本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种角膜缘干细胞稳定性（即在角膜缘干细胞增殖过程中不发生分化、能够维持其干细胞属性）的体外培养方法。
背景技术：
角膜缘干细胞位于角膜缘基底层独特的波浪形结构“vogt栅栏”中，是角膜上皮细胞更新的来源。角膜缘干细胞更新能够保持角膜缘上皮细胞连续性的水平向心及垂直向上运动，从而保证角膜上皮层结构的完整和功能的正常。在这个过程中，一方面，角膜缘干细胞通过对称分裂进行自我更新，即细胞增殖且保持其干细胞属性的方式保证干细胞巢中的干细胞数量处于稳定；另一方面，通过不对称分裂，即增殖和分化的方式，细胞迁移至需要更新的角膜上皮细胞的位置，替代原来的角膜上皮细胞。研究已表明，角膜缘干细胞的增殖压力还能够抑制结膜上皮细胞的长入，并防止角膜缘部的结膜血管入侵。当各种损伤因素导致角膜缘干细胞的缺失或影响其生存微环境而使其自我更新和分化功能严重受损时，引起角膜上皮结构不能重建，结膜上皮及血管翳移行修复角膜表面，导致角膜混浊、视功能下降。因此，通过体外培养获得能够增殖且保持干性的角膜缘干细胞，用于角膜缘缺损/病变的治疗，是临床移植治疗该类疾病的关键环节。
目前角膜缘干细胞的体外培养方法较多：角膜缘干细胞的体外分离一般采用组织块迁出法、酶消化法（酶消化法包括iv型胶原酶联合胰蛋白酶、中性蛋白酶联合胰蛋白酶等）；培养采用的滋养层主要包括小鼠nih3t3细胞滋养层、小鼠胚胎成纤维细胞滋养层等；培养液成分一般包括血清、生长因子、霍乱毒素、胰岛素、3-碘甲状腺原氨酸、氢化可的松等。
现有角膜缘干细胞的体外培养方法虽然也能获得上皮细胞，但都存在一定的局限：在体外分离过程中，采用组织块迁出法得到的细胞很容易混有其它种类的细胞，如成纤维细胞，且成纤维细胞生长速度更快；另外，胰蛋白酶为肽链内切酶，由于血清中含有非特异性抑肽酶，故胰蛋白酶在有血清存在的情况下无法消化正常组织，但若将组织长时间置于无血清的消化液中进行消化，势必会削弱细胞活力；在滋养层的选择方面，nih3t3细胞和胚胎成纤维细胞为外生非人源细胞，容易引起免疫反应及鼠源衍生病原体的传播；在培养液成分的选择上，霍乱毒素是霍乱弧菌产生的毒力因子，会引起严重腹泻以及人体脱水；3-碘甲状腺原氨酸是甲状腺激素的主要活性物质，但高浓度的甲状腺激素能够促进蛋白质分解，引起负氮平衡。显然上述因素均能削弱体外培养的角膜缘干细胞的增殖能力和细胞活性。更重要的是，现有方法获得的角膜缘干细胞保持干性的能力差、细胞容易发生分化，且大多仅能满足一次性移植使用，无法继续对角膜缘干细胞进行稳定培养。
因此急需建立理想的角膜缘干细胞体外分离和培养方法，以实现在保证角膜缘干细胞快速增殖的前提下，能够很好的维持其干细胞属性，以期满足临床治疗。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法，以克服现有技术的不足。
本发明的方法：
首先用无菌0.9%（w/v）生理盐水清洗角膜缘组织（角膜与巩膜之间宽约2mm的区域，来源于捐献角膜移植后废弃的边角料），再将清洗后的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中，于37℃处理10min，而后用无菌pbs平衡盐溶液冲洗3遍，dmem/f12（1:1）培养基漂洗3遍；
然后将角膜缘组织置于500μl组织消化液中，用眼科剪将组织剪切成约0.5~1mm3的小块；
再补加4.5ml组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化2~4h；
而后将消化后的角膜缘组织悬液用200目的细胞筛网过滤，再将滤液于500rpm离心10min，去上清后，用角膜缘干细胞原代培养液重悬组织细胞沉淀，接种于用角膜缘干细胞包被液预处理的细胞培养板中，置于37℃、5%co2培养箱中进行原代培养；
待出现细胞克隆球后，加入组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化20min，然后离心、收集细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板中进行继代培养。
为获得更多稳定的角膜缘干细胞，在上述的继代培养之后又进行了多代扩增培养：即待继代培养的角膜缘干细胞长满后，再利用常规方法对长满的细胞进行消化、离心、收集细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在用角膜缘干细胞包被液的细胞培养板中进行多代扩增培养。
本发明所用庆大霉素溶液是：含有104u/100ml庆大霉素的dmem/f12（1:1）培养基。
上述组织消化液是：2.4~4.8u/ml的dispaseii酶溶解于含有5%胎牛血清的dmem/f12（1:1）培养基。
上述角膜缘干细胞原代培养液的配方：含有5~10%胎牛血清、10~40ng/ml表皮生长因子、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10μg/ml胰岛素、1~10μg/ml转铁蛋白、1~5ng/ml亚硒酸钠、0.2~1μg/ml氢化可的松、5~20ng/ml白血病抑制因子、5~10ng/ml白介素-6和5~10%角膜缘成纤维细胞培养上清液的dmem/f12（1:1）培养基。
上述角膜缘干细胞继代培养液的配方：含有5~10%胎牛血清、10~40ng/ml表皮生长因子、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10μg/ml胰岛素、1~10μg/ml转铁蛋白、1~5ng/ml亚硒酸钠、0.2~1μg/ml氢化可的松、5~20ng/ml白血病抑制因子和5~10ng/ml白介素-6的dmem/f12（1:1）培养基。
上述角膜缘干细胞包被液的配方：含有10~30μg/ml纤连蛋白、5~20μg/ml层粘连蛋白5、1~2mg/ml明胶、1~5mg/ml透明质酸和1~5mg/ml肝素的dmem/f12（1:1）培养基。
上述角膜缘干细胞包被液预处理细胞培养板的方法：吸取角膜缘干细胞包被液加至细胞培养板底，待板底完全润湿后，将多余的角膜缘干细胞包被液吸出，再将细胞培养板放置在超净工作台风干1h。
本发明能够获得数量充足、稳定性好、适合临床应用的角膜缘干细胞。本发明利用角膜缘干细胞包被液预处理细胞培养板，代替了已有技术中通常使用的鼠源细胞作为滋养层带来的致病风险，而且在本发明的培养液中也不需要添加霍乱毒素来促进细胞增殖，因此本发明培养获得的角膜缘干细胞安全性更高，以更好满足临床需要。本发明中涉及的角膜缘干细胞原代/继代培养液和角膜缘干细胞包被液的几种配方，能够很好的促进角膜缘干细胞的分裂与增殖，且能够充分维持干细胞的稳定性，以满足临床急需的现状。此外，本发明的方法是以捐献角膜移植后废弃的边角料为原材料，充分利用了废弃的材料，变废为宝。
具体实施方式
本发明涉及的各种溶液的配制方法：
1、上述庆大霉素溶液的配制方法：取10mldmem/f12培养基，加入10mg庆大霉素（效价1000u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后用dmem/f12培养基定容至100ml；
2、上述组织消化液的配制方法：取10mldmem/f12培养基，加入24~48mgdispaseii酶（酶活10u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml；
3、上述角膜缘干细胞原代培养液的配制方法：取10mldmem/f12培养基，加入1~4μg表皮生长因子、1~2μg碱性成纤维细胞生长因子、0.1~1mg胰岛素、0.1~1mg转铁蛋白、0.1~0.5mg亚硒酸钠、20~100μg氢化可的松、0.5~2μg白血病抑制因子、0.5~1μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5~10ml胎牛血清和5~10ml用0.22μm的针头滤器过滤的角膜缘成纤维细胞培养上清液，最后用dmem/f12培养基定容至100ml；
4、上述角膜缘干细胞继代培养液的配制方法：取10mldmem/f12培养基，加入1~4μg表皮生长因子、1~2μg碱性成纤维细胞生长因子、0.1~1mg胰岛素、0.1~1mg转铁蛋白、0.1~0.5mg亚硒酸钠、20~100μg氢化可的松、0.5~2μg白血病抑制因子、0.5~1μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5~10ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml；
5、上述角膜缘干细胞包被液的配制方法：取10mldmem/f12培养基，加入1~3mg纤连蛋白、0.5~2mg层粘连蛋白5、0.1~0.2g明胶、0.1~0.5g透明质酸和0.1~0.5g肝素，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，最后用dmem/f12培养基定容至100ml；
本发明的具体实施步骤：
1、角膜缘组织的处理：用无菌0.9%（w/v）生理盐水清洗角膜缘组织直至没有杂质，然后将清洗干净的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中，于37℃处理10min，而后用无菌pbs平衡盐溶液冲洗3遍，dmem/f12培养基漂洗3遍；
2、角膜缘组织细胞悬液的制备：将角膜缘组织置于500μl组织消化液中，用眼科剪将组织剪切成大小约0.5~1mm3的小块，再补加4.5ml组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化2~4h，获得角膜缘组织细胞悬液；
3、细胞培养板的预处理：吸取角膜缘干细胞包被液加至细胞培养板底，待板底完全润湿后，将多余的角膜缘干细胞包被液吸出，再将细胞培养板放置在超净工作台风干1h；
4、角膜缘干细胞的原代培养：将消化后的角膜缘组织细胞悬液用200目的细胞筛网过滤，然后将滤液于500rpm离心10min，去上清后，用角膜缘干细胞原代培养液重悬组织细胞沉淀，接种于用角膜缘干细胞包被液预处理的细胞培养板中，置于37℃、5%co2培养箱中进行原代培养；
5、角膜缘干细胞的继代培养：待出现细胞克隆球后，加入组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化20min，然后离心、收集细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板中进行继代培养。待细胞长满后再利用常规方法对长满的细胞进行消化、离心、收集细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板中进行扩增培养。
实施例1
先用无菌0.9%（w/v）生理盐水清洗角膜缘组织直至没有杂质，再取10mldmem/f12培养基，加入10mg庆大霉素（效价1000u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成庆大霉素溶液。然后将清洗干净后的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中，于37℃处理10min，而后用无菌pbs平衡盐溶液冲洗3遍，dmem/f12培养基漂洗3遍；
之后取10mldmem/f12培养基，加入24mgdispaseii酶（酶活10u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成组织消化液。将角膜缘组织置于500μl组织消化液中，用眼科剪将组织剪切成大小约1mm3的小块，再补加4.5ml组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化4h，获得角膜缘组织细胞悬液；
再取10mldmem/f12培养基，加入1mg纤连蛋白、0.5mg层粘连蛋白5、0.1g明胶、0.1g透明质酸和0.1g肝素，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞包被液。之后吸取角膜缘干细胞包被液加至细胞培养板底，待板底完全润湿后，将多余的角膜缘干细胞包被液吸出，再将细胞培养板放置在超净工作台风干1h，制备成预处理的细胞培养板备用；
将消化后的角膜缘组织细胞悬液用200目的细胞筛网过滤，然后将滤液于500rpm离心10min，去上清后，取10mldmem/f12培养基，加入1μg表皮生长因子、1μg碱性成纤维细胞生长因子、0.5mg胰岛素、0.1mg转铁蛋白、0.1mg亚硒酸钠、20μg氢化可的松、0.5μg白血病抑制因子、0.5μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入10ml胎牛血清和10ml用0.22μm的针头滤器过滤的角膜缘成纤维细胞培养上清液，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞原代培养液。而后用角膜缘干细胞原代培养液重悬组织细胞沉淀，接种于上述预处理的细胞培养板中，置于37℃、5%co2培养箱中进行原代培养；
待出现细胞克隆球后，加入组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化20min，再离心、收集细胞沉淀。之后取10mldmem/f12培养基，加入1μg表皮生长因子、1μg碱性成纤维细胞生长因子、0.5mg胰岛素、0.1mg转铁蛋白、0.1mg亚硒酸钠、20μg氢化可的松、0.5μg白血病抑制因子、0.5μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入10ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞继代培养液。再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板中进行继代培养。
实施例2
先用无菌0.9%（w/v）生理盐水清洗角膜缘组织直至没有杂质，再取10mldmem/f12培养基，加入10mg庆大霉素（效价1000u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成庆大霉素溶液。然后将清洗干净后的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中，于37℃处理10min，而后用无菌pbs平衡盐溶液冲洗3遍，dmem/f12培养基漂洗3遍；
之后取10mldmem/f12培养基，加入48mgdispaseii酶（酶活10u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成组织消化液。将角膜缘组织置于500μl组织消化液中，用眼科剪将组织剪切成大小约0.5mm3的小块，再补加4.5ml组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化2h，获得角膜缘组织细胞悬液；
再取10mldmem/f12培养基，加入2mg纤连蛋白、2mg层粘连蛋白5、0.15g明胶、0.3g透明质酸和0.3g肝素，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞包被液。之后吸取角膜缘干细胞包被液加至细胞培养板底，待板底完全润湿后，将多余的角膜缘干细胞包被液吸出，再将细胞培养板放置在超净工作台风干1h，制备成预处理的细胞培养板备用；
将消化后的角膜缘组织细胞悬液用200目的细胞筛网过滤，然后将滤液于500rpm离心10min，去上清后，取10mldmem/f12培养基，加入2.5μg表皮生长因子、1.5μg碱性成纤维细胞生长因子、0.2mg胰岛素、0.5mg转铁蛋白、0.2mg亚硒酸钠、50μg氢化可的松、1μg白血病抑制因子、0.75μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入7.5ml胎牛血清和7.5ml用0.22μm的针头滤器过滤的角膜缘成纤维细胞培养上清液，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞原代培养液。而后用角膜缘干细胞原代培养液重悬组织细胞沉淀，接种于上述预处理的细胞培养板中，置于37℃、5%co2培养箱中进行原代培养；
待出现细胞克隆球后，加入组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化20min，再离心、收集细胞沉淀。之后取10mldmem/f12培养基，加入2.5μg表皮生长因子、1.5μg碱性成纤维细胞生长因子、0.2mg胰岛素、0.5mg转铁蛋白、0.2mg亚硒酸钠、50μg氢化可的松、1μg白血病抑制因子、0.75μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入7.5ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞继代培养液。再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板中进行继代培养；
待细胞长满后再利用常规方法对长满的细胞进行消化、离心、收集细胞沉淀，而后用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板中进行扩增培养。
实施例3
先用无菌0.9%（w/v）生理盐水清洗角膜缘组织直至没有杂质，再取10mldmem/f12培养基，加入10mg庆大霉素（效价1000u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成庆大霉素溶液。然后将清洗干净后的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中，于37℃处理10min，而后用无菌pbs平衡盐溶液冲洗3遍，dmem/f12培养基漂洗3遍；
之后取10mldmem/f12培养基，加入36mgdispaseii酶（酶活10u/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成组织消化液。将角膜缘组织置于500μl组织消化液中，用眼科剪将组织剪切成大小约1mm3的小块，再补加4.5ml组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化3h，获得角膜缘组织细胞悬液；
再取10mldmem/f12培养基，加入3mg纤连蛋白、2mg层粘连蛋白5、0.2g明胶、0.5g透明质酸和0.5g肝素，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞包被液。之后吸取角膜缘干细胞包被液加至细胞培养板底，待板底完全润湿后，将多余的角膜缘干细胞包被液吸出，再将细胞培养板放置在超净工作台风干1h，制备成预处理的细胞培养板备用；
将消化后的角膜缘组织细胞悬液用200目的细胞筛网过滤，然后将滤液于500rpm离心10min，去上清后，取10mldmem/f12培养基，加入4μg表皮生长因子、2μg碱性成纤维细胞生长因子、0.1mg胰岛素、1mg转铁蛋白、0.5mg亚硒酸钠、100μg氢化可的松、2μg白血病抑制因子、1μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5ml胎牛血清和5ml用0.22μm的针头滤器过滤的角膜缘成纤维细胞培养上清液，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞原代培养液。而后用角膜缘干细胞原代培养液重悬组织细胞沉淀，接种于上述预处理的细胞培养板中，置于37℃、5%co2培养箱中进行原代培养；
待出现细胞克隆球后，加入组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化20min，再离心、收集细胞沉淀。之后取10mldmem/f12培养基，加入4μg表皮生长因子、2μg碱性成纤维细胞生长因子、0.1mg胰岛素、1mg转铁蛋白、0.5mg亚硒酸钠、100μg氢化可的松、2μg白血病抑制因子、1μg白介素-6，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5ml胎牛血清，最后用dmem/f12培养基定容至100ml，配制成角膜缘干细胞继代培养液。再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板中进行继代培养。
显然，通过以上3个实施例，本发明的体外培养方法获得的角膜缘干细胞数量充足、稳定性好、完好的满足了临床应用的角膜缘干细胞。