一种microRNA快速检测的方法与流程

本发明涉及一种microrna快速检测方法，属于分子生物学和核酸化学领域。

背景技术：

microrna(mirna)为非编码蛋白的rna，其长度约为19～25个碱基，广泛存在于植物、病毒、哺乳动物当中。mirnas参与生命活动各个层次的调节，包括细胞增殖、细胞死亡、肿瘤发生和哺乳动物细胞生长中等。恶性肿瘤等重大疾病的发生和发展与人体内mirna的异常表达密切相关，使mirna成为疾病诊断的标志物，但mirna序列短序列相似性高，含量低，因此发展一种灵敏度高、选择性好的mirna检测方法十分有必要。

近年来，纳米金在生物分析的应用中得到了广泛的关注。由于金纳米具有良好的生物相容性，巯基化寡核苷酸可以大量修饰在金纳米表面，形成金纳米探针，可以用来对核酸分子进行检测，其中的检测方法包括扫描检测、表面增强拉曼散射、光散射以及目视比色法等，其中比色法，因其操作简单，实验成本低被广泛应用于生物分析有关领域中，取得了不错的成效。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种microrna快速检测方法。

具体步骤为：

(1)金纳米粒子的制备：用移液枪移取100ml质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液于250毫升的圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热至煮沸后，快速加入1.5ml质量百分比浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟，当溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色时，停止加热，在搅拌状态下冷却至室温，得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

(2)金纳米标记probe1：移取60μl浓度为10μmol/lprobe1与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时；接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe1溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe1为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-ctactacctcatttttttttttttttttttt-3`。

(3)金纳米标记probe2：移取60μl浓度为10μmol/lprobe2与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时；接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe2溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe2为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-aactatacaactttttttttttttttttttt-3`。

(4)杂交反应：取75μlaunps-probe1溶液、75μlaunps-probe2溶液以及20μl浓度为1.5pmol/l～78nmol/l的mirna震荡混合均匀，将混合液置于温度为30～45℃的水浴锅中恒温孵育5～40分钟,将杂交液放置室温下下加入85μl浓度为0.3～3.6mol/l的nacl溶液，使杂交液的最终盐浓度达到0.1～1.2mol/l，最后置于冰箱中冷冻10～70分钟。

(5)检测：将冷冻后的杂交混合液置于室温下解冻到常温状态，使用数码相机拍照做颜色对比，最后使用紫外可见光谱仪对溶液进行检测，分别在526nm和700nm出现特征峰；记录浓度分别为1.5pmol/l～78nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

(6)方法的特异性：分别取20μl与目标物mirna-7a同种类的序列终浓度为7.8nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤(2)～(4)进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、7.8nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g的紫外光谱。

上述mirna-7a的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguauaguu-3′，mirna-7d的碱基序列为：5′-agagguaguagguugcauagu-3′，mirna-7e的碱基序列为：5′-ugagguaggagguuguauagu-3′，mirna-7c的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguaugguu-3′，mirna-7g的碱基序列为5′-ugcgguaguaguuuguacagua-3′。。

本发明方法的优点如下：

1、使用核酸修饰纳米金比色法，检测方法简单，操作简便，无需专业人员即可进行测试；

2、反应环境温和无污染，实现了绿色化检测，该生物传感器制作成本低，符合产业化低廉的要求；

3、具有较高的选择性和特异性，能够很好地区分单碱基错配序列和非互补序列；

4、在没有任何放大信号的步骤的前提下，其检测下限达到了1.5pmol/l，灵敏度高。

附图说明

图1为本发明的原理图。

图2为本发明实施例1中的杂交时间优化图。

图3为本发明实施例2中的杂交温度优化图。

图4为本发明实施例3中的氯化钠浓度优化图。

图5为本发明实施例4中冷冻时间优化图。

图6为本发明实施例5中方法检测标准曲线图。

图7为本发明实施例5中方法的特异性图。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做详细说明。

实施例1：

(1)金纳米粒子的制备：用移液枪移取100ml质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液于250毫升的圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热至煮沸后，快速加入1.5ml质量百分比浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟，当溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色时，停止加热，在搅拌状态下冷却至室温。得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

(2)金纳米标记probe1：移取60μl浓度为10μmol/lprobe1与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe1溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe1为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-ctactacctcatttttttttttttttttttt-3`。

(3)金纳米标记probe2：移取60μl浓度为10μmol/lprobe2与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe2溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe2为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-aactatacaactttttttttttttttttttt-3`。

(4)杂交反应：取75μlaunps-probe1溶液、75μlaunps-probe2溶液以及20μl浓度为7.8nmol/l的mirna-7a震荡混合均匀，将混合液置于温度为42℃的水浴锅中分别恒温孵育5、10、15、20、30、40分钟,将杂交液放置室温下下加入85μl浓度为3mol/l的nacl溶液，使杂交液的最终盐浓度达到1mol/l，最后置于冰箱中冷冻60分钟。

(5)检测：将冷冻后的杂交混合液置于室温下解冻到常温状态，使用数码相机拍照做颜色对比，最后使用紫外可见光谱仪对溶液进行检测，分别在526nm和700nm出现特征峰；记录浓度为7.8nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

(6)方法的特异性：分别取20μl与目标物mirna-7a同种类的序列终浓度为7.8nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤(2)～(4)进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、7.8nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g的紫外光谱。

上述mirna-7a的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguauaguu-3′，mirna-7d的碱基序列为：5′-agagguaguagguugcauagu-3′，mirna-7e的碱基序列为：5′-ugagguaggagguuguauagu-3′，mirna-7c的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguaugguu-3′，mirna-7g的碱基序列为5′-ugcgguaguaguuuguacagua-3′。

实施例2：

(1)金纳米粒子的制备：用移液枪移取100ml质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液于250毫升的圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热至煮沸后，快速加入1.5ml质量百分比浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟，当溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色时，停止加热，在搅拌状态下冷却至室温。得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

(2)金纳米标记probe1：移取60μl浓度为10μmol/lprobe1与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe1溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe1为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-ctactacctcatttttttttttttttttttt-3`。

(3)金纳米标记probe2：移取60μl浓度为10μmol/lprobe2与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe2溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe2为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-aactatacaactttttttttttttttttttt-3`。

(4)杂交反应：取75μlaunps-probe1溶液、75μlaunps-probe2溶液以及20μl浓度为7.8nmol/l的mirna-7a震荡混合均匀，将混合液置于温度分别为30、33、36、39、42、45℃的水浴锅中恒温孵育15分钟,将杂交液放置室温下下加入85μl浓度为3mol/l的nacl溶液，使杂交液的最终的盐浓度达到1mol/l，最后置于冰箱中冷冻60分钟。

(5)检测：将冷冻后的杂交混合液置于室温下解冻到常温状态，使用数码相机拍照做颜色对比，最后使用紫外可见光谱仪对溶液进行检测，分别在526nm和700nm出现特征峰；记录浓度为7.8nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

(6)方法的特异性：分别取20μl与目标物mirna-7a同种类的序列终浓度为7.8nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤(2)～(4)进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、7.8nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g的紫外光谱。

上述mirna-7a的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguauaguu-3′，mirna-7d的碱基序列为：5′-agagguaguagguugcauagu-3′，mirna-7e的碱基序列为：5′-ugagguaggagguuguauagu-3′，mirna-7c的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguaugguu-3′，mirna-7g的碱基序列为5′-ugcgguaguaguuuguacagua-3′。

实施例3：

(1)金纳米粒子的制备：用移液枪移取100ml质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液于250毫升的圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热至煮沸后，快速加入1.5ml质量百分比浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟，当溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色时，停止加热，在搅拌状态下冷却至室温。得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

(2)金纳米标记probe1：移取60μl浓度为10μmol/lprobe1与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe1溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe1为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-ctactacctcatttttttttttttttttttt-3`。

(3)金纳米标记probe2：移取60μl浓度为10μmol/lprobe2与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe2溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe2为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-aactatacaactttttttttttttttttttt-3`。

(4)杂交反应：取75μlaunps-probe1溶液、75μlaunps-probe2溶液以及20μl浓度为7.8nmol/l的mirna-7a震荡混合均匀，将混合液置于温度为42℃的水浴锅中恒温孵育15分钟,将杂交液放置室温下下加入85μl浓度为0.3、0.9、1.5、2.4、3、3.6mol/l的nacl溶液，使杂交液的最终的盐浓度达到0.1、0.3、0.5、0.8、1、1.2mol/l，最后置于冰箱中冷冻60分钟。

(5)检测：将冷冻后的杂交混合液置于室温下解冻到常温状态，使用数码相机拍照做颜色对比，最后使用紫外可见光谱仪对溶液进行检测，分别在526nm和700nm出现特征峰；记录浓度为7.8nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

(6)方法的特异性：分别取20μl与目标物mirna-7a同种类的序列终浓度为7.8nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤(2)～(4)进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、7.8nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g的紫外光谱。

上述mirna-7a的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguauaguu-3′，mirna-7d的碱基序列为：5′-agagguaguagguugcauagu-3′，mirna-7e的碱基序列为：5′-ugagguaggagguuguauagu-3′，mirna-7c的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguaugguu-3′，mirna-7g的碱基序列为5′-ugcgguaguaguuuguacagua-3′。

实施例4：

(1)金纳米粒子的制备：用移液枪移取100ml质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液于250毫升的圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热至煮沸后，快速加入1.5ml质量百分比浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟，当溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色时，停止加热，在搅拌状态下冷却至室温。得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

(2)金纳米标记probe1：移取60μl浓度为10μmol/lprobe1与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe1溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe1为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-ctactacctcatttttttttttttttttttt-3`。

(3)金纳米标记probe2：移取60μl浓度为10μmol/lprobe2与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe2溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe2为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-aactatacaactttttttttttttttttttt-3`。

(4)杂交反应：取75μlaunps-probe1溶液、75μlaunps-probe2溶液以及20μl浓度为1.5pmol/l的mirna-7a震荡混合均匀，将混合液置于温度为40℃的水浴锅中恒温孵育15分钟,将杂交液放置室温下下加入85μl浓度为0.3mol/l的nacl溶液，使杂交液的最终的盐浓度达到0.1mol/l，最后置于冰箱中冷冻60分钟。

(5)检测：将冷冻后的杂交混合液置于室温下解冻到常温状态，使用数码相机拍照做颜色对比，最后使用紫外可见光谱仪对溶液进行检测，分别在526nm和700nm出现特征峰；记录浓度分别为1.5pmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

(6)方法的特异性：分别取20μl与目标物mirna-7a同种类的序列终浓度为7.8nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤(2)～(4)进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、7.8nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g的紫外光谱。

上述mirna-7a的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguauaguu-3′，mirna-7d的碱基序列为：5′-agagguaguagguugcauagu-3′，mirna-7e的碱基序列为：5′-ugagguaggagguuguauagu-3′，mirna-7c的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguaugguu-3′，mirna-7g的碱基序列为5′-ugcgguaguaguuuguacagua-3′。

实施例5：

(1)金纳米粒子的制备：用移液枪移取100ml质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液于250毫升的圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热至煮沸后，快速加入1.5ml质量百分比浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟，当溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色时，停止加热，在搅拌状态下冷却至室温。得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

(2)金纳米标记probe1：移取60μl浓度为10μmol/lprobe1与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe1溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe1为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-ctactacctcatttttttttttttttttttt-3`。

(3)金纳米标记probe2：移取60μl浓度为10μmol/lprobe2与60μl含10mmol/l三(2-羧乙基)膦(tcep)浓度为10mmol/lph5.8磷酸盐缓冲溶液(pbs)中混合活化2小时，活化完毕后加入1ml步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时。接着分别往里加入11.3μl质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μl浓度为0.1mol/lph7.4pbs溶液，使其最终浓度为10mmol/l，再加入66.16μl浓度为2mol/lnacl溶液，使其最终浓度为0.1mol/l。在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1ml含0.1mol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4pbs溶液中，震荡均匀，得到的aunps-probe2溶液在4℃下避光储存备用。

所述probe2为巯基修饰的dna片段，其碱基序列为：5`-aactatacaactttttttttttttttttttt-3`。

(4)杂交反应：取75μlaunps-probe1溶液、75μlaunps-probe2溶液以及20μl终浓度分别为1.5pmol/l、3.9pmol/l、7.8pmol/l、39.2pmol/l78.4pmol/l、784.3pmol/l、7.8nmol/l、7.8nmol/l的mirna-7a震荡混合均匀，将混合液置于温度为42℃的水浴锅中恒温孵育15分钟,将杂交液放置室温下下加入85μl浓度为3mol/l的nacl溶液，使杂交液的最终盐浓度达到1mol/l，最后置于冰箱中冷冻分别60分钟。

(5)检测：将冷冻后的杂交混合液置于室温下解冻到常温状态，使用数码相机拍照做颜色对比，最后使用紫外可见光谱仪对溶液进行检测，分别在526nm和700nm出现特征峰；记录浓度分别为1.5pmol/l、3.9pmol/l、7.8pmol/l、39.2pmol/l78.4pmol/l、784.3pmol/l、7.8nmol/l、7.8nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

(6)方法的特异性：分别取20μl与目标物mirna-7a同种类序列终浓度为7.8nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤(2)～(4)进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、7.8nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7c、mirna-7g的紫外光谱。

上述mirna-7a的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguauaguu-3′，mirna-7d的碱基序列为：5′-agagguaguagguugcauagu-3′，mirna-7e的碱基序列为：5′-ugagguaggagguuguauagu-3′，mirna-7c的碱基序列为：5′-ugagguaguagguuguaugguu-3′，mirna-7g的碱基序列为5′-ugcgguaguaguuuguacagua-3′。

如图1所示，制备两个金纳米探针，当目标物mirna-7a存在的情况下，两个探针与目标物杂交形成三明治结构，杂交混合液伴随着从酒红色到紫色的颜色变化，说明白杂交成功，产生了聚集的现象，当加入非互补序列或者单碱基错配序列时，探针不能与其杂交，颜色保持原来的酒红色，并无聚集现象。

由图2可以看出，最佳的杂交时间为15分钟。

由图3可以看出，最佳的杂交温度为42℃。

由图4可以看出，最佳的nacl浓度为1mol/l。

由图5可以看出，最佳的冷冻时间为60分钟。

由图6可以看出，比例吸光度值与目标物浓度有一个良好线性关系，线性回归方程为a＝0.1178logc+1.4248，(a为紫外吸收值，logc为目标物的浓度的对数)，r²＝0.9924，检出下限为1.5pmol/l。

由图7可以看出，目标物mirna-7a的比例吸光度值最高，且与空白和错配序列的信号值相差19倍之大，由此可知本发明的方法能够很好地区分互补目标与单碱基错配和非互补序列，具有高灵敏度和特异性。

以上仅是本发明的优选实施方案，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。