一种血液添加剂的制作方法

本发明涉及一种血液添加剂。

背景技术：

2015年，液体活检技术被评选为年度十大突破技术之一，血液中因含有肿瘤来源的游离核酸而成为液体活检技术最重要的研究对象。有效实现基于血液的液体活检依赖于两个关键因素，一是需要足够灵敏的检测技术，因为血浆游离dna(cell-freedna，cfdna)中，循环肿瘤dna(circulatingtumordna)所占比例很低，随着检测技术的发展，目前ctdna检测灵敏度已可达0.2％。第二，由于在现实世界中，血液采集后无法在第一时间分离血浆并进行ctdna的提取和检测，因此，血液的有效保存也至关重要。然而，由于血液中含有丰富的核酸酶，极易降解ctdna，同时血液中含有的大量白细胞在保存或运输过程中容易发生破裂，由此释放出的基因组dna(gdna)将进一步稀释原本已十分稀少的ctdna，对检测构成严峻的挑战。此外，血液在保存或运输过程中，红细胞也容易破裂发生溶血，释放出的各种物质(如血红蛋白)也会干扰后续ctdna的检测。

目前，对血液游离核酸的保护策略和方法有很多，但遗憾的是这些保护要么只是保护游离核酸，要么只是保护白细胞不破裂，要么保护剂中含有对人体或环境有害的成分，总之，现阶段尚缺乏一种能全面、系统的保护游离核酸、减少gdna释放的方法。

申请号为201410534999.8的专利公开了一种稳定血液样品细胞的试剂，能防止血小板聚集并稳定血细胞至少36小时，但该专利并未涉及游离核酸保护的信息。

申请号为201611214323.6的专利公开了一种保护和稳定游离dna的采血管，其保护剂组分中包含咪唑烷基脲，申请号为201610778832.5的专利公开了一种孕妇外周血中胎儿游离dna的保存剂及其构成的真空采血管，保存剂中含有重氮咪唑烷基脲和/或甲醛，申请号为201510132774.4的专利公开了一种用于保护游离dna的血液抗凝剂，该抗凝剂含有甲醛释放剂，包括1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因，羟甲基甘氨酸钠，尼泊金甲酯钠，尼泊金乙酯钠或尼泊金丙酯钠中的至少一种，申请号为201510088419.1的专利公开了一种可以在常温条件下采集和保存血样的循环游离dna真空采集管，其中的添加剂含有防腐剂，包括2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇、双咪唑烷基脲、季铵盐、酒精、羟甲基甘氨酸钠、乙内酰脲、甲醛及其衍生物、咪唑烷基脲、二羟甲基脲、恶唑烷或甲醇的一种或几种，申请公开号为us2014/0080112a1的专利公开了一种采血管，其添加剂含有防腐剂，选自咪唑烷基脲和双咪唑烷基脲。

以上专利用于解决游离核酸保护的策略和方法之一均是采用甲醛或甲醛释放剂，虽可起到一定的保护游离核酸和稳定细胞的作用，但会导致核酸、蛋白等物质交联，严重影响下游核酸的提取和检测。

申请号为201710380209.9的专利采用天然防腐剂(ε-聚赖氨酸、茶多酚、纳他霉素中的一种)代替化学防腐剂，解决了毒性的问题，但另一方面，多个研究(chenxlandyinsm,chinjpathophysiol,2004；taylorkaetal.,jplatlets,2017)表明cl-离子可引起血小板活化和聚集。而该专利仍沿用含有cl-离子的缓冲系统，不利于血小板的稳定，推测进一步可能不利于红细胞的稳定。其他使用cl-离子缓冲系统的专利还包括申请号或授权号为201510062267.8、201610778832.5、201510132774.4、201580042850.0和us9376709等。

此外，现阶段为了实现血液的运输，多采用4℃低温保存和运输，然而，该方案具有明显的不足之处，首先即便是在4℃低温下，核酸酶仍具有活性，会导致游离核酸的降解，其次，4℃运输增加了成本负担，最后也是最主要的不足之处是低温条件也容易激活血小板，刺激溶血。

由此可见，现有技术中还存在明显的不足。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的血液添加剂，可供血液常温保存和运输，以用于后续检测。本发明的血液添加剂，既可有效防止血浆游离核酸降解，又可有效稳定白细胞，减少gdna/grna释放，还可保护红细胞，有效降低溶血的血液添加剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种血液添加剂，每100毫升该添加剂包括以下组分

抗凝剂6.0-8.8g(乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠、枸橼酸钠中的一种或几种)。抗凝剂可防止凝血，同时也可抑制dna酶和rna酶。抗凝剂优选乙二胺四乙酸二钾。

核酸酶抑制剂2.0-8.4g(bapta-am、tris(2-羧乙基)-膦-盐酸盐、氧钒核糖核苷复合物、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、焦炭酸二乙酯、硫酸铵、尿素中的一种或几种)。核酸酶抑制剂可抑制和dna酶rna酶，避免血浆中游离dna和rna的降解。核酸酶抑制剂优选尿素；

细胞稳定剂4-20g(聚乙二醇、聚乙烯醇、侧金盏糖醇、松三糖、吐温-80、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽中的一种或几种)。优选聚乙烯醇1788(聚合度1700，醇解度88％)，聚乙烯醇可作为基质将血液细胞包裹，稳定细胞形态。

嘌呤0-0.31g，为腺嘌呤、鸟嘌呤的一种或两种，嘌呤的添加，可维持红细胞形态，不易于变形和破裂。优选为0.11-0.31g。优选腺嘌呤。

代谢抑制剂2-10g(甘油醛-3-磷酸、1,3-二磷酸甘油酸、甘油醛、氟化钠、磷酸烯醇式丙酮酸中的一种或几种)。代谢抑制剂可抑制细胞代谢，减少细胞代谢过程中基因组核酸的释放。优选甘油醛；

凋亡抑制剂0.021-0.21g(q-vd-oph、z-vad-fmk中的一种或两种)，可抑制细胞凋亡，防止基因组核酸的释放。q-vd-oph和z-vad-fmk可商业购买得到，例如，购买自西格玛奥德里奇公司。优选q-vd-oph。

核酸保护剂0.1-1g(甜菜碱、海藻糖、甘氨酸、精氨酸、精胺、亚精胺)，可保护核酸，尤其是rna，防止核酸的降解。优选甘氨酸、精胺；

非cl-缓冲液90-110mm，ph7.3-7.5(柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、mops缓冲液中的一种)，可避免激活血小板，同时防止溶血。优选mops缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选100mm，ph7.4。

本发明血液添加剂在使用时，与血液样本的体积比为1:30-40，优选为1:35。

本发明还提供一种新颖的血液添加剂保护效果评价方案，包括如下步骤：

首先，对拥有某个特定基因突变的肿瘤细胞系(如拥有egfrt790m突变的h1975细胞系或拥有alk融合突变的h3122细胞系)进行常规细胞培养2-3天后，吸取培养液上清，离心，(优选500g离心10min)，转移上清至新的离心管中；

其次，使用含待评估血液添加剂的采血管和对照edta采血管分别采集健康志愿者的外周血，加入同等体积的上述培养液上清，之后进行常温运输测试和常温保存测试；

再次，分别提取游离核酸，使用qpcr方法检测，以评价添加剂的效果。在本发明方法中，通过向健康人血液中引入突变基因，突变ct值的变化主要用于指示核酸降解，而内控ct值变化用于指示核酸降解和白细胞破裂，两者结合即可区分这两种效应，从而精准评估添加剂的保护效果。

所采用pcr检测体系的检测限为1％，因此，在不低于检测限时，突变ct的变化主要指示核酸降解，核酸降解会导致突变ct值升高，降解幅度为(2^夹变δct-1)×100％。

内控ct值变化用于指示核酸降解和白细胞破裂，核酸降解导致ct值升高，白细胞破裂导致ct值降低，白细胞破裂程度为{2(^夹变δct+^内控δct)-1}×100％。

有益效果

1、有文献报道cl-离子可激活血小板导致血小板聚集，本发明根据血小板与红细胞之间的关系，创造性地把cl-离子与红细胞破裂(溶血)联系起来，因此对比测试了含cl-离子和不含cl-离子的缓冲溶液系统，取得了意想不到的效果，结果表明，不含cl-离子的缓冲溶液系统抗溶血能力强(图1)。

2、常温运输4天，本发明可以更好的稳定红细胞，具有更强的抗溶血能力(图2)

3、常温保存14天(保存过程中，每天将采血管缓慢上下颠倒10次，然后取2ml用于核酸提取和pcr检测)，本发明具有更强的抗溶血能力(图3)

4、常温运输4天，本发明可更有效保护游离核酸(dna和rna)和血液白细胞

5、本发明可常温保存血液14天，不影响检测。

6、背景技术中提及的对比文件，对添加剂效果的评估，绝大多数是通过比较某个基因或管家基因在两个时间节点(如0天和t天)的ct值变化来进行，然而，影响ct值变化的两个因素——游离核酸降解导致ct值变大，gdna释放导致ct值变小——作用相反，因此，仅检测该基因ct值变化并不能很好的区分这两个因素，也不能准确的评估添加剂的真实效果。偶有通过向血液中掺入提取好的细胞系dna来进行评估，然而，提取的dna是完全裸露的(提取过程中蛋白已被消化)，并不能反映真实的血液游离dna的状态，因此也不能准确评估添加剂效果。本发明提出的一种可系统评价添加剂效果的评估方案，既可评估游离dna或游离rna的降解程度，也可评估白细胞破裂程度和gdna/grna释放程度。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1不同缓冲系统抗溶血能力；

图2常温运输4天后抗溶血对比。

图3常温保存过程中(0、4、7、14天)抗溶血对比。

图4常温保存过程中(0、4、7、14天)ct值变化图。

具体实施方式

以下实施例中的各组分，如无特别说明，均为商业购买得到。

本发明血液添加剂保护效果评价，包括如下步骤：

首先，对拥有某个特定基因突变的肿瘤细胞系(如拥有egfrt790m突变的h1975细胞系或拥有alk融合突变的h3122细胞系)进行常规细胞培养2-3天后，吸取培养液上清，离心，(优选500g离心10min)，转移上清至新的离心管中(此时的培养液上清仅含目标细胞分泌出的游离核酸，不含细胞)；

其次，使用含待评估血液添加剂的采血管和对照edta采血管分别采集健康志愿者的外周血，加入同等体积的上述培养液上清，之后进行常温运输测试和常温保存测试；

再次，分别提取游离核酸，使用qpcr方法(本发明使用的qpcr试剂是厦门艾德生物医药科技股份有限公司生产的“人类egfr突变基因检测试剂盒(荧光pcr法)”和“人类eml4-alk融合基因检测试剂盒(荧光pcr法)”)检测，以评价添加剂的效果。在本发明方法中，通过向健康人血液中引入突变基因，突变ct值的变化主要用于指示核酸降解，而内控ct值变化用于指示核酸降解和白细胞破裂，两者结合即可区分这两种效应，从而精准评估添加剂的保护效果。

所采用pcr检测体系的检测限为1％，因此，在不低于检测限时，突变ct的变化主要指示核酸降解，核酸降解会导致突变ct值升高，降解幅度为(2^夹变δct-1)×100％。

内控ct值变化用于指示核酸降解和白细胞破裂，核酸降解导致ct值升高，白细胞破裂导致ct值降低，白细胞破裂程度为{2^{(夹变δct+内控δct)}-1}×100％。

应注意的是，在计算游离核酸降解幅度和白细胞破裂程度的时候，考虑到所采用pcr检测体系的cv值(pcr固有的波动误差)在5％以内，因此，一般认为，ct值变化不超过0.5可视为ct值没有变化，超过0.5才有实际指示意义。

实施例1

本实施例提供的血液添加剂，每100ml包括如下组分(配方1)：

本实施例提供如下含cl-添加剂，作为对照，每100ml包括如下组分：

根据上述配方，分别称量对应试剂，溶解于100mm磷酸盐缓冲液配成100ml本发明配方1添加剂，每支采血管含该添加剂285.7μl，以同样的方法配制含cl-采血管，同时与普通edta采血管进行对比试验。具体步骤如下：

1、用edta采血管、含配方1添加剂的采血管及含cl-添加剂的采血管分别进行血液采集，每支管采血量为10ml，采血后立即缓慢上下颠倒采血管10次，使血液与添加剂充分混匀；

2、在常温条件下放置保存，每日观察采血管溶血情况后将血液轻柔颠倒混匀10次，模拟运输环境，放置5天后，将采血管进行2000g离心10分钟以分离血浆，观察、比较每种采血管溶血情况。

实验结果显示(图1)，常温保存5天后，含cl-添加剂的采血管发生严重溶血，血浆呈深红色，edta采血管发生中等程度溶血，血浆呈浅红色，含本发明添加剂的采血管不溶血，血浆仍呈淡黄色，可见使用本发明添加剂可有效防止溶血，而含cl-添加剂反而溶血最严重。

实施例2：

本实施例提供的血液添加剂，每100ml包括如下组分(配方2)：

根据上述配方配制添加剂，同时与普通edta采血管进行对比试验。具体步骤如下：

1、用edta采血管、含实施例1配方1添加剂的采血管及含实施例2配方2添加剂的采血管分别进行血液采集，每支管采血量为10ml，采血后立即缓慢上下颠倒采血管10次，使血液与添加剂充分混匀；

2、在常温条件下运输4天后，将采血管进行2000g离心10分钟以分离血浆，观察、比较每种采血管溶血情况。

实验结果显示(图2)，常温运输5天后，edta采血管发生明显溶血，而含本发明配方1或配方2添加剂的采血管均未发生明显溶血，可见使用本发明添加剂可有效稳定红细胞，防止血液在运输过程发生溶血。

实施例3：

使用实施例1血液添加剂(配方1)，以普通edta采血管作为对照，进行常温运输实验，具体步骤如下：

1、肿瘤细胞系h1975(egfrt790m突变阳性细胞系)，使用rmpi1640培养基(含10％胎牛血清)，37℃5％co2培养3天后，转移培养液上清至干净的离心管中；

2、2000g离心10min，转移培养液上清值新的干净的离心管中；

3、使用含本发明添加剂的采血管和普通edta采血管，分别采集3名志愿者外周血，每管采集10ml，立即缓慢上下颠倒采血管10次；

4、取步骤2培养液上清，涡旋混匀后，分别取50μl加入步骤3的每管10ml血液中，缓慢颠倒10次混匀；

5、从每支采血管中各取3ml血液至干净的离心管中，作为t0样本，每支采血管剩余的血液进行常温运输4天，同样再各取3ml血液至干净的离心管中，作为t4样本；

6、t0和t4样本血浆的分离：将血液样本放入离心机中，2000g离心10min，小心吸取上清至新离心管中，再10000g离心10min，小心吸取1ml上清至新离心管中，从而获得血浆；

7、提取血浆游离dna，提取试剂盒选用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的核酸提取试剂(型号：循环dna)；

8、pcr检测：使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的人类egfr突变基因检测试剂盒(荧光pcr法)对提取的血浆游离dna进行pcr检测，因h1975细胞系具有egfr基因20号外显子t790m突变，因此检测t790m突变。

实验结果：入组了3名志愿者，每名志愿者使用3种采血管采集外周血，每种采血管分别在0天和运输4天分离血浆并提取游离dna，一共18个dna样本进行pcr检测，pcr结果以ct值呈现，每个样本均有2个ct值：t790m突变ct值和内控ct值，其中，在检测限内，t790m突变ct值变化与游离dna降解相关，降解会导致ct值升高，升高越多表示降解越严重；内控ct值变化与游离dna降解和白细胞破裂(gdna释放)相关，但前者导致ct值升高，升高越多表示降解越严重，后者导致ct值变小，变小越多表示白细胞破裂越严重。根据不同采血管ct值的变化，可比较采血管对游离dna和血细胞的保护效果。检测结果如表1所示。

从表1可以看出，常温运输4天后，本发明t790m突变ct值平均升高了0.26，,内控ct值平均变小了0.17，而对照edta采血管t790m突变ct值升高了0.75，内控ct值变小了4.97，说明本发明可更有效保护游离dna，减少其降解，也可有效保护白细胞，减少其破裂导致的gdna的释放；而edta采血管对白细胞保护效果很差，在运输过程中破裂严重，gdna大量释放，同时游离dna也有一定程度的降解。

表1常温运输4天ct值变化情况

实施例4：

使用实施例1血液添加剂(配方1)，以普通edta采血管作为对照，进行常温运输实验，具体步骤如下：

1、肿瘤细胞系h3122(alk融合阳性细胞系)，使用rmpi1640培养基(含10％胎牛血清)，37℃5％co2培养3天后，转移培养液上清至干净的离心管中；

2、2000g离心10min，转移培养液上清值新的干净的离心管中；

3、使用含本发明添加剂的采血管和普通edta采血管，分别采集3名志愿者外周血，每管采集10ml，立即缓慢上下颠倒采血管10次；

4、取步骤2培养液上清，涡旋混匀后，分别取500μl加入步骤3的每管10ml血液中，缓慢颠倒10次混匀；

5、从每支采血管中各取3ml血液至干净的离心管中，作为t0样本，每支采血管剩余的血液进行常温运输4天，同样再各取3ml血液至干净的离心管中，作为t4样本；

6、t0和t4样本血浆的分离：将血液样本放入离心机中，2000g离心10min，小心吸取上清至新离心管中，再10000g离心10min，小心吸取1ml上清至新离心管中，从而获得血浆；

7、提取血浆游离rna，提取试剂盒选用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的核酸提取试剂(型号：循环dna)，该试剂盒提取的是总核酸，包括dna和rna；

8、rt-pcr检测：使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的人类eml4-alk融合基因检测试剂盒(荧光pcr法)对提取的血浆游离rna进行rt-pcr检测。

实验结果：入组了3名志愿者，每名志愿者使用3种采血管采集外周血，每种采血管分别在0天和运输4天分离血浆并提取游离rna，一共18个游离rna样本进行rt-pcr检测，结果以ct值呈现，alk的ct值变化与rna降解程度相关，ct值升高越多表示降解越严重，noct是指在pcr设定扩增循环数(36)结束时仍未有信号升起，也就是说ct>36。根据不同采血管ct值的变化，可比较采血管对游离rna的保护效果。检测结果如表2所示。

表2常温运输4天ct值变化情况

从表2可以看出，血液常温运输4天后，与0天相比，本发明alkct值变化较小，而对照edta采血管变化显著(运输4天后均无ct值)，说明本发明可更有效的保护游离rna，减少其降解。

实施例5：

使用实施例2血液添加剂(配方2)，以普通edta采血管作为对照，进行常温静置保存实验，具体步骤如下：

1、肿瘤细胞系h1975(egfrt790m突变阳性细胞系)，使用rmpi1640培养基(含10％胎牛血清)，37℃5％co2培养3天后，转移培养液上清至干净的离心管中；

2、2000g离心10min，转移培养液上清值新的干净的离心管中；

3、使用含本发明添加剂的采血管，分别采集3名志愿者的外周血，每名采集2管，每管采集10ml，立即缓慢上下颠倒采血管10次；上述3名志愿者，用同样的方法采血到edta采血管中；

4、取步骤2培养液上清，涡旋混匀后，分别取100μl加入步骤3的20ml血液中(同一名志愿者同一种采血管的两管血液合并)，缓慢颠倒10次混匀，然后分装到4个离心管中，每管5ml，室温静置保存；

5、在0天(4个小时内)、4天、7天、14天4个时间节点分别取1管分离血浆，观察溶血情况，提取血浆游离dna，最后进行pcr检测，步骤与实施例3相同。

实验结果：溶血情况如图3所示，pcr检测结果如表3和图4所示。

表3常温保存14天ct值变化情况

从表3和图4可以看出，常温静置保存14天，本发明可更好的保护游离dna(t790mct值平均升高了0.38，而edta采血管升高了1.26)和保护白细胞，减少gdna释放(内控ct值平均变小了0.40，而edta采血管变小了5.44)。因此，本发明在常温保存条件下可保护血液达14天，而edta采血管则不能。