一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法与流程

本发明属于养殖领域及分子生物学领域，更具体涉及一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法，适用于克氏原螯虾两个地理种群的区分，应用本方法可判定群体的地理归属。

技术背景

克氏原螯虾(procambarusclarkii)，属于甲壳纲、十足目、蝲蛄科，是存活于淡水中一种的甲壳类动物，俗称红螯虾或者小龙虾。原产于美国南部路易斯安那州，善于掘洞，昼伏夜出，杂食性动物。因为克氏原螯虾肉味鲜美，营养成分比较丰富，受到国内外市场的热烈欢迎，它不仅成为国内城乡居民餐桌上的美味佳肴，经过数十年的繁殖与扩散，逐渐成为长江中下游乃至全国范围内的重要经济水产品，深受消费者的喜爱。

由于各地生长环境不同，导致克氏原螯虾在品质上存在一定差异，再加上消费者消费习惯的偏好，从而导致不同地方的价格差异很大，部分奸商采取以次充好，从低价地区收购冒充高价地区的虾，欺骗消费者。而传统方法利用外形区别既不准确又没有统一标准。申请人经过研究，发现一种利用分子标记区分克氏原螯虾不同群体的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种利用分子生物学技术即微卫星标记的方法，方法易行，操作简便，不依赖外形指标，准确性高，适用于克氏原螯虾在两个地理种群的区分，该方法区分湖北省两个地区(潜江高场周边地区；汉川汈汊湖周边地区)的克氏原螯虾群体。有效的解决了两个地区群体来源不清的问题，为鉴别来源提供了技术支持。

为了实现以上目的，本发明采取以下技术方案：

一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法，包括以下步骤：

1)分别提取待鉴定的不同群体克氏原螯虾的dna，每个群体50－200只；

2)pcr扩增及检测：利用引物pcsr82f5'-gatattttggcttgtgggga-3'，pcsr82r5'-acctgggaaaccatgacttg-3'扩增目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

3)统计不同群体中扩增出154bp条带的个体数占该群体总数的比例，所述的比例大于或等于80％，则该群体属于潜江高场地区；所述的比例小于或等于45％，该群体属于汉川刁汊湖地区或周边地区。

优选地，步骤1)中所述的群体不少于100只。

优选地，步骤2)中pcr扩增过程中退火温度为58-62℃。

本方法适用于群体鉴别而无法做到个体区分，两个地方群体在未进行人工混杂的情况下，该分子标记出现比例呈极大的差异，所述的分子标记经克隆测序得到核心序列区为(ac)2(at)3。(在不同的个体或群体中扩增出的分子标记的序列相同，但出现比例不同，即凡出现154bp条带产物序列都相同是有的不会有该pcr产物，或为其他大小，或无产物)。

所述的步骤1：引物设计与筛选，通过转录组测序，根据测序结果的多态性，设计微卫星引物。通过实地取样提取dna后，对引物进行筛选，包括适宜的退火温度和产物出现比例(并不是每一对引物都能有结果，也不是每对引物都能按照这个比例出现，)筛选到合适的引物。本发明中选用的引物是从大约1000对引物中筛选出来的。2：pcr产物出现比例与归属地判定。根据采样地点pcr产物琼脂糖电泳结果，归纳特点，总结出结论。

主要解决了以下技术问题：针对近年来，克氏原螯虾虾种种质退化，个体变小，病害频发等等一系列问题，各个养殖场之间开始互相引种，但引种过程一无理论基础，二无数据支撑，虾种来源较多而且混乱，从外形、体色等指标无法判断来源，方法并不科学，在引种时很有可能就是去年或者前年从本塘里流出去的种。本发明能判别来源，因此在一定范围内引种时可以鉴别群体来源，请见引物库图8(部分)和一种引物筛选步骤(图9)。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.结果简单清晰，比例差异巨大。

2.操作相对简单，所有实验过程都是常规操作，不存在技术瓶颈。

3.可重复性高。

4.不依赖外形指标，结果准确。

附图说明

图1为一种pcr扩增的目的片段的琼脂糖凝胶电泳图。

m永道为marker，p泳道为pcr扩增产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳结果(154bp)。

图2为一种湖北潜江高场克氏原螯虾群体的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

扩增出154bp条带的个体数占群体总数的80％。地区apcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果(154bp)，注：p1-p8为154bp产物，p9-p10为非154bp产物。(总共11个泳道，154bp产物出现8个，2个为其他产物，1个maker)。

图3为一种湖北汉川刁汊湖克氏原螯虾群体的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

扩增出154bp条带的个体数占群体总数的41％。地区bpcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果(154bp)，注：p4,p9-p10,p18-p24为154bp产物，其他为非154bp产物。(总共25个泳道，154bp产物出现10个，14个为其他产物或无产物，1个maker)

图4为一种湖北潜江高场克氏原螯虾群体的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

扩增出154bp条带的个体数占群体总数的83.3％。地区apcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果(154bp)，注：p4-p10，p12-p18,p20-p24为154bp产物，p1-p3,p19为非154bp产物。(总共25个泳道，154bppcr产物出现20个，4个为其他产物，1个maker)

图5为一种湖北潜江高场克氏原螯虾群体的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

扩增出154bp条带的个体数占群体总数的83.3％。地区apcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果(154bp)，注：p4-p11,p13-p18为154bp产物，p1-p3为非154bp产物。(总共19个泳道，154bpc产物出现15个，3个为其他产物，1个maker)

图6为一种湖北汉川刁汊湖克氏原螯虾群体的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

扩增出154bp条带的个体数占群体总数的25％。地区bpcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果(154bp)，注：p2-4，p14-p16为154bp产物，其他为非154bp产物。(总共25个泳道，154bp产物出现6个，18个为其他产物或无产物，1个maker)

图7为一种湖北汉川刁汊湖克氏原螯虾群体的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

扩增出154bp条带的个体数占群体总数的37.5％。地区bpcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果(154bp)，注：p2-3,p9-10，p18-p21，p24为154bp产物，其他为非154bp产物。(总共25个泳道，154bpc产物出现9个，15个为其他产物或无产物，1个maker)

图8为一种引物库(部分)示意图。

图9为一种筛选引物的方框示意图。

具体实施方式

实施例1：

2015年10月，到地区a(湖北潜江高场)收购克氏原螯虾25公斤，到地区b(湖北汉川刁汊湖)收购克氏原螯虾25公斤，各随机选取192只，共384只，按群体分开，保存。按照下述分子标记方法进一步验证这两个群体的来源：

一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法，其步骤是：

1.dna提取：采用吸附柱法提取肌肉组织中的dna，试剂为tiangen试剂盒(dp304)，方法按照试剂盒操作步骤，并略作修正，修正内容为：取样重量约为0.1g～0.3g；56℃金属浴或水浴加热时间为90min～110min，过离子吸附柱之前先经12000r/min离心15分钟，吸取上清液过吸附柱。

2.pcr扩增：pcr扩增体系为20μl，包括10μl2×pcrmix(内含mgc12，dntp)，微卫星上下游引物(10μmol/l)各1μl，dna模板(25ng/μl)1μl，无菌水7μl。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。所述的正向引物为5'-gatattttggcttgtgggga-3'，反向引物为5'-acctgggaaaccatgacttg-3'。

3.产物检测：扩增产物用1×tbe(10×tbe：每1000ml中含108gtris·base、55g硼酸、9.3gna2edta·2h2o)缓冲液配制的1.5％-2％(重量比即100ml缓冲溶液中，加入1.5-2g的琼脂糖)琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为140v，15min。

4.结果：地区a出现154bppcr产物(154bp)的个体数为166个，占该检测群体的86.46％，地区b出现154bppcr产物(154bp)的个体数为77个，占该检测群体的40.1％。因此，根据不同群体中扩增出154bp条带的个体数占群体总数的比例(≥80％属于潜江高场地区，≤45％属于汉川刁汊湖地区)可准确判断出群体的来源。

实施例2：

2016年8月，到地区a收购克氏原螯虾20公斤，到地区b收购20公斤，各随机选取192只，共384只，按群体分开，保存。按照下述分子标记方法进一步验证这两个群体的来源：

一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法，其步骤是：

1.dna提取：采用吸附柱法提取肌肉组织中的dna，试剂为tiangen试剂盒(dp304)，方法按照试剂盒操作步骤，并略作修正(同实施例1)。

2.pcr扩增：pcr扩增体系为20μl，包括10μl2×pcrmix(内含mgc12，dntp)，微卫星上下游引物(10μmol/l，引物序列同实施例1)各1μl，dna模板(25ng/μl)1μl，无菌水7μl。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

3.产物检测：扩增产物用1×tbe(10×tbe：每1000ml中含108gtris·base、55g硼酸、9.3gna2edta·2h2o。)缓冲液配制的1.5％-2％(即100ml缓冲溶液中，加入1.5-2g的琼脂糖)琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为140v，15min。

4.结果：地区a出现154bppcr产物(154bp)的个体数为158个，占该检测群体的82.29％，地区b出现154bppcr产物(154bp)的个体数为81个，占该检测群体的42.19％。因此，根据不同群体中扩增出154bp条带的个体数占群体总数的比例(≥80％属于潜江高场地区，≤45％属于汉川刁汊湖地区)可准确判断出群体的来源。

实施例3：

2017年6月，到地区a收购克氏原螯虾40公斤，到地区b收购40公斤，各随机选取192只，共384只，按群体分开，保存。按照下述分子标记方法进一步验证这两个群体的来源：

一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法，其步骤是：

1.dna提取：采用吸附柱法提取肌肉组织中的dna，试剂为tiangen试剂盒(dp304)，方法按照试剂盒操作步骤，并略作修正(同实施例1)。

2.pcr扩增：pcr扩增体系为20μl，包括10μl2×pcrmix(内含mgc12，dntp)，微卫星上下游引物(10μmol/l，引物序列同实施例1)各1μl，dna模板(25ng/μl)1μl，无菌水7μl。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

3.产物检测：扩增产物用1×tbe(10×tbe：每1000ml中含108gtris·base、55g硼酸、9.3gna2edta·2h2o。)缓冲液配制的1.5％-2％(即100ml缓冲溶液中，加入1.5-2g的琼脂糖)琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为140v，15min。

4.结果：地区a出现154bppcr产物(154bp)的个体数为155个，占该检测群体的80.73％，地区b出现154bppcr产物(154bp)的个体数为85个，占该检测群体的44.27％。因此，根据不同群体中扩增出154bp条带的个体数占群体总数的比例(≥80％属于潜江高场地区，≤45％属于汉川刁汊湖地区)可准确判断出群体的来源。

实施例4：

根据图9可知，一种引物的筛选如下：

1.根据分析结果设计引物：通过软件对测得序列进行分析，对比，设计得到理论上可能有结果的引物(仅为数据，无实体)。

2.将设计得到的引物序列(如引物库(部分))，交由引物合成公司进行合成，获得实体。

3.将得到的引物(实体)在实验室内进行筛选，根据理论退火温度，设计温度梯度(51℃-64℃)，进行群体的pcr反应。

4.将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并根据电泳结果进行分析。

5.通过凝胶电泳成像系统进行拍照，并对照片进行分析，进行第一轮筛选，通过pcr产物的有无，将无产物的引物废弃，有产物的引物进行下一轮筛选。

6.个体pcr产物分析，通过电泳结果的出现的比例进行筛选，并对结果进行归纳分析(大多数结果都有，少量结果为出现比例无显著差异，难以分析，出现结果差异较大，便于判断的仅此一对)。

7.取样，将筛选得到的引物，应用到新取得的样本中，进行验证，结果一致，确定该引物有效。