永生化的犬脂肪间充质干细胞的体外培养方法及其用途与流程

本发明涉及生物技术领域，涉及动物干细胞的体外增殖、移植，具体涉及一种永生化的犬脂肪间充质干细胞的体外培养培养方法及其用途。

背景技术：

皮肤损伤、皮肤损伤后的疤痕修复是整形外科关注的热点领域。在宠物临床中，犬类由于其好斗、爱撕咬的天性更易发生皮肤缺损等皮肤损伤。大面积的全层皮肤缺损难于恢复，愈合时间长，甚至危及生命。虽然近年来人工皮肤的研究进展迅速，但仍无法构建具有皮肤各部件如毛囊、汗腺、皮脂腺等的皮肤替代物。然而含有干细胞的组织工程皮肤及含有干细胞代谢产物的培养液等在皮肤修复中表现出理想的修复效果。目前，间充质干细胞移植用于严重的皮肤缺损治疗已是除自体皮肤移植和人工皮肤之外极具应用前景的治疗方法之一。

脂肪间充质干细胞（adipose-derivedmesenchymalstemcells，adscs）是分离自脂肪组织的成体干细胞。它具有向成骨、软骨、脂肪、神经、肌肉、真皮等多个方向分化的能力（naderin等，theregenerativeroleofadipose-derivedstemcells(adsc)inplasticandreconstructivesurgery.intwoundj，2017，14：112-124）。adscs的移植在多种创伤性疾病，免疫性疾病，退行性疾病的治疗中都表现出极佳的疗效（wankhadeud等，advancesinadipose-derivedstemcellsisolation,characterization,andapplicationinregenerativetissueengineering.stemcellsint，2016，2016:3206807）。在宠物临床中，adscs移植能帮助动物摆脱疾病，提高生活质量，因此，逐渐成为一种新兴的治疗手段。

近年来，有大量研究对间充质干细胞对皮肤创伤的修复进行了尝试。人脐带血来源的mscs在体外可以分化为角质形成细胞（jacksonwm等，concisereview:clinicaltranslationofwoundhealingtherapiesbasedonmesenchymalstemcells.stemcellstranslmed，2012，1：44-50）。证明了间充质干细胞作为皮肤组织工程种子细胞的巨大潜力。含有骨髓来源mscs的组织工程皮肤可以促进创口愈合（wux，fibringlueasthecell-deliveryvehicleformesenchymalstromalcellsinregenerativemedicine.cytotherapy，2012，14：555-62）。adscs移植可以向血管内皮细胞、真皮成纤维细胞和表皮细胞分化，促进人创口真皮的形成和创面的上皮化（spiekmanm等，thepoweroffatanditsadipose-derivedstromalcells:emergingconceptsforfibroticscartreatment.jtissueengregenmed，2017，11：3220-3235）。进一步证明了间充质干细胞移植在皮肤损伤修复中的巨大作用。

adscs在移植前通常需要经过体外富集扩增以达到足够的细胞数量。然而成体adscs在体外经过一定次数的传代后均会发生增殖减慢，逐渐失去分化能力和治疗作用（kims等，substancepenhancesproliferationandparacrinepotentialofadipose-derivedstemcellsinvitro.biochembiophysrescommun,2017，485：131-137）。永生化的犬脂肪间充质干细胞系可以无限增殖且不影响其分化潜能的特点，但尚未见到将永生化的犬脂肪间充质干细胞系应用于犬皮肤损伤修复治疗的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种永生化的犬脂肪间充质干细胞的体外培养培养方法及其用途，其利用已经建立的永生化犬脂肪间充质干细胞系，对犬皮肤缺损进行治疗，比较了细胞移植与非移植对创口愈合速度及疤痕平整度的影响，为永生化犬脂肪间充质干细胞系治疗犬皮肤缺损的临床应用提供参考。

为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：永生化的犬脂肪间充质干细胞在治疗犬皮肤缺损中的应用。

永生化的犬脂肪间充质干细胞的体外培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）永生化的犬脂肪间充质干细胞的复苏：

于液氮中取出冻存的永生化的犬脂肪间充质干细胞置于37℃的水浴锅中迅速解冻，将解冻的细胞加入10倍体积的α-mem完全培养液中1000rpm，5min常温离心，弃去离心上清，加入α-mem完全培养液混匀，转移置细胞培养皿中，置于37℃、体积比为5%co2的培养箱中贴壁培养，待4-6h后细胞贴壁，换入新鲜α-mem完全培养液培养至细胞90%融合时进行消化传代；

2）永生化的犬脂肪间充质干细胞的传代：

传代时将细胞培养液上清吸出，换入1mlpbs轻柔浸润细胞后弃去pbs，加入500μl0.25%胰蛋白酶，置于37℃、体积比为5%co2的培养箱中孵育，待细胞回缩至近圆形，加入1mlα-mem完全培养液中和消化，1000rpm，常温离心5min，弃去离心上清，加入6mlα-mem完全培养液混匀，按1:3比例传代至3个60mm细胞培养皿中，每两天换液一次。

所述的步骤1）的α-mem完全培养液为α-mem加入10%fbs、2mmol/l谷氨酰胺、100mg/ml青霉素/链霉素。

所述的步骤2）的pbs为8.0gnacl、0.2gkcl、2.899gna2hpo4·12h2o、0.2gkh2po4溶于1000ml四蒸水中，高压灭菌后降至室温分装备用。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1、本发明是以永生化的犬脂肪间充质干细胞作为种子细胞，皮下多点注射的方法，将永生化的犬脂肪间充质干细胞移植于创口边缘，促进犬皮肤伤口愈合速度及提高疤痕平整度。永生化的犬脂肪间充质干细胞系治疗犬皮肤缺损能够达到缩短创口愈合速度，提高疤痕平整度的效果。

2、本发明为人类整形外科治疗皮肤损伤修复提供数据支持。间充质干细胞治疗为大面积、难愈合的皮肤缺损治疗及复杂的疤痕修复机制问题带来希望。而犬类具有与人类相似的生理结构特点，本发明对人类皮肤缺损的修复治疗具有重要的参考意义。

3、采用永生化的犬脂肪间充质干细胞治疗犬皮肤缺损操作简便，便于推广。只需在创缘合适位置进行皮下多点注射，便于将间充质干细胞移植技术在兽医临床中的使用，为推动干细胞移植技术在临床中的应用提供方便。

附图说明

图1为永生化犬脂肪间充质干细胞移植后15d后创口的外观。其中a图为永生化犬脂肪间充质干细胞移植侧15d后创口的外观；b图为对照侧15d后创口的外观。

图2为永生化犬脂肪间充质干细胞移植后22d后创口的外观。其中a图为永生化犬脂肪间充质干细胞移植侧22d后创口的外观；b图为对照侧22d后创口的外观。

图3为永生化犬脂肪间充质干细胞移植后22d后创缘组织切片he染色。其中a图为永生化犬脂肪间充质干细胞移植侧22d后创缘组织切片he染色；b图为对照侧22d后创缘组织切片he染色。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明为利用已经建立的永生化犬脂肪间充质干细胞系，对犬皮肤缺损进行治疗，是以永生化的犬脂肪间充质干细胞作为种子细胞，皮下多点注射的方法，将永生化的犬脂肪间充质干细胞移植于创口边缘，促进犬皮肤伤口愈合速度及疤痕平整度。

实施例：

1、永生化的犬脂肪间充质干细胞的体外培养方法，具体包括以下步骤：

1）永生化的犬脂肪间充质干细胞的复苏

通过慢病毒介导稳定表达tert的永生化犬脂肪间充质干细胞系冻存在液氮中，复苏细胞时，于液氮中取出冻存的永生化的犬脂肪间充质干细胞迅速置于37℃的水浴锅中解冻，将解冻的细胞加入10倍体积的室温α-mem完全培养液（α-mem加入10%fbs、2mmol/l谷氨酰胺、100mg/ml青霉素/链霉素）中1000rpm，常温离心5min。弃去离心上清，以2×10⁵个/ml的细胞密度加入α-mem完全培养液混匀，转移置60mm细胞培养皿中，置于37℃、体积比为5%co2的培养箱中贴壁培养，待4-6h后细胞贴壁，换入新鲜α-mem完全培养液培养至细胞90%融合时进行消化传代；

2）永生化的犬脂肪间充质干细胞的传代

传代时将细胞培养液上清吸出，换入1mlpbs（8.0gnacl、0.2gkcl、2.899gna2hpo4·12h2o、0.2gkh2po4溶于1000ml四蒸水中，高压灭菌后降至室温分装备用）轻柔浸润细胞后弃去pbs，加入500μl0.25%胰蛋白酶，置于37℃、体积比为5%co2的培养箱中孵育，待细胞回缩至近圆形，加入1mlα-mem完全培养液中和消化，1000rpm，常温离心5min。弃去离心上清，加入6mlα-mem完全培养液混匀，按1:3比例传代至3个60mm细胞培养皿中，每两天换液一次；

2、犬皮肤损伤模型的制备方法，具体包括以下步骤：

肌肉注射舒泰-50麻醉剂将犬全身麻醉后，对犬后颈进行除毛消毒处理，在后颈左右对称位置造两个直径为3cm的圆形皮肤全层缺损，两创口中心位置相距10cm。

3、永生化的犬脂肪间充质干细胞的移植方法，具体包括以下步骤：

待犬脂肪间充质干细胞融合度达到90%，使用0.25%胰蛋白酶将细胞消化，1000rpm，5min常温离心，弃去离心上清，加入pbs轻柔吹打，洗涤细胞两次，计数。将犬脂肪间充质干细胞按照1×10⁷个/ml悬浮于pbs中，用于移植。在犬左侧皮肤缺损创口的边缘0.5cm距离选对称四点平行于创口进针，皮下注射永生化犬脂肪间充质干细胞悬液共1ml，边注射边退针。右侧创口依同样方法注射1mlpbs对照液。纱布包扎创口，并对犬只进行阿莫西林静脉滴注7d，防止感染。

本发明永生化的犬脂肪间充质干细胞系治疗犬皮肤缺损的效果：

永生化犬脂肪间充质干细胞移植促进创口愈合，并且愈合更快（图1a,b）。永生化犬脂肪间充质干细胞移植后17d，细胞移植侧创口完全愈合，疤痕平整、光滑。移植后22d，对照侧创口完全愈合，与细胞移植侧相比，疤痕不平滑（图2a,b）。

皮肤组织切片he染色显示，永生化犬脂肪间充质干细胞移植后22d，细胞移植侧可见大量成纤维细胞和真皮胶原基质长入创面，同时上皮覆盖创面，已形成钉突样结构，可见少量毛囊等皮肤附属器结构（图3a），而对照侧真皮层中微血管较多，上皮爬行但未完全覆盖创面（图3b）。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。