一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶的制作方法

本发明涉及β-葡萄糖苷酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase，ec3.2.1.21，简称bgl1)又称为葡萄糖苷水解酶，它能水解纤维二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖，解除纤维二糖和纤维寡糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的反馈抑制，还可以把水果和茶叶中的香气前体物酶解，起到增强香气的作用。β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，是纤维素酶系的重要组成成分之一。

β-葡萄糖苷酶在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。近年来，其在食品工业中表现出了重要的应用前景：β-葡萄糖苷酶可水解果蔬中的风味前体物质如单帖烯醇糖苷等，释放出具有浓郁天然香气的物质，已成为食品工业中重要的风味增香剂。在制备功能性食品时则用于生物活性物质的转化，如豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接种产β-葡萄糖苷酶的微生物,都能够将豆奶及豆奶粉中生物有效性较低的异黄酮糖苷化合物高效转化为高活性的异黄酮苷元。β-葡萄糖苷酶的另一重要用途是作用于纤维素生物转化，纤维素这一巨大可再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大现实意义。在饲料工业中,β-葡萄糖苷酶常被作为一种饲料添加剂,它可以酶解富含纤维的细胞壁,使细胞内包含的蛋白质等营养物质释放出来,同时又将纤维降解为便于动物消化吸收的还原糖,从而提高饲料利用率。但是在实际应用中还是有许多不足,如稳定性不够好等，这会影响β-葡萄糖苷酶的有效性而增加了应用成本。因此对葡萄糖苷酶进行改造具有十分重要的意义。

近十八年来，有关β-葡萄糖苷酶的专利有近190个，这些专利主要集中于发现和筛选来自不同来源的产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株或通过基因重组方法获得产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株(如所产β-葡萄糖苷酶具有嗜/耐热(zl201610060528.7、zl201310049606.x、zl201510203453.9、zl201510203484.4、zl201110214130.1)、高温中性(zl201410713835.1)、中温中性(zl201410717927.7、zl201110334815.x)、嗜热碱性(zl200510116748.9)、嗜热耐酸性(zl200910218167.4、zl201410753327.6、zl201510460386.9)、酸性(zl201410718610.5)、嗜温耐乙醇(zl201010577713.6、zl201410235451.3)、高表达(zl201010170523.2、zl201410037538.x、zl201410037437.2、zl201010565278.5)、耐高糖(zl201210540712.3、zl201210541293.5、zl201710698739.8、zl201710366423.9、zl201610095165.0、zl201310224173.7、zl201010248207.2)、耐糖耐酸(zl201710839935.2)、高产耐糖耐酸(zl201710839898.5)、耐高糖耐碱(zl201410668699.9)、高产嗜温耐乙醇(zl201110417104.9)、高活力(zl201110102978.5)、高催化效率(zl201610407183.8、zl201610061066.0、zl201610060603.x、zl201610061593.1)、高耐受性(zl201510175655.7)、持续高效分泌(zl201310187648.x、zl201510626711.4)等特征之一的菌株)，以及筛选产β-葡萄糖苷酶菌株的方法(zl201510903621.5、zl201210127162.2、zl201710279045.0、zl201410075528.5、zl200710114837.9)，β-葡萄糖苷酶纯化方法(zl200710043571.3)，β-葡萄糖苷酶酶活测定方法(zl200910096109.9)，β-葡萄糖苷酶固定化方法(zl201510920113.8、zl201710579688.7、zl201710689763.5、zl201610348992.6、zl201610899746.x、zl201310712037.2、zl201210449928.9、zl201210052838.6、zl201110293398.9、zl200810035950.2、zl201810109984.5)，β-葡萄糖苷酶制备方法(zl201710581264.4、zl201510026295.4、zl201410510836.6、zl201110374822.2、zl200910153807.8、zl200910092695.x、zl201810034473.1)，构建产β-葡萄糖苷酶基因工程菌方法(zl201410126924.6、zl201410699758.9、zl201610285023.0、zl201610838951.5、zl201510172770.9、zl201510658194.9、zl201410801030.2、zl201410801031.7、zl201210017857.5、zl201110221185.5、zl201110301931.1、zl201110034926.9、zl201110132525.7、zl201110266535.x、zl200910092527.0、zl200610025503.x、zl201110120297.1、zl200910029055.4、zl200910159235.4)，及上述所得β-葡萄糖苷酶的编码基因和应用等。通过检索中国学位论文库发现近年来有关β-葡萄糖苷酶酶活性质的论文有很多，其中主要集中于通过基因重组、复合诱变、改良筛选方法、对发酵条件进行优化等方法来提高其酶活以及热稳定性(q55q785、tq925、tq929.2、tq925tq920.1、q939.9、ts261.11、tq925、ts201.25ts201.3、q814、q814.1q936)、葡萄糖耐受性(q949.327.103、q556.2q786)催化效率提高(tq925)、耐热、耐碱及耐部分金属离子的特点(q93-331、s216.2、q949.327.1q943.2、tq925.5、r282.71q556.2)等等。而具有胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶目前尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的首要目的是提供一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

本发明是对β-葡萄糖苷酶的基因(称为bgl1基因)进行定点突变。由绿色木霉(trichodermaviride)中获得的β-葡萄糖苷酶，已经被测序，genbank登录号为fj882071.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为acs93768(seqidno.1)。

本发明基于酶促反应过渡以及计算生物学的方法筛选，获得了一株具有胰蛋白酶抗性提高的β-葡糖糖苷酶的突变体，其对胰蛋白酶的抗性比野生型bgl1提高2倍以上，其半衰期比野生型酶延长了50min，其他酶学性质与野生型酶基本一致(酶解条件为ph为7.6，浓度为0.175mg/ml的胰蛋白酶在37℃条件下消化0.25mg/ml的bgl1)，命名为bgl1^{r98q；l586s；r676p}。

根据本发明所述的一种定点突变改造的β-葡萄糖苷酶，是由氨基酸序列为seqidno.1的来源于绿色木霉(trichodermaviride)的β-葡萄糖苷酶中制造多个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶，所述的氨基酸取代是第98、586和676位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的β-葡萄糖苷酶的进一步特征，所述在第98位的氨基酸取代是用谷氨酰胺取代精氨酸；在586位的氨基酸取代是用丝氨酸取代赖氨酸；在第676位的氨基酸取代是用脯氨酸取代精氨酸；所述的定点突变改造的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列为seqidno.2。

本发明所述的作用于纤维二糖和短链纤维寡糖的突变体β-葡萄糖苷酶(mbgl1)，用人工胰液(ph为7.6，浓度为0.175mg/ml的胰蛋白酶在37℃条件下消化0.25mg/ml的bgl1)处理，其对胰蛋白酶的抗性比野生型bgl1提高2倍以上，其半衰期比野生型酶延长了50分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

进一步地，本发明提供了一种dna分子，其编码本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

优选地，本发明所述的dna分子的核苷酸序列为seqidno.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的dna分子。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的dna分子，或者含有本发明所述的载体。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。

本发明还提供了本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶的生产方法，包括：在适于β-葡萄糖苷酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的β-葡萄糖苷酶。

当本发明所述的dna分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的dna分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸等。

本发明优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母分泌表达。

本发明的另一个方面是提供了所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶的用途，具体是所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。

附图说明

图1是sds-page蛋白电泳图，黑色箭头所指处为目的蛋白条带，大小为78.4kd左右；泳道1为野生型β-葡萄糖苷酶蛋白；泳道2为不含目的基因的野生型毕赤酵母smd1168对照样品；泳道3为mbgl1^{r98q；l586s/r676p}为突变体β-葡萄糖苷酶蛋白。

图2是本发明所述的野生型bgl1与突变体mbgl1^{r98q；l586s/r676p}的酶活测定标准曲线。

图3是本发明所述的野生型bgl1与突变体mbgl1^{r98q；l586s/r676p}蛋白在胰蛋白酶处理前和经胰蛋白酶处理后的残留蛋白扫描结果图。

图4是野生型bgl1与突变体mbgl1^{r98q；l586s/r676p}蛋白在胰蛋白酶处理前和经胰蛋白酶处理后的酶比活力测定结果图。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“bgl1^wt”表示野生型β-葡萄糖苷酶，其基因以斜体bgl1^wt表示。

“mbgl1^{r98q；l586s；r676p}”表示突变体β-葡萄糖苷酶，其基因以斜体mbgl1^{r98q；l586s；r676p}表示。

实施例1：β-葡萄糖苷酶基因的合成

本发明采用绿色木霉来源的野生型β-葡萄糖苷酶基因(genbank注册号：fj882071.1),由苏州金唯智生物技术有限公司合成(其它具有全基因合成的商业公司同样可以完成)。

实施例2：β-葡萄糖苷酶(bgl1)与克隆载体taox+pght+pb的连接

1.将bgl1目的基因和克隆载体taox+pght+pb分别用限制性内切酶ecori和spei/xbai于37℃酶切10min，酶切条件如下：

2.酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个目的片段，用t4dna连接酶连接，连接体系如下：

用连接酶16℃连接12h，连接产物转化dh5a感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用ecori和psti双酶切后跑电泳结果显示有7.0kb和3.8kb两条带，表明连接成功，通过dna测序，确定为β-葡萄糖苷酶基因。

实施例3：基因片段paox+ss1与克隆载体m+taox+pght+pb连接

1.基因片段paox+ss1由本研究所保存的克隆载体paox+ss1+pb中调出，使用ecori和spei内切酶双酶切并纯化回收获得；

2.克隆载体m+taox+pght+pb由实施例2获得，基因片段paox+ss1与克隆载体m+taox+pght+pb的连接方法同实施例2。

实施例4：定点突变

经过利用酶促反应过渡态理论和蛋白分子之间相互识别的原理，以及计算化学的方法在discoverystudio4.5软件平台上进行，发明人确定对第98位、第586位、第676位氨基酸进行定点突变，突变后的突变体mbgl1^{r98q；l586s/r676p}基因由苏州金唯智生物技术有限公司合成。也可以由其它具有全基因合成的商业公司完成基因合成。

实施例5：野生型bgl1^wt与突变体mbgl1^{r98q；l586s；r676p}基因分别整合毕赤酵母基因组及重组蛋白的分泌表达

为了将表达盒在毕赤酵母染色体上整合，用限制性内切酶xbai和spei将表达盒paox+ss1+m+taox+pght从paox+ss1+m+taox+pght+pb上切下来并用试剂盒纯化回收。本实验的受体菌为毕赤酵母smd1168，电转化后使用md平板进行初步筛选，然后挑取md平板上的单克隆于七叶苷-柠檬酸铁筛选培养基中培养1天测量菌落直径d1和黑色特征圈的直径d2。计算r＝d1/d2的值，筛选r值较小的菌株。

实施例6：野生型bgl1^wt及突变体mbgl1^{r98q；l586s；r676p}重组蛋白的sds-page电泳检测

(1)配置10ml10％的分离胶，混匀后用微量移液器往玻璃板中灌胶，直直到离短玻板顶部2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40min后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；

(2)配置4ml5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的柱子同时应避免产生气泡，聚合30min待胶凝固；

(3)装好电泳槽，将槽内灌电泳液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去样品梳子；

(4)依次点样，点样量不宜过多，15ul每孔为合适；

(5)电泳开始时先设置120v跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为180v继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳(目的条带对应于maker的相应条带，事先可获知)；

(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝r-250染色30min后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可；

(7)凝胶成像并观察结果。sds-page蛋白电泳结果如图1所示。

实施例7：电泳检测野生型bgl1^wt及突变体mbgl1^{r98q；l586s；r676p}重组蛋白的胰蛋白酶抗性检测

将野生bgl1^wt和mbgl1^{r98q；l586s；r676p}突变体用人工胰液(ph为7.6，浓度为0.175mg/ml的胰蛋白酶在37℃条件下消化0.25mg/ml的bgl1^wt或mbgl1^{r98q；l586s；r676p})处理。分别在0、10、20、30、40、50、60min取出15ul并加入5ul蛋白电泳缓冲液终止消化并立即煮沸5min，然后进行sds-page电泳检测残留的野生bgl1^wt和mbgl1^{r98q；l586s；r676p}突变体的蛋白量，评价它们对胰蛋白酶抗性理性的效果。结果如图3所示。

实施例8：活性检测野生型bgl1^wt及突变体mbgl1^{r98q；l586s；r676p}重组蛋白的胰蛋白酶抗性检测

1.将野生bgl1^wt和mbgl1^{r98q；l586s；r676p}突变体用人工胰液(ph为7.6，浓度为0.175mg/ml的胰蛋白酶在37℃条件下消化0.25mg/ml的bgl1^wt或mbgl1^{r98q；l586s；r676p})处理60min，立即煮沸5min。然后进行酶活测定。比较野生bgl1^wt和mbgl1^{r98q；l586s；r676p}突变体蛋白在处理前后的比酶活。

2.酶活力测定：

酶活力定义：以5mmol/lpnpg溶液为底物，在ph为4.5、50℃条件下，每分钟催化底物产生1umol的pnp所需的酶量为1个酶活力单位(u/ml)。

酶比活力定义：将每毫克蛋白质中的酶的单位数，定义为比活力(u/mg)。

(1)用ph为4.5的0.2mna2hpo4-0.1m柠檬酸缓冲液配置5mmol/lpnpg溶液。

(2)向96孔板中加入40ul的0.2mna2hpo4-0.1m柠檬酸缓冲液，再加入75ul的5mmol/lpnpg溶液，金属浴50℃预热5min。

(3)向96孔板加入10ul适当稀释的酶液，50℃反应30min。以灭活的酶液作为对照组，每组三个重复。

(4)加入75ul的1mna2co3溶液(增强显色并终止反应)。室温静置5min。

(5)在od405下测定吸光值。

(6)根据已制作的标准曲线计算pnp的浓度，再根据活力公式计算酶活力。

(7)酶活力计算公式：

其中，c为代入标曲的pnp浓度(μmol/ml)；v1为反应体积(ml)；n为稀释倍数；v2为所用酶量(ml)；t为酶反应时间。

(8)酶比活力计算公式：

其中，u为酶总活力(u/ml)；m为样品中蛋白重量(mg)。

酶活测定标准曲线如图2所示，将1m碳酸钠溶液和0.1m柠檬酸溶液以1：2的比例混匀，作为混合液。将已配置好的0.01m的pnp溶液稀释10倍，得到0.001m的pnp标准液。按下表1依次量取试剂，混匀后测定od405的吸光值。

表1：pnp浓度的标准曲线

酶活测定结果显示，野生型bgl1^wt蛋白胰蛋白酶处理前酶比活为362.3±2.5u/mg，胰蛋白酶处理后残留酶比活为108.7±2.0u/mg；突变体mbgl1^{r98q；l586s；r676p}蛋白胰蛋白酶(人工胰液)处理前酶比活为385.7±2.5u/mg，胰蛋白酶(人工胰液)处理后残留酶比活为308.5±2.2u/mg，比野生型bgl1^wt提高了2.8±0.2倍。测量结果如图4所示。

sequencelisting

<110>暨南大学

<120>一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶

<130>

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>744

<212>prt

<213>绿色木霉(trichodermaviride）

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151015

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