

gas5gacggaggttgagatgaagc/attcggggctctgtagtcct；

b-actinttaatcttgcctggaccagc/tacctcaagccgactctcca。

(4).real-timepcr反应

1)应用appliedbiosystems7900fastreal-timepcrsystem的操作方法，按以下组份配置pcr反应液(反应液配置在冰上进行)：

试剂及其使用量；

2)进行real-timepcr反应两步法；

阶段1：预变性95℃30sec(reps1)

阶段2：pcr反应reps40，95℃5sec，60℃。

3)计算实验结果

由pcr反应曲线获得的ct值(thresholdcyclenumber，阈值循环数)，△ct为同一样本目的与内参基因ct值之差，即△ct＝ct(所选lncrna)-ct(b-actin)，某一样本lncrna的表达水平用2-δct表示，计算ckd病人血浆和正常人血浆中某一lncrna的相对表达量的差异的方法是：将两组中所有血浆样本的某一lncrna表达水平进行比较。

(5).统计

将本项目中病人血浆与正常对照血浆的某一lncrna表达水平比较采用t检验，ckd病人某一lncrna的相对表达水平与ckd临床指标之间的关系采用χ2检验，受试者工作特征曲线(roc)和线下面积auc用于评价每一个候选标志物的诊断价值，最佳标准值是使用youden’sindex(回归系数)判定，每一个lncrna回归系数是由逻辑回归模式得到的，并且作为权重构成了联合诊断预测值p，p<0.05定义为差异具有统计学意义。

(6).临床试验

在临床试验样本中验证了gas5与ckd疾病指标的高度相关性，我们检测了gm4419和gas5、肌酐、尿素氮、胱抑素c和egfr(肾小球滤过率)的血清水平，pearson的相关性分析揭示了升高的血清gas5与较高的血清肌酐，尿素氮，血清胱抑素c和较低的egfr显著正相关。

本发明长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用工艺具有以下优点：

1、通过采集外周血1ml(ckd病人组与正常人组)，迅速转入edta抗凝管中，涡旋或用移液器混匀，对ckd病人组与正常人组分别采集的外周血1ml，能够对长链非编码rna在有无慢性肾病的诊断与筛查中的应用进行比对处理，使得长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用工作中更具备科学性；

2、通过对应用appliedbiosystems7900fastreal-timepcrsystem的操作方法，并通过控制pcr反应液内的成分试剂及其使用量，使得该长链非编码rna对慢性肾病的诊断与筛查工艺中的real-timepcr反应速度加快，确保real-timepcr反应流程能够顺利完成；

3、统计通过病人血浆与正常对照血浆的某一lncrna表达水平比较采用t检验，ckd病人某一lncrna的相对表达水平与ckd临床指标之间的关系采用χ2检验，使得该长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用工作通过多种途径来完成统计操作，有效提升长链非编码rna对慢性肾病的诊断与筛查的数据处理速度。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>康贝迪生物科技（苏州）有限公司

<120>长链非编码rna在慢性肾病诊断与筛查中的应用

<130>p2018-0928

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(gm4419)

<400>1

ccacgtgcacatatttgaattg22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(gm4419)

<400>2

tgcattccctgcttaatactca22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(gas5)

<400>3

gacggaggttgagatgaagc20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(gas5)

<400>4

attcggggctctgtagtcct20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(b-actin)

<400>5

ttaatcttgcctggaccagc20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(b-actin)

<400>6

tacctcaagccgactctcca20