罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列及其克隆方法与流程

本发明属于生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列及其克隆方法。

背景技术：

罗非鱼是联合国粮农组织向全世界推广养殖的水产品种，也是我国淡水养殖的主导品种。近几年我国罗非鱼养殖面积约170万亩，产量约150万吨，出口约40万吨，已成为全球罗非鱼产量和出口量最大的国家。目前，罗非鱼已形成了集良种培育、苗种繁育、饲料生产、机械配套、规模养殖、产品加工与运销等一体的完整产业链，在国内是产业链最为完整的水产品种。过去十多年随着吉富罗非鱼的引进及规模化养殖模式的大面积推广，罗非鱼产业得到了飞速发展。但也出现了许多亟待解决的问题，其中以无乳链球菌和嗜水气单胞菌引起的细菌性疾病最为棘手，该病不但死亡率高，而且死亡速度和传播速度极快，给养殖从业者带来了严重的经济损失，已成为罗非鱼养殖过程中的“恶魔”。目前普遍采用抗生素药物进行防治，虽然短时间内可以有效的防治病害，但也会带来很多弊端，例如长期频繁使用抗生素及其它一些化学药物会引起病原物产生耐药性，药物在鱼类体内残留及对水环境造成污染等，对人类的生存环境和生命健康将会产生巨大的威胁。而依靠分子育种技术培育抗病品种在近几年中经常有报导，并取得了一定的进展。依靠这种方法虽然符合水产养殖无公害绿色发展的需求，但由于育种周期较长，制约养殖产业的快速发展。因此开展鱼类抗病基因工程的研究就显得尤为重要。

与罗非鱼免疫相关基因的研究已有大量的报道，如主要组织相容性抗原(mhc)iia和iib基因、cd59基因、cd2bp2基因的克隆与表达分析、cc1趋化因子的分子克隆、功能分析及体外重组蛋白的抑菌活性分析。而凝集素在硬骨鱼类中具有多种的功能，其中免疫功能最为突出。已有研究表明，凝集素通过连接传染性病原菌表面的凝集细胞、沉淀多糖和复合碳水化合物而参与免疫或炎症反应。到目前为止，在鱼类中已经发现了5种凝集素家族成员，包括半乳糖凝集素、c型-凝集素、lily型-凝集素、rhamnose-凝集素和内凝集素。半乳糖凝集素是s型凝集素，作为一种模式识别受体，可以特异性的分子识别相关病原体，参与一系列免疫反应，如抗体调理、细胞吞噬、补体激活和微生物死亡等作用。在脊椎动物中，根据碳水化合物识别结构域(crd)的结构特将其分为三种类型共16个基因，其中呈球型的crd半乳糖凝集素有(galectin-1，2，5，7，10，11，13，14，15，16)、半乳糖凝集素-3和串联重复半乳凝素(半乳糖凝集素4，6,8,9，12)。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是唯一一个连接到n-末端的一个c-末端碳水化合物识别结构域的嵌合半乳糖凝集素，在哺乳动物中，galectin-3在活化的t细胞、b细胞和炎性巨噬细胞等免疫细胞中广泛表达，同时在t细胞凋亡、炎和肿瘤中均发挥重要作用。目前，在斑点叉尾鮰中发现了两个同源的半乳糖凝集素-3基因，它们在斑点叉尾鮰的黏膜免疫中发挥了重要作用。目前，在鱼类中有关凝集素的研究报道还比较少，仅见在斑点叉尾鮰中发现了两个同源的半乳糖凝集素-3基因，它们均参与了黏膜免疫。但是到目前为止，在罗非鱼中，尚未见任何关于半乳糖凝集素-3基因的相关报导。

技术实现要素：

作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，利用无乳链球菌或嗜水气单胞菌感染罗非鱼后，罗非鱼内脏中的免疫相关基因差异表达显著，通过分子生物学手段对差异表达显著的基因进行分析，发现差异表达显著的基因中含有与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因同源性较高的基因。基于这种发现，完成了本发明。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列，其能够用于罗非鱼抗病品种的选育。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列，所述半乳糖凝集素-3基因序列为seqidno：1。

罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其包括以下步骤：

1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼内脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的内脏组织转录组数据库与易感病家系的内脏组织转录组数据库进行比对，筛选获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mrna序列；

3)使用常规pcr扩增所述mrna序列，并对扩增产物进行测序验证，获得cdna序列；

4)以所述cdna序列为模板，利用race技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cdna，将半乳糖凝集素-3基因的全长cdna与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cdna为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因。

优选的是，所述内脏组织为脾脏或肾脏。

优选的是，所述常规pcr所用的引物为：

galectin-3-fcctctttgccccacttttca；

galectin-3-ragtgagggtgcggtctgatt。

优选的是，race技术扩增所述cdna序列的方法，包括以下步骤：

s1：根据所述cdna序列设计race技术的特异引物，使用pcr扩增所述cdna序列，将pcr特异扩增产物进行纯化、回收及克隆测序；

其中，扩增cdna序列5’端的引物为：

galectin-3-g:agaatctgacggttcccttcaatctgc-sp5′，

galectin-3-n:ccagccaacccagcggaccttg-gsp5′；

扩增cdna序列3’端的引物为：

galectin-3-g:aggcagattgaagggaaccgtcagat-gsp3′，

galectin-3-n：cagctgtttctgacgatcagcttcttgc-gsp3′。

s2：将克隆测序后序列进行拼接，获得半乳糖凝集素-3基因的全长cdna。

优选的是，所述差异表达显著的基因为基因表达变化倍数大于2，并且fdr值小于0.05。

优选的是，所述罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列含有1034bp个碱基，包括690个碱基的开放阅读框，所述开放阅读框编码229个氨基酸的蛋白，所述罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列存在4个内含子和5个外显子。

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因应用，所述的半乳糖凝集素-3基因用于罗非鱼的抗病选育。

本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因高度参与了罗非鱼的抗病菌的免疫应答，为罗非鱼的抗病候选基因，为为下一步开发可用于抗病育种的分子标记及进一步指导抗病品种的选育奠定了重要的基础；罗非鱼的脾脏或肝脏组织中的半乳糖凝集素-3基因对病菌的免疫应答响应速度快，利用该特点能有效的节约试验所需的时间，加快育种进度。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为罗非鱼感染无乳链球菌后galectin-3基因在各组织中表达水平图；

图2为罗非鱼感染嗜水气单胞菌后galectin-3基因在在各组织中表达水平分析图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其包括以下步骤：

1)构建吉福罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼内脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的内脏组织转录组数据库与易感病家系的内脏组织转录组数据库进行比对，筛选获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，发现了与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因具有高度同源性的mrna，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mrna序列；

3)使用常规pcr扩增所述mrna序列，并对扩增产物进行测序，并将测序序列与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对验证，获得cdna序列；

4)以所述cdna序列为模板，利用race技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cdna，将半乳糖凝集素-3基因的全长cdna与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cdna为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因。

实施例2

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其包括以下步骤：

1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼脾脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的脾脏组织转录组数据库与易感病家系的脾脏组织转录组数据库进行比对，筛选获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mrna序列；

3)使用常规pcr扩增所述mrna序列，并对扩增产物进行测序验证，获得cdna序列；

4)以所述cdna序列为模板，利用race技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cdna，将半乳糖凝集素-3基因的全长cdna与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cdna为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因。

实施例3

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其包括以下步骤：

1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼脾脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的脾脏组织转录组数据库与易感病家系的脾脏组织转录组数据库进行比对，筛选获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mrna序列；

3)使用常规pcr扩增所述mrna序列，并对扩增产物进行测序验证，获得cdna序列；其中，扩增所述mrna序列的引物为：

galectin-3-f：cctctttgccccacttttca；

galectin-3-r：agtgagggtgcggtctgatt。

4)以所述cdna序列为模板，利用race技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cdna，将半乳糖凝集素-3基因的全长cdna与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cdna为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因。

实施例4

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其包括以下步骤：

1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼脾脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的脾脏组织转录组数据库与易感病家系的脾脏组织转录组数据库进行比对，筛选获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mrna序列；

3)使用常规pcr扩增所述mrna序列，并对扩增产物进行测序验证，获得cdna序列；其中，扩增所述mrna序列的引物为：

galectin-3-f：cctctttgccccacttttca；

galectin-3-r：agtgagggtgcggtctgatt。

4)以所述cdna序列为模板，利用race技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cdna，将半乳糖凝集素-3基因的全长cdna与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cdna为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因，其中，race技术扩增所述cdna序列包括以下步骤：

s1：根据所述cdna序列设计race技术的特异引物，使用pcr扩增所述cdna序列，将pcr特异扩增产物进行纯化、回收及克隆测序；

其中，扩增cdna序列5’端的引物为：

galectin-3-g:agaatctgacggttcccttcaatctgc-sp5′，

galectin-3-n:ccagccaacccagcggaccttg-gsp5′；

扩增cdna序列3’端的引物为：

galectin-3-g:aggcagattgaagggaaccgtcagat-gsp3′，

galectin-3-n：cagctgtttctgacgatcagcttcttgc-gsp3′。

s2：将克隆测序后序列进行拼接，获得半乳糖凝集素-3基因的全长cdna。

实施例5

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其包括以下步骤：

1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼脾脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的脾脏组织转录组数据库与易感病家系的脾脏组织转录组数据库进行比对，筛选基因表达变化倍数大于2，并且fdr值小于0.05，获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mrna序列；

3)使用常规pcr扩增所述mrna序列，并对扩增产物进行测序验证，获得cdna序列；其中，扩增所述mrna序列的引物为：

galectin-3-f：cctctttgccccacttttca；

galectin-3-r：agtgagggtgcggtctgatt。

4)以所述cdna序列为模板，利用race技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cdna，将半乳糖凝集素-3基因的全长cdna与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cdna为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因，其中，race技术扩增所述cdna序列包括以下步骤：

s1：根据所述cdna序列设计race技术的特异引物，使用pcr扩增所述cdna序列，将pcr特异扩增产物进行纯化、回收及克隆测序；

其中，扩增cdna序列5’端的引物为：

galectin-3-g:agaatctgacggttcccttcaatctgc-sp5′，

galectin-3-n:ccagccaacccagcggaccttg-gsp5′；

扩增cdna序列3’端的引物为：

galectin-3-g:aggcagattgaagggaaccgtcagat-gsp3′，

galectin-3-n：cagctgtttctgacgatcagcttcttgc-gsp3′。

s2：将克隆测序后序列进行拼接，获得半乳糖凝集素-3基因的全长cdna。

实施例6

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列的克隆方法，其包括以下步骤：

1)构建罗非鱼抗病家系和易感病家系，使用无乳链球菌分别感染所述抗病家系和易感病家系的罗非鱼，获得感染后罗非鱼脾脏组织转录组数据库；

2)将罗非鱼抗病家系的脾脏组织转录组数据库与易感病家系的脾脏组织转录组数据库进行比对，筛选基因表达变化倍数大于2，并且fdr值小于0.05，获得差异表达显著的基因，对差异表达显著的基因进行功能归类分析，挑选与免疫抗应激相关的基因在数据库中进行比对，获得了半乳糖凝集素-3基因的部分mrna序列；

3)使用常规pcr扩增所述mrna序列，并对扩增产物进行测序验证，获得cdna序列；其中，扩增所述mrna序列的引物为：

galectin-3-f：cctctttgccccacttttca；

galectin-3-r：agtgagggtgcggtctgatt。

4)以所述cdna序列为模板，利用race技术扩增该基因的5’和3’端，获得5’端扩增产物和3’端扩增产物，将所述5’端扩增产物和3’端扩增产物进行拼接，得到半乳糖凝集素-3基因的全长cdna，将半乳糖凝集素-3基因的全长cdna与其他鱼类的半乳糖凝集素-3基因进行比对，二者具有高度同源性，则说明所述半乳糖凝集素-3基因的全长cdna为罗非鱼半乳糖凝集素-3基因，该基因含有1034bp个碱基，包括690个碱基的开放阅读框，所述开放阅读框编码229个氨基酸的蛋白，所述罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列存在4个内含子和5个外显子；其中，race技术扩增所述cdna序列包括以下步骤：

s1：根据所述cdna序列设计race技术的特异引物，使用pcr扩增所述cdna序列，将pcr特异扩增产物进行纯化、回收及克隆测序；

其中，扩增cdna序列5’端的引物为：

galectin-3-g:agaatctgacggttcccttcaatctgc-sp5′，

galectin-3-n:ccagccaacccagcggaccttg-gsp5′；

扩增cdna序列3’端的引物为：

galectin-3-g:aggcagattgaagggaaccgtcagat-gsp3′，

galectin-3-n：cagctgtttctgacgatcagcttcttgc-gsp3′。

s2：将克隆测序后序列进行拼接，获得半乳糖凝集素-3基因的全长cdna。

实施例7

一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因应用，用半乳糖凝集素-3基因选育抗病罗非鱼。

选取健康吉富罗非鱼(体重约50g)的10个组织，分别为：心脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠、脑、鳃、皮肤、肌肉和性腺。用trizol法提取这些组织的总rna，用takara反转录试剂盒反转录为cdna。根据galectin-3基因序列设计基因特异引物(galectin-3-a：5’-tcaccatcgctggaactatcaa-3’和galectin-3-s：5’-cctctttgccccacttttca-3’)，用实时定量pcr的方法检测galectin-3基因在上述10个组织中的相对表达量(relativeexpression)。

图1a中he:心脏,li:肝脏,sp:脾脏,gi:鳃,ki:前肾,br:脑,in:肠,sk:皮肤,mu:肌肉,ov:性腺。结果如图1中的a图所示，galectin-3基因在上述10个组织中均有表达，其中在在肾脏和脾脏组织中的表达量最高；在肝脏、脑、肌肉和性腺组织中的表达量比较低。

感染组的吉富罗非鱼(体重约50g)分别用无乳链球菌(0.2ml，滴度约为1.83×107cfu/ml)和嗜水气单胞菌(0.2ml，滴度约为1.8×107cfu/ml)进行腹腔注射；同时，用等量的无菌pbs缓冲液(0.2ml)对对照组也进行腹腔注射。在无乳链球菌注射感染后0h,5h,50h,和7d以及嗜水气单胞菌感染后6h,12h,18h,24h,36h,72h,96h,和7d的时间点，分别取各实验组的肝脏、脾脏、肾脏、鳃及肠等5个免疫相关的。用实时定量pcr的方法检测galectin-3基因在上述5个组织中的相对表达量。

图1中的b、c、d、e和f为感染无乳链球菌感染后galectin-3基因在肠、心脏、脾脏、肾脏和鳃组织中表达水平。结果如图1所示，在注射无乳链球菌后5h，galectin-3基因在感染组吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、肾脏、鳃和肠组织中的表达量均有不同程度的升高，其中在脾脏、肾脏和鳃组织中的升高最显著且表达量达到了峰值，在之后的时间，表达量开始逐渐下降，到7d基本恢复到最初的水平。肠组织是在感染后50h表达量达到峰值，之后表达量逐渐下降。而肝脏组织是在感染后7d的表达量达到峰值。

图2中的a、b、c、d、e分别为罗非鱼感染嗜水气单胞菌后galectin-3基因在在肠、心脏、脾脏、肾脏和鳃组织中表达水平分析。其中纵坐标为基因的相对表达量，横坐标代表嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)感染后的时间点。结果如图2所示，在注射嗜水气单胞菌后，galectin-3基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、肾脏、鳃和肠组织中的表达量均有不同程度的升高，其中在感染后18h肠、肝脏、鳃以及前肾组织的表达量最高达到了峰值，在之后的时间，表达量开始逐渐下降，到9d基本恢复到最初的水平。脾脏组织是在感染后36h表达量达到峰值，之后表达量逐渐下降。而对照组的所有样品在注射后galectin-3基因的表达量均无明显变化。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

<110>广西壮族自治区水产科学研究院

<120>一种罗非鱼的半乳糖凝集素-3基因序列

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