本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是涉及一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4。
背景技术：
：众所周知，微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等活性物质的重要来源。微生物由于可以大规模发酵培养，无原料限制，不会破坏环境等优点已成为天然产物研究领域的热点。近年来从陆地微生物中获得新化合物的概率大幅降低，而海洋来源微生物由于其生存环境特异，除可产生与陆地相似的代谢产物之外，有时还会产生一些结构特异的新化合物，显示了巨大的开发利用前景。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体，倍半萜，蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类，肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。现有技术如授权公告号为cn104710396b的中国发明专利，公开了一种柳珊湖来源真菌次级代谢产物衍生物及其作为抗菌剂的应用。其分离得到的化合物对甲氧西林耐药的金黄色葡球菌(mrsa)、万古霉素耐药的肠球菌(vre)具有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌有一定的抑制作用，最小抑制浓度mic均小于12.5μm，表明其可发展为有潜力的抗菌药物，但是该柳珊湖来源真菌次级代谢产物衍生物对革兰氏阴性菌的抑制活性不明显。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4，其制备方法是土曲霉skl-001经表观遗传修饰调控剂saha修饰，产生多样化的次级代谢产物，发酵物分离萃取率高。本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4，为式i所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，式i具有如下结构：其中，r1、r2各自独立地为h、oh、c1-c4烷氧基、c1-c4烷基磺酰基、c2-c4烷基酰基，且r1、r2中有一个为h；r3、r4各自独立地为h、oh、卤素、氨基、c1-c4烷基、c2-c4烷基酰基、c1-c4卤代烷基、c1-c4烷基磺酰基、c2-c4烯基、且r3、r4中至少有一个不为h。一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的土曲霉skl-001的甘油冻存管置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的pda斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养4天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂saha、帕立骨化醇、甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60l；帕立骨化醇、甘油三酯添加到真菌培养基中，可与表观遗传修饰调控剂saha协同作用，改变培养基内溶解氧环境，促进菌丝发酵，同时，促进saha与菌丝体细胞通路的活性位点结合，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物的产量和多样性；次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，浸泡，用功率800w的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率；分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-丙酮-甲醇；所得组分3用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂为石油醚–乙酸乙酯；所得组分12用制备薄层色谱法分离，展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1；所得组分2，用高效液相色谱分离纯化，洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:30，得到土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4。作为优选，孢子制备步骤中，甘油冻存管中冻存液为：用20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的pda液体冻存液。作为优选，菌株发酵步骤中，表观遗传修饰调控剂saha的终浓度为5-25μm。作为优选，菌株发酵步骤中，帕立骨化醇的添加量为0.05-0.1％，甘油三酯添加量为0.05-0.15％。作为优选，次级代谢产物萃取步骤中，2-甲基丙氨酸的添加量为培养基质量的1-3％，柠檬酸钙的添加量为培养基质量的0.5-1.5％。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明由表观遗传修饰调控剂saha修饰制得一种新的化合物——土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4；本发明在培养基中添加帕立骨化醇、甘油三酯，与表观遗传修饰调控剂saha产生协同增益作用，促进土曲霉skl-001产生多样化的次级代谢产物；本发明在菌丝体萃取过程中，加入2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，协同超声波的机械作用、空化作用，破坏细胞壁，加速胞内物质释放，提高发酵物萃取率；本发明制得的土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4及其立体异构体或药学上可接触的盐，具有长效抑菌抗炎作用。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4，为式i所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，式i具有如下结构：一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的土曲霉skl-001的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的pda液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的pda斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养4天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂saha，其终浓度为15μm，0.05％帕立骨化醇、0.1％甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60l；帕立骨化醇、甘油三酯添加到真菌培养基中，可与表观遗传修饰调控剂saha协同作用，改变培养基内溶解氧环境，促进菌丝发酵，同时，促进saha与菌丝体细胞通路的活性位点结合，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物的产量和多样性；次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800w的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率；分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-丙酮-甲醇，得到4个组分；选取第三个组分，用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯；选取第12个组分经制备薄层色谱法分离，展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1，分离得到4个组分，选取第二个组分，经高效液相色谱分离纯化，洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:30，得到化合物新次级代谢产物lw-4。实施例2：一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4，为式i所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，其特征在于，式i具有如下结构：一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的土曲霉skl-001的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的pda液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的pda斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养4天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂saha，其终浓度为10μm，0.08％帕立骨化醇、0.1％甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60l；次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800w的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-丙酮-甲醇，得到4个组分；选取第三个组分，用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯；选取第12个组分经制备薄层色谱法分离，展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1，分离得到4个组分，选取第二个组分，经高效液相色谱分离纯化，洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:30，得到化合物新次级代谢产物lw-4。实施例3：一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4，为式i所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，其特征在于，式i具有如下结构：一种土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的土曲霉skl-001的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的pda液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的pda斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养4天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂saha，其终浓度为10μm，0.1％帕立骨化醇、0.15％甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60l；次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、3％2-甲基丙氨酸、1.5％柠檬酸钙，浸泡，用功率800w的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-丙酮-甲醇，得到4个组分；选取第三个组分，用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯；选取第12个组分经制备薄层色谱法分离，展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1，分离得到4个组分，选取第二个组分，经高效液相色谱分离纯化，洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:30，得到化合物土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4。对比例1：菌株发酵制备步骤中未添加帕立骨化醇、甘油三酯，其余部分和实施例2完全一致。对比例2：菌株发酵制备步骤中未添加表观遗传修饰调控剂saha，其余部分和实施例2完全一致。对比例3：次级代谢产物萃取步骤中未添加2-甲基丙氨酸、柠檬酸钙，其余和实施例2完全一致。实施例4：将实施例2设为试验组，对比例1、对比例2和对比例3分别设为对照组1、对照组2和对照组3，对比制得的最终发酵萃取物和新次级代谢产物lw-4的重量，结果见表1。表1最终发酵萃取物和土曲霉skl-001新次级代谢产物lw-4的重量组别最终发酵萃取物(g)新次级代谢产物lw-4(mg)试验组18.111对照组113.18对照组210.50对照组318.19.5由表1可知，试验组和对照组3的最终发酵萃取物重量高于对照组1、对照组2，说明帕立骨化醇、甘油三酯、表观遗传修饰调控剂saha的加入能够提高土曲霉skl-001的发酵程度，使其产生更多的次级代谢产物；试验组的新次级代谢产物lw-4的重量高于对照组1、对照组2、对照组3，说明2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙的加入能够提高菌丝体的萃取率，对照组2的新次级代谢产物lw-4为0，说明表观遗传修饰调控剂saha的调控使土曲霉skl-001产生新次级代谢产物lw-4。本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12