本发明涉及一种抗黑穗病快速鉴定方法，尤其是一种甘蔗抗黑穗病快速鉴定方法，属于抗甘蔗黑穗病品种选育领域。
背景技术：
现有的甘蔗抗黑穗病育种途径有2条，（1）通过常规的育种途径，通过花穗杂交并培育实生苗，经过“五圃”制筛选后获得优良品种（系），并对其进行抗病性鉴定，鉴定为抗病品种后推广应用；（2）通过生物技术手段，获得抗病基因，将抗病的外源基因导入甘蔗材料中，但需解决转入的外源基因是否达到预期功能表达的问题。
迄今，将抗黑穗病的外源基因导入培育抗病甘蔗品种还没有成功的报道，甘蔗抗黑穗病育种实践上还是采用常规的育种途径，通常这一途径在育种早期阶段，利用自然侵染法淘汰感病株，在育种后期阶段，采用人工接种进行田间抗病性鉴定试验，进一步淘汰感病材料，其不足首先是鉴定时间长，新植鉴定试验需要一个甘蔗生长周期，即一年时间，人工接种鉴定试验需要了解甘蔗新植和宿根的发病状况，评价才更为客观，因此一新一宿评价试验需要两年时间；第2选育效率低，由于前期施加的抗黑穗病选择压力小，后期采用人工接种田间抗病性鉴定，很多前期入选的材料感黑穗病，这时再进行淘汰，浪费了大量的人力物力，选育效率低；第3育种周期长，在后期采用人工接种田间抗病性鉴定，选育抗黑穗病品种需8年以上时间。
现有技术针对甘蔗选育后期阶段（品比及区域化试验）入选的甘蔗品系进行抗黑穗病的抗性水平鉴定评价。这时通过淘汰，从实生苗淘汰升级的甘蔗品系所剩不多，通过较大试验面积及一年新植及一年宿根的鉴定试验，准确地鉴定评价甘蔗品系对甘蔗黑穗病的抗性水平，然而，选育后期阶段进行抗病鉴定评价，存在淘汰感病品系不够及时，造成了选育抗黑穗病甘蔗品种成本增加和育种效率低下的问题。要提高选育抗黑穗病甘蔗品种的效率，就应在育种前期的鉴定圃阶段将感病品系淘汰，这时品系相对较多，每个品系种芽量少，针对这一状况，本发明能够对甘蔗品系进行大批量的快速鉴定评价，初步掌握入选材料对甘蔗黑穗病的抗性水平，尽早淘汰感病品系，提高育种效率。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，提高抗黑穗病甘蔗品种选育效率，我们开展了甘蔗抗黑穗病快速鉴定方法研究，本发明的技术方案具体如下：
一种甘蔗抗黑穗病快速鉴定方法，包括以下步骤：
步骤（1）参试材料设置：
每个参试材料取若干健康甘蔗芽，在试验中包括抗病、感病和生理小种鉴别对照品种；
步骤（2）参试材料接种甘蔗黑穗病菌：
检测孢子萌芽率，并配制黑穗病病菌的悬浮液，将参试材料放入悬浮液中浸渍接种一段时间，取出后在一定温度下保湿，一段时间后播种于大田；
步骤（3）甘蔗生长拔节初期前的发病状况调查：
待苗长齐后，调查基本苗数，分蘖基本结束后，调查总茎蘖数，待第一个黑穗病鞭子长出后，每个月调查一次新长出的鞭子数至甘蔗生长拔节初期止，然后将参试材料地上部分沿土表割除；
步骤（4）甘蔗蔸萌发时的发病状况调查：
待甘蔗蔸萌发，作为甘蔗宿根，调查基本苗数，分蘖基本结束后，调查总茎蘖数，待第一个黑穗病鞭子长出后，每个月调查一次新长出的鞭子数，宿根试验时间为5个月；
步骤（5）初步筛选出抗黑穗病甘蔗品系：
根据步骤（3）和（4）的调查结果，计算黑穗病鞭子总数占总茎蘖数的百分率，得到参试材料新植与宿根的发病率，对照分级标准，对参试材料新植与宿根的抗性水平做出判定，淘汰感病材料，从而初步筛选出抗黑穗病甘蔗品系。
进一步地，步骤（1）中，每个参试材料取12个健康甘蔗芽，试验设2个重复。
进一步地，步骤（2）中，配制黑穗病病菌浓度为1×107孢子/ml的悬浮液，将参试材料放入悬浮液中浸渍接种20min，取出后保湿，置25℃～28℃的温室内，24h±2h后播种于大田。
进一步地，步骤（3）中，发病调查结束后，然后将参试材料地上部分沿土表割除，试验结果为新植发病状况，新植发病状况试验的时间为5个月。
进一步地，步骤（5）中，分级标准如表1所示：
表1抗黑穗病评价的分级标准
与现有技术相比，本发明的有益效果具体如下：
首先，本发明从2个方面提高选育抗黑穗病甘蔗品种选育效率：
（1）从材料接种病源至种植后共5个月，材料发病率快速增长，5个月后材料发病率增长变缓，这时前5个月的发病率大体可代表试验材料的抗病特性。因此从接种后5个月止，调查完发病状况后作为鉴定材料新植发病率，这时将参试材料地上部分割除，待甘蔗蔗蔸萌发，继续进行宿根的发病试验，可以一年内完成新植和宿根的发病试验调查，缩短了抗病性鉴定评价的时间；（2）在育种的前期阶段，对选种圃入选鉴定圃的优良材料进行大批量的快速鉴定评价，这时待测的优良材料种苗有限，通过合理确定参试材料的种芽量，高效地对优良材料进行抗黑穗病鉴定评价，掌握入选材料对甘蔗黑穗病的抗性水平，尽早淘汰感病品系，将节约人力物力。因此，本发明并不是对常规鉴定方法的取代，本发明是一种在甘蔗品种选育前期阶段选择抗黑穗病甘蔗品系的方法，能够进行大批量的快速鉴定评价，初步掌握入选材料对甘蔗黑穗病的抗性水平，尽早淘汰感病品系，缩短选育抗甘蔗黑穗病新品种的育种年限，提高育种效率，达到高效选育抗黑穗病甘蔗品种的目的。本发明快速评价甘蔗新品系抗黑穗病水平效果明显，且重演性好、试验周期短、可操作性强。该方法可服务于甘蔗品种选育机构，用于甘蔗抗黑穗病的甘蔗新品种选育。对选育抗黑穗病甘蔗品种起到事半功倍的作用，达到高效选育抗黑穗病甘蔗品种的目的。
其次，与现有技术相比，本发明是在育种的前期阶段，对选种圃入选鉴定圃的优良材料进行快速鉴定评价，初步掌握入选材料对甘蔗黑穗病的抗性水平，尽早淘汰感病品系。现有技术的鉴定对象是甘蔗实生苗，本发明鉴定对象是甘蔗茎芽。
本发明是早期选择甘蔗抗黑穗病品系的选育技术。现有技术用于甘蔗育种后期阶段对筛选剩余的品系进行定性鉴定评价，需要为品种推广、品种审定提供比较准确的抗黑穗病抗性水平数据，因此试验设置重复多，小区面积大，一年新植一年宿根2个甘蔗生长周期，而本发明目的是为了在早期阶段选择抗黑穗病甘蔗品系，鉴定圃这个阶段甘蔗品系种芽较少，通过有限规模的试验，并在甘蔗生长中期将参试材料地上部分割除，将1个甘蔗生长周期，分成新植和宿根试验，缩短了鉴定评价的时间，通过试验分析，本发明试验检测的发病率可达对照常规鉴定试验的80%左右，并为高度正相关，因此在了解参试材料大概抗性水平的情况下，便可淘汰感病参试材料，从而初步筛选出抗黑穗病甘蔗品系。
最后，我们将抗黑穗病快速鉴定试验及对照常规鉴定试验的新植宿根发病率用spss分析软件进行相关分析，结果为抗黑穗病快速鉴定试验与对照常规鉴定试验的pearson相关系数为0.554**，两试验为高度正相关，抗黑穗病快速鉴定试验的新植和宿根发病率分别达对照常规鉴定试验新植和宿根发病率的77.4%、86.2%，说明抗黑穗病快速鉴定试验通过甘蔗分蘖期割除地上部分，在一年中进行新植和宿根的发病状况，能够反映常规鉴定试验进行一年新植一年宿根的发病状况，抗黑穗病快速鉴定试验在较短时间内能完成新植和宿根的抗病性鉴定评价，能较准确地反映参试材料的抗病性，形成了重演性好、可操作性强的快速鉴定筛选抗黑穗病材料的方法，提高抗黑穗病甘蔗品种选育效率，节约了土地、资金和劳动力。
具体实施方式
下面将结合实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是对本发明一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的甘蔗抗黑穗病快速鉴定方法，第一年通过试验掌握割除地上部份时间点、接种病菌浓度等技术要领，第2-3年通过正规试验进行试验验证，试验采用17个甘蔗品种（系），在同一年中布置两个试验，分别是本实施例的方法以及作为对照的常规鉴定试验，每个试验设3个重复。
本实施例的方法包括以下步骤：
步骤（1）参试材料设置：
鉴定试验每个参试材料取12个健康甘蔗芽，试验为2重复，在试验中包含抗病、感病和生理小种鉴别等4个对照品种（nco376（抗病）、nco310（感生理小种1，抗生理小种2）、f134（抗生理小种1，感生理小种2）、闽糖69-421（感病）），参试材料切成双芽段，一般在2月进行鉴定试验。
步骤（2）参试材料接种甘蔗黑穗病菌：
准备接种黑穗病病菌孢子悬浮液：收集黑穗病病菌孢子，将干燥的孢子保存在放有硅胶干燥剂的瓶中，用凡士林封口。在试验前，按现有方法检测孢子萌芽率，并配制黑穗病病菌浓度为1×107孢子/ml的悬浮液。将参试材料放入黑穗病菌悬浮液中浸渍接种20min，取出后用塑料袋保湿，置25℃～28℃的温室内，24h±2h后播种于大田。
步骤（3）新植发病状况调查：
待苗长齐后，调查基本苗数，分蘖基本结束后，调查总茎蘖数，待第一个黑穗病鞭子长出后，每个月调查一次新长出的鞭子数，直到7月中旬甘蔗处于拔节初期为止，试验进行共5个月，进行发病状况调查后作为鉴定材料新植的发病率，接着用锋利的镰刀沿地表将甘蔗地上部分割去，让甘蔗蔸萌发。
步骤（4）宿根发病状况调查：
待甘蔗蔸萌发，作为甘蔗宿根，调查基本苗数，分蘖基本结束后，调查总茎蘖数，待第一个黑穗病鞭子长出后，每个月调查一次新长出的鞭子数，调查时间至12月底为止，发病调查后作为鉴定材料宿根的发病率，新植及宿根鉴定试验各为5个月。
步骤（5）初步筛选出抗黑穗病甘蔗品系：
根据步骤（3）和（4）的调查结果，计算黑穗病鞭子总数占总茎蘖数的百分率，得到参试材料新植与宿根的发病率，对照分级标准，对参试材料新植与宿根的抗性水平做出判定，淘汰感病材料，从而初步筛选出抗黑穗病甘蔗品系。其中，分级标准如表1所示：
表1抗黑穗病评价的分级标准
抗黑穗病快速鉴定试验7月中旬调查发病后割除地上部分，12月进行发病调查，前者作为新植发病率，后者作为宿根发病率，对照常规鉴定试验进行一年新植一年宿根的发病调查，结果如表2所示。
将抗黑穗病快速鉴定试验及对照常规鉴定试验的新植宿根发病率用spss分析软件进行相关分析，结果为抗黑穗病快速鉴定试验与对照常规鉴定试验的pearson相关系数为0.554**，两试验为高度正相关，抗黑穗病快速鉴定试验的新植和宿根发病率分别达对照常规鉴定试验新植和宿根发病率的77.4%、86.2%，说明抗黑穗病快速鉴定试验通过甘蔗分蘖期割除地上部分，在一年中进行新植和宿根的发病状况，能够反映常规鉴定试验进行一年新植一年宿根的发病状况，抗黑穗病快速鉴定试验在较短时间内能完成新植和宿根的抗病性鉴定评价，能较准确地反映参试材料的抗病性，形成了重演性好、可操作性强的快速鉴定筛选抗黑穗病材料的方法，提高抗黑穗病甘蔗品种选育效率，节约了土地、资金和劳动力。
表2发病状况调查结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。