用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子以及应用的制作方法

文档序号:17188787发布日期:2019-03-22 21:45阅读:344来源:国知局
用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子以及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域,尤其涉及用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子以及应用。



背景技术:

外源基因在机体中能否高效稳定表达式基因工程研究的关键,同时要解决的问题是外源基因的表达要因需而开启,即具备严格的时空特异性。在真核细胞中利用基因工程技术构建多种真核表达系统进行外源基因的表达已经是一项常用的技术,但是经常面临的问题是外源基因的表达量较低,而基因的表达调控最关键的乃是转录水平的调控。启动子是能够正确有效起始rna转录的一段dna序列,能与转录因子互作而结合rna聚合酶。启动子是基因的重要组成部分,在时间、空间以及表达程度上控制着基因的表达。cmv及sn40启动子是现阶段基因工程中应用较广泛的启动子,两者均可以携带外源基因与几乎所有类型的细胞中高效的表达。这两种高效的启动子存在的问题是显而易见的,不具备靶向调控基因表达的能力。

组织特异性启动子很好的解决这一难题,使用组织特异性启动子可以调控外源基因的靶向表达。组织特异性启动子亦称器官特异性启动子,在这类启动子的驱动下,基因的表达往往只限定于某些特定的器官或组织部位,并表现发育调节等特性。组织特异性通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础,与诱导型启动子有一定的共同点。鉴于组织特异性启动具备这样的特质,在基因工程中越来越获得研究者的青睐。

但是从目前在动物及植物中获得的组织特异性启动子分析发现,普遍存在以下问题:特异性并不是很高;分离并且获得应用的特异性启动子数量少;活性低等问题,这极大的限制了组织特异性启动子在基因工程中的应用。

研究发现,骨骼肌的发生是在外界信号分子的严格调控下,导致特定转录因子的激活和基因表达的结果,这个过程包括细胞周期的退出,肌肉特异性蛋白的转录,以及具有收缩功能的多核肌纤维的形成等。但是,以往对组织特异性启动子序列的研究大多以哺乳动物为模型的。鸡基因组dna总长度为1.2x109bp,约为人、鼠等哺乳动物的40%,鸡的编码基因及调控序列均与哺乳动物有较大差别,这意味着禽类骨骼肌发育的转录调控机制也有别于哺乳动物。例如,心肌锚定重复序列蛋白(cardiacankyrinrepeatprotein,carp)基因在哺乳动物中呈心肌特异性表达。研究发现,carp在以鸡为代表的禽类中的表达模式与哺乳动物截然不同,它在禽类的骨骼肌特异表达。因此,利用禽类骨骼肌特异性启动子,通过构建相应的表达载体,能够开启基因固定于禽类肌肉中表达。通过外源基因的蛋白或rnas在禽类骨骼肌中的表达可以很好的研究肌肉的分化、治疗肌肉相关性疾病及改善禽类肌肉的质量或风味。然而,目前没有研究报道在禽类骨骼肌中能高效的特异性启动基因表达的启动子,这极大阻碍了禽类骨骼肌特异性表达外源基因的应用。



技术实现要素:

有鉴于此,本发发明的目的是提供用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子。

本发明的另一个目的是提供一种能提高禽类肌肉质量的产品和治疗肌肉相关疾病的基因工程方法。

本发明提供一种用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子,包括至少一个e-box元件;所述e-box的核苷酸序列为canntg,其中,所述n选自a、t、c或g。

作为优选,所述canntg选自cagctg或catgtg。

作为优选,所述启动子包括两个e-box元件,所述顺式作用元件选自cagctg或/和catgtg。

其中,seqidno:2的核苷酸序列为catgtg;seqidno:3的核苷酸序列为cagctg。

更有选的,所述启动子包括e-box元件,所述e-box元件为catgtg。

作为优选,还包括tata-box。

作为优选,所述tata-box的核苷酸序列为tatataa。

作为优选,其具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一个:

(ⅰ)如seqidno:1所示;

(ⅱ)与如seqidno:1所示序列具有至少90%同源性的序列;

(ⅲ)如seqidno:1所示序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列。

需要说明的是,seqidno:1的核苷酸序列为tacatcaacagacagctgtcccagtgggcactgggaacacaggatgactcacatagctgagccatgtggtcatggccaaaggcatgatgagctcacatttcattccgatgcacatacgcagtgcggtcagactgtgggactcggccacccccaccctcctgacgccccccgctcggtctcgacactagatctggctagttaacatgtctggaatgagcacgagcctacctcccagctggcaagtcttcaggcgtactcggattccaaggttggaagattatctcattcaagcatagctctcccaaagatatataagcaaagctagtgtggtggtccc。seqidno:1为carp的转录起始点上游的-337bp到转录起始点的片段,共337bp,其中,carp的转录起始点上游的-325bp到转录起始点上游的-320bp的片段为e-box元件,记为e-box2,carp的转录起始点上游的-277bp到转录起始点上游的-272bp的片段为e-box元件,记为e-box1,carp的转录起始点上游的-29bp到转录起始点上游的-23bp的片段为tata-box。

作为优选,所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27、28个、29个、30个、31个、32个或33个核苷酸。

本发明公开了所述启动子在禽类骨骼肌中启动下游基因高效表达中的应用。

需要说明的是,所述禽类骨骼肌的细胞为鸡胚胎成肌细胞(chickenfetalmyoblast,cfm)。

本发明公开了所述启动子在制备提高禽类肌肉质量的产品中的应用。

需要说明的是,可以将本发明的启动子与提高禽类肌肉质量或风味的目的基因共同构建载体,通过基因工程技术使得目的基因能在禽类肌肉中特异性表达以提高禽类肌肉质量或风味。

本发明公开了所述启动子在制备治疗禽类肌肉疾病的基因工程药物中的应用。

需要说明的是,可以将本发明的启动子与治疗禽类肌肉相关疾病的目的基因共同构建载体,通过基因工程技术使得目的基因能在禽类肌肉中特异性表达以治疗禽类肌肉的相关疾病。

本发明还提供一种表达载体,含有所述启动子。

本发明还提供了一种宿主细胞,含有所述表达载体。

本发明提供了用于基因在骨骼肌中特异性表达的启动子,本发明公开的启动子可以特异性在禽类骨骼肌中高效启动基因的表达。从实验结果可知,本发明发现,包括至少一个e-box元件;所述e-box元件的核苷酸序列为canntg,其中,所述n选自a、t、c或g。本发明公开的启动子能在禽类骨骼肌中有效激活下游基因的转录,该顺式作用元件为e-box,e-box是激活myod所必需的,并有助于启动子下游基因的表达。本发明发现e-box能结合肌源性调节因子,如myod、myogenin和mrf4,其通过与myod结合激活启动子下游基因的启动,本发明提供的启动子可以促进禽类骨骼肌作为生物反应器的应用,将所需的目的蛋白的片段与本发明的启动子连接转染到骨骼肌中,并在禽类骨骼肌中特异性表达,通过基因工程技术可以在禽类骨骼肌中大量获得目的蛋白;本发明的启动子也可以提高禽类肌肉的质量和风味,将提高禽类肌肉质量或风味的目的蛋白的片段与本发明的启动子连接转染到禽类骨骼肌中,并在禽类骨骼肌中特异性表达,通过基因工程技术可以改善禽类骨骼肌的质量或风味;本发明的启动子也可以治疗禽类肌肉相关疾病,将治疗肌肉相关疾病的目的蛋白的片段与本发明的启动子连接转染到禽类骨骼肌中,并在禽类骨骼肌中特异性表达,通过基因工程技术可以治疗禽类骨骼肌的相关疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例的荧光报告实验检测不同长度capr基因的启动子在原代cfm、dt40(鸡淋巴瘤细胞)和fibroblast(鸡成纤维细胞)中的活性,其中,p-386(-386~+203bp)、p-355(-355~+203bp)、p-337(-337~+203bp)、p-319(-319~+203bp)、p-286(-286~+203bp)、p-269(-269~+203bp)、p257(-257~+203bp)、p227(-227~+203bp)、p-189(-189~+203bp),(-):表示转录起始上游,(+):表示转录起始下游;

图2示本发明实施例的westernblot实验检测carp基因在原代cfm、dt40和fibroblast(鸡成纤维细胞)中的表达情况;

图3示本发明实施例的q-pcr实验检测carp基因在原代cfm、dt40和fibroblast(鸡成纤维细胞)中的表达情况;

图4示本发明实施例的利用tfsearch在线软件对carp基因的转录起始位点上游的1kb序列进行生物信息学分析图谱,其中,carp基因的转录起始上游-325~-320处有e-box2元件,carp基因的转录起始上游-277~-272处有e-box1元件,carp基因的转录起始上游-29~-23处有tata-box元件;

图5示本发明实施例的荧光报告实验检测e-box1和e-box1突变后carp基因的启动子的活性情况,其中,p-337为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp载体的细胞荧光活性,p-337me2为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp(e-box2元件突变)载体的细胞荧光活性,p-337me1为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp(e-box1元件突变)载体的细胞荧光活性,p-337me2me1为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp(e-box1和e-box2元件同时突变)载体的细胞荧光活性;

图6示本发明实施例的检测e-box2或e-box1是否与myod结合的情况,其中,input为cfms细胞中转染含有e-box2或e-box1载体的基因组,anti-myod为转染e-box2或e-box1载体后,提取基因组与myod抗体孵育实验组,anti-igg为转染e-box2或e-box1载体后,提取基因组与igg抗体结合的对照组;

图7示本发明实施例的检测e-box位点野生型与突变后对carp基因的启动子活性的影响,其中,mock为空白组,wt-e1为野生型e-box1,me1为突变型e-box1,wt-e2为野生型e-box2,me2为突变型e-box2;

图8示本发明实施例的cfms细胞中干扰myod的表达情况,其中,mock为空白组,si-myod为干扰myod表达组;

图9示本发明实施例的干扰myod的表达后检测p-337和p-319对carp基因的启动子的影响,其中,p-337为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp载体的细胞荧光活性,p-319为含有carp基因转录起始上游到下游-319~+203bp载体的细胞荧光活性。

具体实施方式

本发明提供了一种用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子,用于填补目前缺少能在禽类骨骼肌细胞中特异性表达基因的启动子的空缺。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

其中,以下实施例所用原料均为市售或自制。

实施例1

本发明实施例通过pcr方法扩增出carp的转录起始点上游的1000bp到转录起始点下游的203bp的片段(即-1000~+203bp,(-):表示转录起始上游,(+):表示转录起始下游),carp基因的geneid:378926。将此片段克隆到荧光素酶报告载体pgl3-basic(promega)中。利用一系列带有酶切位点的引物,用pcr方法构建了一系列5’缺失结构的载体。分别为p-386(-1000~+203bp)、p-386(-386~+203bp)、p-355(-355~+203bp)、p-337(-337~+203bp)、p-319(-319~+203bp)、p-286(-286~+203bp)、p-269(-269~+203bp)、p257(-257~+203bp)、p227(-227~+203bp)、p-189(-189~+203bp),(-):表示转录起始上游,(+):表示转录起始下游,例如:p-337(-337~+203bp)为载体中连接carp的转录起始点上游的337bp到转录起始点下游的203bp的片段,以此类推。

需要说明的是,心脏特异性锚定重复蛋白(carp)在哺乳动物心肌中特异性表达,并在心脏发育和病理过程中的转录调控、细胞骨架结构和拉伸传感中起着重要作用。与哺乳动物的同源性不同,先前的研究发现,鸡carp基因的表达仅限于骨骼肌,并可能被肌肉生长的主要负调节因子myostatin下调。此外,最近的功能研究表明,carp可能在控制鸡骨骼肌发生的myostatin信号级联中发挥关键作用。已研究表明myostatin信号级联反应在骨骼肌细胞(cfm)分化过程中通过诱导增殖和避免细胞凋亡来控制鸡骨骼肌的发生。

实施例2

将实施例1的载体转染到cfm、鸡成纤维细胞和dt40细胞中,cfm、鸡成纤维细胞和dt40细胞培养于含有10%胎牛血清和1%双抗的dmem中,并置于含有5%二氧化碳,37℃培养箱。在细胞密度达70%的时候用lip2000(invitrogen,usa)进行转染实验。

实施例3

对实施例2完成转染的cfm、鸡成纤维细胞和dt40细胞进行荧光素酶报告试验,步骤如下:将cfm、鸡成纤维细胞和dt40细胞接种于12孔板中,用lip2000转染24h后,用荧光素酶报告系统(promega,usa)检测荧光素酶活性。所有转染均一式三份,并对各样品的萤火虫荧光素酶活性与肾荧光素酶活性进行正常化分析,数据为平均±标准偏差,至少包含三个单独的实验。两组独立样本采用t检验进行比较。所有分析都是选用双尾检验的,差异有显着性为(p<0.05)。结果如图1所示,图1可知在cfm细胞中,-1kb~-373碱基对(bp)的缺失对carp启动子活性无显著影响。然而,-337bp到-227bp该区域的缺失导致启动子活性显著减少,这表明该区域存在carp基因表达的调节元件。同时,在dt40和成纤维细胞中发现在不同长度的启动子条件下,carp的活性都很低。

实施例4

利用westernblotting和q-pcr技术检测鸡carp基因的表达水平,结果图如图2和图3,图2和图3表明鸡carp基因在dt40和成纤维细胞中的表达量几乎没有,说明鸡carp基因在cfm细胞中特异性表达。

实施例5

采用tfsearch在线软件对carp基因转录起始位点上游的1kb序列进行生物信息学分析,结果如图4,发现位于转录起始位点上游的-29到-23bp处存在一个典型的tata-box位点,以及在-325到-320bp和-277到-272bp之间存在两个e-box元件,分别是-325到-320bp(e-box2)和-277到-272bp(e-box1)。

实施例6

使用quickchange诱变试剂盒(stratagene,lajolla,ca,usa)对每个结合位点进行定点诱变,构建载体,p-337为正常含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp的载体,p-337me2为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp(e-box2元件突变)的载体,p-337me1为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp(e-box1元件突变)的载体,p-337me2me2为含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp(e-box1和e-box2元件同时突变)的载体;将以上载体通过荧光报告实验发现(结果如图5所示),分别突变e-box1和e-box2后,carp启动子的活性都下降了;并且同时突变e-box1和e-box2后,carp启动子的活性下降得更明显。因此,鸡carp基因转录起始位点上游的两个e-box位点是该基因在cfm细胞中表达活性的关键位点。

实施例7

本发明实施例为cfms细胞中转染含有e-box2和e-box1载体后,提取基因组与myod抗体孵育。从图6可知,通过e-box2的dna和e-box1的dna与myod蛋白进行ip实验发现e-box1和e-box2都能与myod结合,并且很明显e-box1的结合能力比e-box2的强。

实施例8

本发明实施例为检测e-box位点野生型与突变型对carp基因的启动子活性的影响,从图7可知,图7中mock为空白组,wt-e1为野生型e-box1,me1为突变型e-box1,wt-e2为野生型e-box2,me2为突变型e-box2。野生型的e-box1的dna序列和e-box2的dna序列转染cfms时发现carp启动的活性都比空白组的高,同样的,e-box1的活性比e-box2的强。与野生型组比较,当e-box1和e-box2发生突变时,皆能显著地降低carp启动的活性。

实施例9

本发明实施例为cfms细胞中干扰myod的表达情况,以及干扰myod的表达后检测p-337和p-319对carp基因的启动子的影响。从图8-9可知,把myod的表达沉默后,共转染p-337(即正常含有carp基因转录起始上游到下游-337~+203bp的载体)和p-319(即正常含有carp基因转录起始上游到下游-319~+203bp的载体)。结果发现干扰myod的表达后,carp启动的活性都明显降低了。这些研究表明,myod能与启动子中的e-box结合,并在肌源性分化过程中激活carp基因。以上实施例表明,e-box1和/或e-box2通过与myod结合进而启动carp基因在cfms细胞中特异性表达,说明e-box1和/或e-box2能在骨骼肌中特异性启动基因的表达。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广东医科大学附属医院

<120>用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子以及应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>337

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catcaacagacagctgtcccagtgggcactgggaacacaggatgactcacatagctgagc60

catgtggtcatggccaaaggcatgatgagctcacatttcattccgatgcacatacgcagt120

gcggtcagactgtgggactcggccacccccaccctcctgacgccccccgctcggtctcga180

cactagatctggctagttaacatgtctggaatgagcacgagcctacctcccagctggcaa240

gtcttcaggcgtactcggattccaaggttggaagattatctcattcaagcatagctctcc300

caaagatatataagcaaagctagtgtggtggtcccag337

<210>2

<211>6

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

catgtg6

<210>3

<211>6

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cagctg6

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