一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于属于食品安全免疫检测领域。

背景技术：

地沟油通常可分为以下几类：一是狭义的地沟油，即将下水道中的油腻漂浮物或者将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜(通称泔水)经过简单加工、提炼出的油；二是劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后产出的油；三是用于油炸食品的油使用次数超过规定要求后，再被重复使用或往其中添加一些新油后重新使用的油。

我国现行的食品卫生标准中规定了油脂产品中各项卫生指标的限量要求，任何一项卫生指标超过限量要求均被视为可能对人体健康造成危害的产品，不能食用。"地沟油"中各项卫生指标严重超过标准中的限量要求，并且含有多种有害物质，长期食用这些不合格的油脂产品会对人体健康造成严重的危害。例如：

(1)折叠酸价和过氧化值超标：酸败油脂中所含的大量过氧化脂质进入人体后，极易袭击细胞膜和酶，使血清抗蛋白酶失去活性，损伤基因导致细胞变异的出现和蓄积。诱发癌症、动脉粥样硬化、细胞的衰老等疾病；(2)折叠溶剂残留超标：地沟油中含有的烷烃、环烷烃、烯烃和芳香烃等化合物以及许多不知名的化学物质和有机溶剂，能对人体的中枢神经有较强的刺激和麻痹作用；(3)折叠重金属污染物含量超标：地沟油中的重金属进入人体后可能引起头痛、头晕、失眠、多梦、乏力、消化不良、消瘦、肝区不适、腹绞痛、贫血等症状。严重的会导致重金属中毒；(4)折叠苯并芘超标：地沟油中的苯并芘具有强致癌作用、致畸胎形成作用；等等。

目前，卫生部公开的地沟油监测方法为：1、凝固点检测法；2、透明度检测法；3、粘度检测法；4、折射力检测法；5、光谱测性检测法。但这些方法或不能具体判断地沟油掺杂含量，或需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测。

而辣椒碱对地沟油“忠贞不渝”，水洗、土吸、真空、高温都无法让他们分离。因此，通过检测辣椒碱的含量来判断地沟油的含量是一种直观简便的有效方法，建立快速简便的辣椒碱检测方法具有重要意义。

辣椒碱的传统检测方法有气质联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和毛细管电泳质谱联用法等，然而，这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对辣椒碱的高效、快速的检测方法。

酶联免疫法(elisa)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测辣椒碱的前提是得到对辣椒碱具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对辣椒碱具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明人尝试通过杂交瘤细胞制备辣椒碱单克隆抗体，但在制备能分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备辣椒碱半抗原和辣椒碱完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；制备出的杂交瘤细胞株是否能分泌出辣椒碱单克隆抗体，还需要进一步验证；分泌出的辣椒碱单克隆抗体特异性、灵敏度如何，也需要进一步验证。

技术实现要素：

本发明的目的是获得一种能分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞株分泌的辣椒碱单克隆抗体对辣椒碱具有较好的特异性和检测灵敏度(ic50值为8.6ng/ml)，可以用于建立辣椒碱的免疫学检测方法，检测食品中辣椒碱的残留。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2017年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14689，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供了上述一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

步骤1：制备辣椒碱半抗原及辣椒碱完全抗原，将获得的辣椒碱完全抗原分别用弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂进行乳化；

步骤2：将分别用弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂进行乳化后的辣椒碱完全抗原通过背部皮下注射，注射进入balb/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂乳化后的辣椒碱完全抗原，加强免疫采用不完全弗氏佐剂乳化后的辣椒碱完全抗原；

步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接elisa检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中辣椒碱抗体含量高的获得免疫的小鼠；

步骤4：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂乳化后的辣椒碱完全抗原再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的辣椒碱完全抗原进行；

步骤5：将进行冲击免疫后的balb/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

所述步骤1中的辣椒碱半抗原的分子式如下：

所述步骤1中的辣椒碱完全抗原的分子式如下：

在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔21天。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲击免疫剂量为25μg/只。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤2、4中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲击免疫；

在本发明的一种实施方式中，所述步骤3中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇(peg4000)法进行的。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的培养基为rpmi-1640培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤5中的亚克隆次数为3次。

本发明提供了上述一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备辣椒碱单克隆抗体方面的应用。

本法明提供了一种辣椒碱半抗原，所述辣椒碱半抗原的分子式如下：

本发明提供了上述一种辣椒碱半抗原的制备方法，所述方法为将化合物1溶于dmf中，得到a液；将化合物2溶于dmf中，得到b液；在冰浴下，将b液逐滴加入a液中进行反应，得到化合物3；将化合物3溶于tfa/ch2cl2中，得到辣椒碱半抗原。

在本发明的一种实施方式中，所述tfa/ch2cl2中，tfa与ch2cl2的体积比为1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将2mol的化合物1溶于3ml的dmf中，得到a液；将1mol的化合物2溶于3ml的dmf中，得到b液；在冰浴下，将b液逐滴加入a液中，于20～30℃下反应12h，得到反应液；将反应液进行真空浓缩除去dmf，得到残余物；将残余物重新溶于ch2cl2中对有机相进行分离，得到有机相；将有机相用水洗涤以后进行干燥以及重结晶，得到化合物3；将化合物3于0℃下溶于tfa/ch2cl2中，得到辣椒碱半抗原；所述tfa/ch2cl2中，tfa与ch2cl2的体积比为1:1。

本发明提供了上述一种辣椒碱半抗原或上述一种辣椒碱半抗原的制备方法在在制备辣椒碱完全抗原、分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株、辣椒碱单克隆抗体方面的应用。

本发明提供了一种辣椒碱完全抗原，所述辣椒碱完全抗原的分子式如下：

本发明提供了上述一种辣椒碱完全抗原的制备方法，所述方法为取辣椒碱半抗原溶于无水dmf中，得到a液；在a液中加入戊二醛溶液进行活化，得到b液；取牛血清白蛋白(bsa)溶解于碳酸盐缓冲液(cbs溶液)中，得到c液；将b液逐滴加入c液中进行反应，得到混合液；分离混合液中的完全抗原和未偶联的小分子半抗原，即得辣椒碱完全抗原；

所述辣椒碱半抗原的分子式如下：

在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8.4mg的辣椒碱半抗原溶于1ml的无水dmf中，得到a液；在a液中加入15μl质量百分浓度为25％的戊二醛溶液，于20～30℃下活化20min，得到b液；取8mg的牛血清白蛋白(bsa)溶解于2ml摩尔浓度为0.05mol/l、ph为9.6的碳酸盐缓冲液(cbs溶液)中，得到c液；将b液逐滴加入c液中进行反应，于20～30℃下反应12h，得到混合液；将混合液装入透析袋中，于4℃透析三天，通过透析分离混合液中的完全抗原和未偶联的小分子半抗原，即得辣椒碱完全抗原。

本发明提供了上述一种辣椒碱完全抗原或上述一种辣椒碱完全抗原的制备方法在制备分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株、辣椒碱单克隆抗体方面的应用。

本发明提供了一种辣椒碱单克隆抗体，所述辣椒碱单克隆抗体是由保藏编号为cgmccno.14689的杂交瘤细胞株分泌获得的。

本发明提供了上述一种辣椒碱单克隆抗体的制备方法，所述方法为取balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为cgmccno.14689的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml，7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶保藏编号为cgmccno.14689的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

本发明提供了上述一种辣椒碱单克隆抗体或上述一种辣椒碱单克隆抗体的制备方法在识别辣椒碱方面的应用。

本发明提供了应用上述一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种辣椒碱完全抗原或上述一种辣椒碱单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。

有益效果：

(1)本发明获得的辣椒碱单克隆抗体，对辣椒碱有较好的检测灵敏度和特异性(ic50值为8.6ng/ml)；

(2)本发明对辣椒碱完全抗原及其合成思路进行了改进，使得其可用于获得辣椒碱单克隆抗体细胞株；

(3)本发明获得的辣椒碱单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。

生物材料保藏

一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.14689，保藏日期为：2017年09月05日。

附图说明

图1为本发明辣椒碱半抗原的合成过程；

图2为本发明辣椒碱完全抗原的合成过程；

图3为本发明辣椒碱单克隆抗体对辣椒碱的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中涉及的培养基如下：

rpmi-1640培养基：胎牛血清10％、l-精氨酸290mg/l、硝酸钙100mg/l、l-门冬酰胺50mg/l、无水硫酸镁48.84mg/l、l-门冬氨酸20mg/l、无水磷酸二氢钠676.13mg/l、l-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/l、氯化钾400mg/l、l-谷氨酸20mg/l、氯化钠6000mg/l、甘氨酸10mg/l、葡萄糖2000mg/l、l-组氨酸15mg/l、还原谷胱甘肽1mg/l、l-羟脯氨酸20mg/l、酚红5mg/l、l-异亮氨酸50mg/l、l-谷氨酰胺300mg/l、l-亮氨酸50mg/l、生物素0.2mg/l、l-赖氨酸盐酸盐40mg/l、d-泛酸钙0.25mg/l、l-甲硫氨酸15mg/l、叶酸1mg/l、l-苯丙氨酸15mg/l、i-肌醇35mg/l、l-脯氨酸20mg/l、l-烟酰胺1mg/l、l-丝氨酸30mg/l、氯化胆碱3mg/l、l-苏氨酸20mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、l-色氨酸5mg/l、核黄素0.2mg/l、l-酪氨酸23.19mg/l、盐酸硫胺素1mg/l、l-缬氨酸20mg/l、维生素b120.005mg/l、对氨基苯甲酸1mg/l。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(cbs)：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液(pbs)：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05％吐温20的pbs；

tmb显色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按5：1混合即为tmb显色液，现用现混。

实施例1：辣椒碱半抗原的合成

合成路径如图1。

将2mol的化合物1溶于3ml的dmf中，得到a液；将1mol的化合物2溶于3ml的dmf中，得到b液；在冰浴下，将b液逐滴加入a液中，于20～30℃下反应12h，得到反应液；将反应液进行真空浓缩除去dmf，得到残余物；将残余物重新溶于ch2cl2中对有机相进行分离，得到有机相；将有机相用水洗涤以后进行干燥以及重结晶，得到化合物3；将化合物3于0℃下溶于tfa/ch2cl2中，得到辣椒碱半抗原；所述tfa/ch2cl2中，tfa与ch2cl2的体积比为1:1。

实施例2：辣椒碱完全抗原的合成

合成路径如图2。

取8.4mg的辣椒碱半抗原溶于1ml的无水dmf中，得到a液；在a液中加入15μl质量百分浓度为25％的戊二醛溶液，于20～30℃下活化20min，得到b液；取8mg的牛血清白蛋白(bsa)溶解于2ml摩尔浓度为0.05mol/l、ph为9.6的碳酸盐缓冲液(cbs溶液)中，得到c液；将b液逐滴加入c液中进行反应，于20～30℃下反应12h，得到混合液；将混合液装入透析袋中，于4℃透析三天，通过透析分离混合液中的完全抗原和未偶联的小分子半抗原，即得辣椒碱完全抗原。

实施例3：辣椒碱包被原的合成

取8.4mg的辣椒碱半抗原溶于1ml的无水dmf中，得到a液；在a液中加入15μl质量百分浓度为25％的戊二醛溶液，于20～30℃下活化20min，得到b液；取8mg的卵清蛋白(ova)溶解于2ml摩尔浓度为0.05mol/l、ph为9.6的碳酸盐缓冲液(cbs溶液)中，得到c液；将b液逐滴加入c液中进行反应，于20～30℃下反应12h，得到混合液；将混合液装入透析袋中，于4℃透析三天，通过透析分离混合液中的完全抗原和未偶联的小分子半抗原，即得辣椒碱完全抗原。

实施例4：分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫的获得

将辣椒碱完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

2、细胞融合

在冲刺免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10％fbs(胎牛血清)rpmi-1640培养基在5％co2培养箱中，融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1～4×10⁷，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1ml的peg1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mlrpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mlrpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。

3、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用ic-elisa法筛选出阳性细胞孔，第二步选用辣椒碱为标准品，用ic-elisa法对阳性细胞进行抑制效果测定。

选择对辣椒碱标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。

按上述方法进行三次亚克隆，最终获得辣椒碱单克隆抗体细胞株。

实施例5：辣椒碱单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶辣椒碱杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01m的pbs溶液(ph7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用间接竞争elisa，测得辣椒碱单克隆抗体的ic50值为8.6ng/ml，说明对辣椒碱有很好的灵敏度，可用于辣椒碱免疫分析检测。

实施例6：辣椒碱单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于辣椒碱的elisa添加回收试验，具体步骤如下：

(1)将用碳酸盐缓冲液(cbs)稀释好的浓度为0.3μg/ml的包被原包被96孔酶标板，每孔100μl，37℃包被2h后，用pbst洗液洗板三次，每次每孔200μl，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的cbs进行封闭，每孔200μl，37℃封闭2h，用pbst洗液洗板三次，每次每孔200μl，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(pbs)分别配置0、1、2、5、10、20、50、100μg/l的辣椒碱标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μl，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μl以1:32000稀释的辣椒碱单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μl用含0.1％明胶的pbs以1:3000稀释的hrp标记的羊抗鼠igg二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μl的tmb显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μl2m的h2so4终止液，450nm测吸光值；

(6)根据得到的吸光值及加标数据，利用origin作图软件进行标准曲线的绘制(标准曲线如图3，此标准曲线的r2＝0.995，检测限即抑制率20％-80％对应的加标量为2.83-26.7ng/ml)；

(7)添加回收及样品前处理：

选择食用油为检测样品。

首先，称取两份2.0g食用油，分别加入10ng、20ng和40ng辣椒碱标准品，混匀，加入10ml的浓度为0.1m的tris-hcl(ph8.4)与10％的甲醇溶液，高速均质2min提取，静置5min后，取200μl上清液用pbs稀释4倍后，作为elisa样品提取液。

采用间接竞争elisa进行添加回收试验，其回收率分别为88％，87％，91％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。