一种哺乳动物卵母细胞去核的方法与流程

本发明属于胚胎工程
技术领域：
，具体涉及一种哺乳动物卵母细胞去核的方法。
背景技术：
：哺乳动物的体细胞核移植，即体细胞克隆是近代生物技术和生命科学领域的一项具有划时代意义的重大突破，该技术在家畜的遗传改良、生物反应器的制备、疾病动物模型、器官异种移植等领域都具有广阔的应用前景。在动物的细胞核移植操作中，第一步就是将卵母细胞内核物质的去除，去核是否完全是核移植成功的关键环节之一，去核不完全将导致其与供体核融合后产生的重构胚染色体套数异常，最终胚胎因发育受阻而流产或死亡。目前哺乳动物体细胞核移植中普遍使用的去核方法是物理的机械去核法，即用显微操作的方法将经过特殊加工的毛细玻璃管插入到mii期的卵母细胞内，吸除核物质，得到去核卵。常用的机械去核方法主要有以下几种：1.盲吸法：将卵母细胞固定在持卵针上，极体就会位于时钟4点的位置，去核针插入透明带内，吸去极体及其下部的1/5-1/4的胞质。用这一方法去核，因为没有确切的看到核物质，必然会有一部分卵的核没有去掉或没有完全去掉，因为第一极体在卵周隙中是可以自由游动的，而且随着极体排出时间的延长，其与染色体的相对位置会发生很大变化，因而以第一极体作参照，估计染色体的位置来去核，准确性不高。2.hochest33342染色法：hochest33342是一种dna活性荧光染料，可与dna特异结合，经紫外光激发后发蓝色荧光，因此卵母细胞经hochest33342染色后在紫外光显微镜下可被准确去核。但是紫外光照射卵母细胞如果超过15秒，就会对卵胞质产生损伤，特别是对线粒体地伤害尤为严重，从而影响重构胚的后期发育。3.spindle-view系统去核法：偏振光显微镜(spindle-view)是采用电子光学硬件和计算机数据处理程序，利用有序高分子对偏振光的折射现象来观察细胞内的高分子结构。卵母细胞内减数分裂纺锤体是高分子物质如微丝微管、肌动蛋白细丝环等物质有序排列而成。这些物质均可以使偏振光发生折射，因此偏振光通过卵母细胞减数分裂纺锤体时发生折射，这种折射可以被检偏器捕捉，并通过偏振光显微镜观察。与牛、羊等家畜和小鼠、家兔等实验动物的卵子细胞质较为清亮，纺锤体易于观察相比，由于猪的卵母细胞中颗粒性物质(如脂肪微滴等阻光物质)较多，对纺锤体观察影响较大。该装置价值昂贵，应用范围有限，不利于大量推广。目前，中国文献数据库2006年公开《卵母细胞去核及卵丘细胞移核方法对猪体细胞核移植的影响》，其中1.4.3节公开了：盲吸法和活性荧光染色法联合去核法，将体外成熟的卵母细胞在含hoechst33342(5μg/ml)和细胞松弛素b(5μg/ml)的显微操作液中染色处理10-15min，先通过盲吸法去核，然后将此去核针移入另外一个远离卵母细胞含有荧光染料的液滴中用紫外光照射，若发现针内含有大量的蓝色荧光物质，则认为去核操作成功；若未发现或只发现少量的蓝色荧光，则认为未能去核或去核不完全，应借助紫外光照射对原卵母细胞重新定位去核，该方法的盲吸和荧光检测是分布进行的。该方法存在的缺点为先盲吸后荧光染色检测去核效率，无法改变盲吸法去核对胞质的过多吸取，胞质的过多损耗会影响胚胎的发育潜力，该方法每操作一个卵母细胞都要移到别的液滴进行荧光染色检测，而且还有去核不干净的需要重新定位去核，造成了操作时间的延长，不利于规模化操作。技术实现要素：鉴于此，有必要针对上述问题提供一种卵母细胞去核的改进方法，操作简便，极大地减少了胞质的损失量，确保了每个构建的克隆胚胎既损失很少的胞质又都是100％去核干净，提高了胚胎的发育潜力。本发明是通过以下技术方案实现的：一种哺乳动物卵母细胞去核的方法，包括以下步骤：(1)获取卵丘卵母细胞复合体；(2)去除(1)中卵丘卵母细胞复合体中卵母细胞透明带外围的卵丘颗粒细胞，剩下卵母细胞；(3)将(2)所得的卵母细胞孵育显核，使卵母细胞表面形成微小的突起；(4)将(3)中显核后的卵母细胞置于培养液中处理；(5)调试荧光灯；(6)将(4)中培养液处理后的卵母细胞用清洗操作液(0.76965gnacl、0.0168gnahco3、0.0356gkc1、0.0162gkh2po4、0.0293gmgso4.7h2o、0.1gglucose、0.0146gglutamine、0.15012gtaurine、0.2383ghepes、0.4gbsa、0.0065gpenicilling、0.005gstreptomycin，milli-qh2o溶解定容至100ml)清洗后转入去核液(清洗操作液的基础上添加终浓度6μg/ml的细胞松弛素b(cb))滴内；(7)荧光灯下去核。进一步的，所述步骤(1)中获取的卵丘卵母细胞复合体，在38.5℃、5％co2、饱和湿度的条件下体外成熟培养42-44h。进一步的，步骤(3)中孵育显核处理为：将卵母细胞置于0.3-0.6μg/ml的脱羰秋水仙碱(deme)培养液中孵育显核0.5-2h，或者置于浓度为2.5-10％的蔗糖溶液中处理3-15min，使卵母细胞表面形成微小的突起。进一步的，步骤(3)中孵育显核处理优选含第一极体的mⅱ期卵母细胞。进一步的，步骤(4)中的培养液为含有5-7.5μg/ml的hochest33342，处理时间为2-10min。进一步的，所述步骤(5)中荧光灯调试操作为：把荧光灯的照射范围调试到最小，把倒置显微镜光源调暗至肉眼可见卵母细胞，然后把荧光灯照射强度调试到白光可见荧光圈。进一步的，所述步骤(6)具体为：将步骤(4)处理后的卵母细胞用清洗操作液洗5遍后转入覆盖石蜡油的30-40μl含有5-6.5μg/mlcb的去核操作液滴内，使细胞骨架松弛、细胞结构变得松散，增加细胞柔韧性，抑制极体的形成和染色体排出，保证核移植胚胎的染色体倍数,同时卵胞膜可以借助磷脂双层的游动性而很快得到修复。进一步的，所述步骤(7)的去核操作具体为：把操作盘放在脚踩控制荧光灯遮挡板的倒置显微镜下；先用固定针固定住卵母细胞，然后用去核针拨动卵母细胞使极体位于时钟4点的位置，去核针3钟点位置插入透明带内(操作时，去核针针头的角度是45度朝下，从3点钟的位置插入正好针口对着4点钟位置的极体)，吸去极体及卵母细胞表面微小的突起的部分胞质，同时脚踩荧光遮挡板控制器，荧光照射在去核针前端，当去核针中看到发蓝色荧光的核质时立即停止吸核动作，同时松开脚踩控制器关闭荧光镜头，拔出去核针，去核完成。进一步的，所述脚踩控制荧光灯遮挡板的倒置显微镜，包括显微镜本体、遮光控制系统和光源发射器；所述遮光控制系统包括遮光装置和脚踏开关；所述遮光装置位于显微镜主体和光源发射器之间；所述遮光装置通过螺纹分别与显微镜主体和光源发射器连接；所述脚踏开关与遮光装电点连接。进一步的，所述荧光显微镜的遮光装置包括遮光挡片导向盖、遮光挡片导向齿轮、至少一个遮光挡片、驱动输出齿轮和电动机；所述遮光挡片的顶面设有一上导向凸体，所述遮光挡片的底面设有一下导向凸体；所述遮光挡片导向盖的底面开设有与上导向凸体数量相等且一一对应地被上导向凸体嵌入的第一导向槽，所述遮光挡片导向盖开设有中心透光口；所述遮光挡片导向齿轮设有第一透光通孔；所述遮光挡片导向齿轮的顶面开设有与下导向凸体数量相等且一一对应地被下导向凸体嵌入的第二导向槽；所述遮光挡片导向齿轮与驱动输出齿轮进行齿轮啮合；所述驱动输出齿轮安装于电动机的电机轴上。进一步地，所述第一透光通孔的中心与中心透光口的中心纵向同心。进一步地，所述遮光挡片的数量为六个；各个第二导向槽首尾相连组成六边形槽。进一步地，所述遮光挡片导向盖为圆柱形盖体。进一步地，该遮光装置还包括安装壳体；所述遮光挡片导向盖、遮光挡片导向齿轮、驱动输出齿轮和电动机均安装于所述安装壳体内；所述安装壳体开设有第二透光通孔；该第二透光通孔从所述安装壳体的顶面贯穿至所述安装壳体的底面。进一步地，该遮光装置还包括显微镜连接器；所述显微镜连接器的一侧部安装于安装壳体的一侧，所述显微镜连接器的另一侧部安装于荧光显微镜上。进一步地，所述显微镜连接器包括至少两个依次螺纹旋接安装的双向螺纹环；所述双向螺纹环的一侧部设有螺纹，该双向螺纹环的另一侧部亦设有螺纹；其中一个双向螺纹环的一侧部安装于所述安装壳体的一侧；其中另一个双向螺纹环的一侧部安装于荧光显微镜上。进一步地，所述电动机为实现正反转的电动机。进一步地，该遮光装置还包括与电机轴回旋弹簧件；所述电动机为单向转动的电动机；所述电机轴回旋弹簧件的一端与电动机的电机轴固定连接，该电机轴回旋弹簧件的另一端与所述安装壳体固定连接。进一步地，所述遮光控制系统包括如上所述的荧光显微镜的遮光装置和脚踏开关；所述脚踏开关与电动机进行电性连接；所述脚踏开关用于控制电动机动作；所述脚踏开关设置于所述荧光显微镜的遮光装置的外部。进一步的，所述去核方法适用于猪、牛、羊等哺乳动物的卵母细胞。本发明有益效果：本方法先使用脱羰秋水仙碱(deme)诱导卵母细胞表面产生含染色质的可见突起，从而准确显示卵母细胞核所在位置。去除该突起以及周围紧贴的少量细胞质即可完成去核，吸取的胞质量可以从常规盲吸法去除总胞质质量的1/5-1/4下降到1/8以下。去核的同时通过缩小μv照射范围减少μv照射时间以及不直接照射卵母细胞的方法检测去核情况，如果吸取胞质超过总胞质1/8质量仍未检测到核质则该卵母细胞将舍去不进行注核，因为胞质的过多损耗会影响胚胎的发育潜力，本方法确保了每个构建成功的克隆胚胎既去除很少的胞质又都是100％去核干净的。本去核方法弥补了盲吸法和染色法的缺陷，直接用试剂显核确定核的大概位置，直接用荧光照射确定针管中的核吸取情况，在确保盲吸法去核又少又干净的同时避免了染色检测去核情况时紫外光对卵母细胞的直接照射损伤，并且去核与注核可以连续进行，有效地提高了核移植效率。附图说明图1为本发明操作方法去核状态示意图。图2为图1操作方法去核状态的实景图，其中去核针管中白色亮点处为荧光物质。图3为荧光显微镜的遮光控制系统的立体示意图；其中，遮光装置安装壳体的另一面可见于图3所示的对称的遮光挡片和安装螺纹，以保证遮光装置与显微镜主体和光源发射器连接后三者处于轴线重合。附图标记说明：1、固定针；2、细胞质；3、荧光区域；4、去核针；5、细胞核；6、极体；7、遮光挡片；8、脚踏开关；9、遮光装置安装壳体；10、安装螺纹。具体实施方式为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。实施例1本发明卵母细胞的去核方法以猪卵母细胞为例，包括以下步骤：(1)获取卵丘卵母细胞复合体；在38.5℃、5％co2、饱和湿度的条件下体外成熟培养44h。(2)将(1)中成熟卵母细胞移至装有0.5ml透明质酸酶的离心管中，用移液枪轻轻吹打，去除卵母细胞透明带外围的卵丘颗粒细胞，剩下卵母细胞；(3)将(2)所得的卵母细胞0.5μg/ml的脱羰秋水仙碱(deme)培养液中孵育显核1h，或者浓度为5％的蔗糖溶液中处理10min，使卵母细胞表面形成微小的突起；(4)将(3)中显核后的卵母细胞置于含有7.5μg/ml的hochest33342的培养液中处理2min；(5)调试荧光灯：把荧光灯的照射范围调试到最小，把倒置显微镜光源调暗至肉眼可见卵母细胞，然后把荧光灯照射强度调试到白光可见荧光圈。(6)将处理后的卵母细胞用操作液洗5遍后转入覆盖有石蜡油的30μl含有6μg/mlcb的去核液滴内；(7)荧光灯下去核：把操作盘放在配有脚踩控制荧光灯遮挡板的倒置显微镜下；参见图1和图2，先用固定针固定住卵母细胞，然后用去核针拨动卵母细胞使极体位于时钟4点的位置，去核针3钟点位置插入透明带内，吸去极体及卵母细胞表面微小的突起的部分胞质，同时脚踩荧光遮挡板控制器，荧光照射在去核针前端，当去核针中看到发蓝色荧光的核质时立即停止吸核动作，同时松开脚踩控制器关闭荧光镜头，拔出去核针，去核完成。在一些实施例中，上述方法还可用于牛、羊等哺乳动物的卵母细胞去核。在一些实施例中，步骤1中成熟培养时间还可选42h、43h等。在一些实施例中，步骤(3)中孵育显核处理的试剂还可选择0.3-0.6μg/ml间任意浓度的脱羰秋水仙碱(deme)培养液处理0.5-2h，或者浓度为2.5-10％的蔗糖溶液中处理3-15min。在一些实施例中，步骤3中在脱羰秋水仙碱(deme)培养液孵育显核时间还可为0.5h、1.5h、1.7h、1.8h等；在蔗糖溶液中的处理时间还可以为3min、5min、15min等。在一些实施例中，步骤(4)中的培养液为含有5-7.5μg/ml间任意浓度的hochest33342，处理时间为2-10min间任意时间，如3min、5min、6min、8min等。在一些实施例中，所述步骤(6)的操作还可以为：将步骤(4)处理后的卵母细胞用清洗操作液洗5遍后转入30-40μl间任意体积的覆盖石蜡油的含有5-6.5μg/ml间任意浓度的cb的去核操作液滴内。实施例2参见实施例1的去核方法，步骤7去核操作时，常规组采用常规盲吸法(即常规组按实施例1的步骤1、2、6、7，7采用盲吸去核)，改进组采用本发明去核方法，分别将构建的胚胎移植到受体母猪体内，结果见表1，显示采用改进的方法进行核移植使受体母猪的分娩率从20.83％提高至50％，并且窝均活仔从2.4头提高至3头。表明，该方法有效提高了克隆胚胎体内发育的最终效率。表1常规盲吸法和本发明方法构建的胚胎移植情况统计组别胚胎总数受体猪数分娩猪数总产仔数总活仔数分娩率窝均活仔常规组5241245131220.83％2.4改进组49852412493650.00％3本发明的卵母细胞去核方法，步骤1-7是连续进行的，任何步骤的任何操作环节出错都会影响到后续步骤或环节的操作质量，从而影响到最终的分娩率、成活率。本发明方法的步骤3-4中个试剂的浓度和处理时间是关联的，他们共同影响着最终去核质量：试剂浓度过低达不到效果，浓度过高对卵母细胞有损伤；处理时间过短达不到效果，处理时间长并不能显著提高效率，且浪费操作者的精力。对于此类精细的实验操作，持续时间越久操作者精力耗损越多越容易出现失误，一旦失误，哪怕是一个微小失误，比如轻微的抖动、丝毫的位置偏离等，均会让整个实验功亏一篑。本发明改进后的方法去核干净，且去核时对胞质吸取大大减少，使重组后细胞能更好的发育，提高最终的分娩率、成活率的。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12