一种连续体积梯度毛细管数字PCR方法和试剂盒与流程

本发明涉及数字pcr领域，特别涉及一种连续体积梯度毛细管数字pcr方法。

背景技术：

现代生物学研究，特别是医学研究时常涉及对核酸定量分析的需求。比如检测血液中某些游离dna及其含量，可以指导某些癌症的临床诊断，以及监控癌症的治疗效果。以往的定量主要采取荧光定量pcr进行相对定量，即选取一个表达稳定的基因的转录物作为参照，来评判目的核酸的量的高低。但这种方法易受非目的核酸分子(背景噪音)的干扰，只适用于定性或者低精度检测，无法满足某些含量特别稀少的目标核酸分子的检测。

数字pcr(dpcr)则能通过大规模的平行pcr扩增，将微弱的扩增信号从背景噪音中提炼出来，以“终点信号的有或无”来统计被扩增的分子的个数。近几年来，随着纳米制造技术和微流体技术的发展，及二代测序技术发展起来的“油包水pcr”技术，可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，以此作为dpcr的样品分散载体，而产生的微滴式数字pcr(ddpcr)技术，是目前相对成熟的数字pcr平台。

一方面，ddpcr需要借助微滴发生器来实现均匀微滴的生成，将微滴转移到96孔板进行pcr后，又需要微滴分析仪进行信号读取。该过程涉及的仪器价格较高，普通实验室难以承受。

另一方面，由于数字pcr是根据阳性液滴个数来统计模板拷贝数的，数字pcr中每个液滴中模板的拷贝数不能太高也不能太低，太高会造成最终统计拷贝数偏少，太低又会导致统计误差过大，统计学上最完美的是1个左右。为了调试实验模板用量，主流数字pcr(包括ddpcr)都需要做预实验来确定实验模板用量；对于一些十分珍贵的核酸材料，做预实验的成本将非常高，甚至根本不够做一次预实验。

技术实现要素：

为了解决现有技术中成本高和需要做预实验的问题，本发明提供了一种连续体积梯度毛细管数字pcr方法。

本发明提供了一种连续体积梯度毛细管数字pcr方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)将含荧光基团的pcr反应体系和油相按照1∶(2～4)的体积比震荡混匀，置入内径由大到小连续变化的毛细管中，封闭毛细管两端；所述油相密度等于水的密度；

(2)加热使油相和水相沿毛细管径向交替分布；

(3)进行pcr反应，荧光信号采集设备下统计阳性微滴占比25％～55％区域的微滴数和微滴半径，计算pcr模板拷贝数；优选统计阳性微滴占比30％～50％区域。

前述的毛细管数字pcr方法，其特征在于，所述毛细管细端内径为10～50μm，粗端内径≤1mm，毛细管长度为0.8～4cm。

前述的毛细管数字pcr方法，其特征在于，步骤(2)加热条件为，95℃下维持10min。

前述的毛细管数字pcr方法，其特征在于，所述pcr反应体系和与水等密度油相的比例是1∶3(v/v)。

前述的毛细管数字pcr方法，其特征在于，所述油相为蓖麻油与石蜡油按3∶1(v/v)比例混合，再用该混合物配制胆固醇饱和溶液，即得。

前述的毛细管数字pcr方法，其特征在于，所述油相还含有表面活性剂。

前述的毛细管数字pcr方法，其特征在于，所述表面活性剂是司盘80或吐温60；

所述司盘80占油相体积的0.5％；

所述吐温60占油相体积的0.1％。

前述的毛细管数字pcr方法，其特征在于，所述pcr反应体系的荧光基团位于探针上，或者位于双链荧光染料分子上。

本发明还提供了一种连续体积梯度毛细管数字pcr试剂盒，其特征在于，它包括pcr反应体系，与水的密度相密度的油相；所述油相为蓖麻油与石蜡油按3∶1(v/v)比例混合，再用该混合物配制胆固醇饱和溶液，即得。

如前所述的试剂盒，其特征在于：所述油相还包括表面活性剂；所述表面活性剂是司盘80或吐温60；

所述司盘80占油相体积的0.5％；

所述吐温60占油相体积的0.1％。

本发明的方法，通过内径由大到小连续变化的毛细管与高温处理，使液滴呈连续体积分布于毛细管内；液滴带有目标分子的概率随着液滴体积的增大而增大。pcr后，阳性液滴的分布状况为，大液滴阳性比例高，每个液滴含有多个初始拷贝，统计阳性液滴会低估初始拷贝数；小液滴阳性比例低，统计误差会很大；中间会有一段区域的阳性液滴比例适中，对应的液滴内初始拷贝数在1个左右，申请人通过实验发现在阳性微滴占比25％～55％区域时，可以通过阳性液滴的比例和液滴大小计算pcr模板的拷贝数，在阳性液滴占比是30％～50％的准确率较高。本发明选择合适的区域后，可以直接检测并计算，避免了常规数字pcr为了使阳性液滴比例适中而进行的多次样本稀释预实验。

本发明的技术方案中，由于液滴的体积非常小，含有的dna拷贝非常少，可以实现与数字pcr相同的效果，检测待检样本中的微量dna。

本发明的方法，由于耗材可以采用廉价的毛细管，相比现有的数字pcr，大大节约地了成本，且简化了操作步骤，且检测方法准确，具有很好的应用前景。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1为毛细管即毛细管内连续体积梯度的油包水液滴

具体实施方式

实施例一种连续体积梯度毛细管数字pcr方法

1.连续体积梯度毛细管制备

使用内径为1mm毛细管制作连续体积梯度毛细管，在酒精灯烧烤下，均匀用力拉制毛细管至断裂，修整毛细管尖端，暴露尖端孔通畅。得到粗端内径1mm、细端内径20μm、长3cm的毛细管。

2.油相制备

首先配制密度接近于水密度的油，本实施例用蓖麻油(0.98g/l)和石蜡油按照3∶1体积比配匀并加入胆固醇，比例为100ml蓖麻油加入过量胆固醇使之溶解为饱和状态，加入0.5％司盘80或者0.1％的tween60表面活性剂，震荡均匀，使蓖麻油、石蜡油和胆固醇混合物混合稳定，均匀生长。

3.pcr油水混合物制备

配制常规荧光定量pcr体系，即混合dna模板、taq酶、镁离子、荧光探针、引物、dntp、水和必要的缓冲液。

前述的荧光探针也可以换成不带荧光基团的探针，但要额外在pcr体系中添加双链dna结合染料，如sybrgreeni。

混合20μlpcr体系和60μl前述油相，充分震荡均匀，得到pcr油水混合物。

4.连续体积梯度毛细管pcr反应

以大头端毛细管插入液面下，利用毛细管现象吸入配置好油水混合物，将毛细管尖端朝下放置，使油水混合物利用重力作用充满至毛细管尖端，用火焰烧结尖端，封闭毛细管，大头端使用封口胶封闭，将毛细管放入pcr管，pcr管注水放入定量pcr仪器内，加热至95℃维持10分钟，此时毛细管中会形成一排油包水液滴沿毛细管径向排列，液滴直径为液滴所在位置毛细管的内径(如图1所示)。然后进行pcr扩增，即变性、退火、延伸，进行35个循环完成扩增。

5.高内涵显微镜对毛细管内液滴荧光信号采集和统计计算

将毛细管取出后放到高内涵显微镜下观察读取数据。为了方便计算，选取含有50～100个液滴的毛细管区域，该区域内阳性液滴比例在30％～50％范围内。统计阳性液滴数目，测量该区域第一个液滴半径r1，区域中心的一个液滴半径r2，区域最后一个液滴半径r3。液滴总体积用下面公式计算：(4/3×πr1³+4/3×πr2³+4/3×πr3³)/3×总液滴个数＝液滴总体积；并用泊松分布方法校正计算平均每个液滴中阳性模板的拷贝个数，公式：每液滴阳性模板拷贝个数m＝-ln(1-阳性概率)；以该区域模板总数除以该区域液滴的总体积，即是单位体积内的拷贝数，再乘以加样体积即是所配制pcr反应体系中的模板拷贝总数。

实验例人工egfr基因定量测试

本实验例以人工合成的egfr基因为测试模板。

1.方法

1.1连续体积梯度毛细管制备

使用内径为1mm毛细管制作连续体积梯度毛细管，在酒精灯烧烤下，均匀用力拉制毛细管至断裂，修整毛细管尖端，暴露尖端孔通畅。得到粗端内径1mm、细端内径20μm、长3cm的毛细管。

1.2油相制备

首先配制密度接近于水密度的油，本实施例用蓖麻油(0.98g/l)和石蜡油按照3∶1体积比配匀并加入胆固醇，比例为100ml蓖麻油加入过量胆固醇使之溶解为饱和状态，加入0.5％司盘80或者0.1％的tween60表面活性剂，震荡均匀，使蓖麻油、石蜡油和胆固醇混合物混合稳定，均匀生长。

1.3pcr油水混合物制备

使用常规2×pcr预混缓冲液10μl，加入上下游引物、探针和模板，再用水补充体积至20μl，为pcr水相体系。水相体系中：引物和探针终浓度均为0.25μmol/l，模板浓度为300copies/μl。引物、探针、模板序列如下：

pcr引物：

vegfr-f：gtggacaacccccacgtgt(seqidno.1)；

vegfr-r：ccgaagggcatgagcttcg(seqidno.2)。

taqman探针：fam-cctcacctccaccgtgcagctc(seqidno.3)-tamra。

模板：

gtggacaacccccacgtgtggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatatgcagctcatgcccttcggcagcctcctggactatgtccggggccaaactgctgggtgc(seqidno.4)。

混合20μl水相体系和60μl前述油相，充分震荡均匀，得到pcr油水混合物。

1.4连续体积梯度毛细管pcr反应

以大头端毛细管插入液面下，利用毛细管现象吸入配置好油水混合物，将毛细管尖端朝下放置，使油水混合物利用重力作用充满至毛细管尖端，用火焰烧结尖端，封闭毛细管，大头端使用封口胶封闭，将毛细管放入pcr管，pcr管注水放入定量pcr仪器内，加热至95℃维持10分钟，形成连续体积梯度的毛细管内油包水液滴(如图1所示)，进行pcr扩增，即95℃维持10秒，50℃维持30秒，60℃维持30秒，进行35个循环完成扩增。

1.5高内涵显微镜对毛细管内液滴荧光信号采集和统计计算

将毛细管取出后放到高内涵显微镜下观察读取数据，为了方便计算，我们选取接近50％的阳性液滴处的液滴作为分析对象，按照实施例第5小节统计和计算pcr反应体系中的模板拷贝总数。

2.结果

所选取的50个油包水液滴扩增阳性的液滴数目为21个，计算得每个液滴阳性模板个数约为0.5447，50个液滴中约含有27.24个copies(模板拷贝)。

经测量，r1＝1.36μm，r2＝1.25μm，r3＝1.13μm，纳入上述公式计算纳入统计的50个液滴总体积约为412nl，所以pcr扩增体系中模板浓度为27.24/0.412＝66copies/μl，则20μl反应体系中含待测模板约20×66＝1322copies，与已知的模板浓度1500copies/5μl基本相符。

综上，本发明提供的连续体积梯度毛细管数字pcr方法可以以较低的成本达到不错的dna定量检测精度，且无需做样品稀释倍数的预实验，具有很好的应用前景。