一种防治烟草靶斑病的枯草芽孢杆菌及其菌剂的制作方法

本发明涉及微生物技术领域。更具体地，涉及一种防治烟草靶斑病的枯草芽孢杆菌及其菌剂。

背景技术：

烟草靶斑病(tobaccotargetspot)是近年来国内外新报道的一种烟草叶部暴发流行性病害，对烟草的产量和品质有显著的影响，危害极大。该病害目前的防治方法主要以化学农药为主,但长期使用化学农药，易使病菌产生抗药性，危害更加猖獗；同时也会造成烟叶农药残留的增加和污染环境等问题。因此与环境相容的生物农药研制与开发应用，是缓解和改变化学农药所导致“三r”(residue,resistance,resurgence)问题的有利措施，是促进烟草行业可持续健康发展的重要手段。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种无公害且对烟草靶斑病具有显著防效的枯草芽孢杆菌。

本发明的第二个目的在于提供一种可防治烟草靶斑病的菌剂。

本发明的第三个目的在于提供一种防治烟草靶斑病菌剂的制备方法。

为达到上述第一个目的，本发明提供一种防治烟草靶斑病的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)kb-01，其保藏编号为cgmccno.12589。

为达到上述第二个目的，本发明提供一种菌剂，所述菌剂由如上所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)kb-01制备而成。

优选地，所述菌剂的使用浓度为1.8×10⁸cfu/ml。

为达到上述第三个目的，本发明提供一种如上所述的菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

菌种活化：将保藏编号为cgmccno.12589的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)接种于斜面培养基上进行培养；

种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中进行培养，制得种子液；

发酵培养：按6％的接菌量，将所述种子液接入发酵培养基中进行培养，即得枯草芽孢杆菌菌剂。

优选地，所述培养的条件均为28℃条件下培养24h。

优选地，所述斜面培养基的组分及配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水定容至1000ml，ph为7.0～7.5。

优选地，所述种子培养基和发酵培养基的组分及配比均为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水定容至1000ml，ph为7.0～7.5。

本发明还提供一种如上所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)kb-01或如上所述的菌剂在制备防治烟草靶斑病药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

经过试验证明，本发明提供的所述枯草芽孢杆菌kb-01及其菌剂对烟草靶斑病的防治效果高达76.18％，显著高于目前防治烟草靶斑病的当家生物农药井冈霉素，与化学农药菌核净的防治效果持平，因此kb-01的推广应用有望代替化学农药防治烟草靶斑病，可以保护环境、降低农药残留，显著提高了烟叶的安全性，具有良好的生物农药开发前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明实施例1中枯草芽孢杆菌kb-01的电镜照片；

图2本发明实施例3中枯草芽孢杆菌kb-01对烟草靶斑病的室内抑菌照片。

具体实施方式

烟草靶斑病(tobaccotargetspot)是近年来国内外新报道的一种烟草叶部暴发流行性病害，对烟草的产量和品质有显著的影响，危害极大。本发明提供的枯草芽孢杆菌kb-01及由其制备的菌剂对烟草靶斑病有显著的抑制作用，具有良好的生物农药开发前景。

一方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)kb-01，其保藏编号为cgmccno.12589，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2016年6月2日。

另一方面，本发明还提供一种枯草芽孢杆菌菌剂，所述菌剂由如上所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)kb-01制备而成。

所述菌剂用于抑制烟草靶斑病的使用浓度优选为1.8×10⁸cfu/ml，在该使用浓度下，抑制烟草靶斑病的的效果最显著。需要说明的是，其它浓度的菌剂也可以在一定程度上抑制烟草靶斑病。

本发明还提供一种如上所述的菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

菌种活化：将保藏编号为cgmccno.12589的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)接种于斜面培养基上进行培养；

种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中进行培养，制得种子液；

发酵培养：按6％的接菌量，将所述种子液接入发酵培养基中进行培养，即得枯草芽孢杆菌菌剂。

优选地，所述培养的条件均为28℃条件下培养24h，该条件下菌体的生长状态最佳。本领域技术人员也可以在实际操作过程中选用其它培养条件，能成功培养菌体即可。

进一步地，本发明中用于菌株活化的斜面培养基的组分及配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水定容至1000ml，ph为7.0～7.5。本发明中用于种子培养的种子培养基和用于发酵培养的发酵培养基的组分及配比均为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水定容至1000ml，ph为7.0～7.5。本领域技术人员应当理解的是，此处斜面培养基、种子培养基和发酵培养基的组分和配比关系也可以根据实际情况进行适当调整和选择，并不局限于本文中列举的方案。

本发明还提供一种如上所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)kb-01或如上所述的枯草芽孢杆菌菌剂在制备防治烟草靶斑病药物中的应用。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

一、枯草芽孢杆菌kb-01获得与鉴定

本发明所述的枯草芽孢杆菌kb-01，2016年6月在黑龙江省牡丹江市宁安县范家乡烟田烟株根际取土样2g在平面培养基中进行培养4d，稀释后在平面培养基中进行涂布，再培养4d后挑取单菌落在平面培养基中划线，纯化后斜面培养保存。

如附图1所示，本菌为革兰氏阳性菌，菌落圆形或不规则形，表面粗糙不透明，污白色，lb液体培养基培养表面形成污白色皱醭。单个细胞大小0.7～0.7um×2～3.5um，周生鞭毛，可游动，芽孢0.6～0.9um×1.0～1.5um，椭圆到柱状，在ph值低于5.5及大于8.0的条件下细菌几乎不能生长，最适ph值为6.5。最佳培养基成份：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，最适生长温度28℃。

本发明所述的枯草芽孢杆菌kb-01其16srdna序列如序列表中的seqidno：1所示。

二、枯草芽孢杆菌kb-01的保藏

通过上述鉴定结果，确认菌株kb-01为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的一个株系，已于2016年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为cgmccno.12589。

实施例2

枯草芽孢杆菌kb-01的培养

(1)斜面培养：培养时间48h，培养温度28℃，培养基成分(1000ml)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，ph为7，121℃下高温蒸汽灭菌30min。

(2)种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养基中，28℃摇菌24h，转速200rpm，得到种子液。种子培养基成分(1000ml)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，ph为7.0，121℃下高温蒸汽灭菌30min。

(3)发酵：按5％的接种量，将上述获得的种子液接入发酵培养基中，28℃振荡培养48h，转速150rpm，得到枯草芽孢杆菌发酵液，即本发明所述的菌剂。发酵培养基配方同种子培养基。

实施例3

枯草芽孢杆菌kb-01对烟草靶斑病菌的室内抑菌试验

平面培养基制作：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水定容至1000ml，ph为7.0～7.5，121℃下高温蒸汽灭菌30min，倒入备好的消毒培养皿中待用。

处理及方法：

a：培养皿四周挑接四块烟草靶斑病病菌菌块，中心一点挑接kb-01菌株；

cka：培养皿四周挑放四块烟草靶斑病病菌菌块，中央一点空白；

b：培养皿四周挑放四块kb-01菌株，中央一点挑接烟草靶斑病病菌菌块；

ckb：中央一点挑接烟草靶斑病病菌菌块，培养皿四周空白。

试验设置三次重复。

调查方法：将上述培养皿置28℃培养箱中保存72h，7d后观察抑菌效果,见图2，并测抑菌带宽度。

试验结果：

如图2所示，在没有接种kb-01菌的情况下(见图2b和图2d)四周四点接种的和中心一点接种的靶斑病菌都长满了培养皿，而中心一点接种kb-01菌株(见图2a)后，四周的靶斑病菌的扩展受到限制，抑菌带宽度平均6cm，四周四点接种kb-01菌株的(见图2c)，中心的靶斑病病菌的扩展也受到限制，抑菌带宽度平均6cm。可见kb-01菌能够较好地抑制烟草靶斑病病菌的生长，可以进行下一步的田间防效试验。

实施例4

枯草芽孢杆菌kb-01(cgmccno.12589)对烟草靶斑病田间防效试验

接种靶斑病菌液的制配：取已培养靶斑病病原菌的培养基10g(牡丹江烟草科学研究所纯化保存)，切碎放入500mlna灭菌水中，接种前30min配制待用。

接种生防菌枯草芽孢杆菌kb-01发酵液的制配：挑取少许枯草芽孢杆菌kb-01放入装有500ml种子培养基的三角瓶中，将三角瓶放置到恒温振荡培养箱中28℃震荡培养24h，接种前30min配制成浓度为3×10⁸cfu/ml的菌悬液备用。试验设计：设三个处理，一个培养液，一个空白对照，四次重复，12个小区，每小区100株烟草。

处理a：枯草芽孢杆菌kb-01发酵液(浓度约16.0×108cfu/ml)

处理b:化学农药菌核净杀菌剂,稀释500倍喷雾

处理c:生物农药井冈霉素，稀释800倍喷雾

处理d:培养液喷雾

处理e:清水喷雾

试验方法：先采用喷雾法实施a、b、c、d、e五个处理，间隔24h，连续实施二次后，再间隔24h喷雾法接种靶斑病菌液。

调查方法：接种7d后调查各小区的病叶率。

试验结果见表1

表1.枯草芽孢杆菌kb-01对靶斑病防治效果(试验地点：林口莲花乡)

调查结果显示枯草芽孢杆菌kb-01对烟草靶斑病的防治效果高达79.86％；目前常用的生物农药多抗霉素对烟草靶斑的防治效果只有31.57％，极显著低于kb-01的防治效果；化学农药代森锰锌杀菌剂对烟草靶斑病的防治效果达79.22％，与kb-01持平。试验结果表明枯草芽孢杆菌kb-01对烟草靶斑病的防治效果显著高于目前防治烟草靶斑病的当家生物农药多抗霉素，与化学农药代森锰锌杀菌剂的防治效果持平，因此kb-01的推广应用有望代替化学农药防治烟草靶斑病，保护了环境、降低了农残，提高了烟叶安全性，应用前景广阔。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110>中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所

<120>一种防治烟草靶斑病的枯草芽孢杆菌及其菌剂

<130>jlc18i0166e

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1402

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

<400>1

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