本发明涉及细胞生物学领域。
具体地说，是涉及一种制备牙髓干细胞的方法。
背景技术：
牙髓干细胞(dpscs)属于多能成体干细胞，并且具有分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的潜能。研究表明，牙髓干细胞能够用于牙本质、牙髓、牙体组织的修复与再生，还可用于颅骨、颌骨及面骨的损伤修复，牙髓干细胞在其他疾病方面的应用研究也很多，例如：牙髓干细胞可用于治疗脑血管意外损伤、脊髓损伤、帕金森氏病、心肌梗死、糖尿病和免疫缺陷性等疾病。
由于人口腔中细菌和真菌的种类繁多、数量巨大，牙髓干细胞在制备过程中极易污染，通常会通过加大抗生素的用量或提高抗生素等级来降低污染几率，从而导致抗生素滥用。而且组织贴壁法培养牙髓干细胞，周期较长。因此，在牙髓干细胞制备过程中防止抗生素滥用、提高分离牙髓干细胞的效率、缩短生长周期，是本领域亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种制备牙髓干细胞的改良法。该方法既有效降低细菌和真菌对牙髓干细胞的污染，又避免了抗生素滥用，而且对人体无毒无害。此外，牙髓采用先消化后贴壁的提取方法，且培养初期添加干细胞生长因子，有效促进牙髓干细胞生长，缩短获得牙髓干细胞的时间。
本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：
一种制备牙髓干细胞的方法，包括以下步骤：
s1、牙齿的采集；
s2、分离牙髓干细胞，固定住牙齿，劈开牙冠，取出牙髓，将取出的牙髓放入pbs中冲洗，然后将取出的牙髓制成1-3mm3的块状，加入0.025%-0.2%的ⅰ型胶原酶和0.025%-0.2%的中性蛋白酶的混合液，37℃消化10min-30min，加入pbs，1000rpm-1500rpm离心弃上清，沉淀加入培养基浸润，将组织块贴到细胞培养皿中，置co2培养箱中培养。
作为一种改进：在步骤s2中，培养皿中组织块与组织块间隔4-5mm，每块组织上滴培养基，所述co2培养箱内饱和湿度，5%co2，37℃。
作为一种改进：还包括以下步骤：
s3、后期培养，4-6h后补加培养基，第3-5天继续补加培养基，第7-9天半量换液，第10-15天显微镜下观察细胞克隆情况，若细胞形态均一且数量符合预定值，需弃组织块全换液，若细胞数量不符合预定值，需继续半量换液至细胞数量符合预定值，方可弃组织块全换液，此后每2-3天换液一次。
作为一种改进：在步骤s1中，采集后牙齿置于运输液中保存和运输，所述运输液包括以下组分：
抗菌肽10-30ug/ml；
猪胆盐0.3-0.8mg/ml；
氯化两面针碱1-10ug/ml；
溶剂为pbs。
抗菌肽一般由20-60个氨基酸组成，具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，可以快速查杀靶标。除此之外，抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等也有杀灭作用，还可以提高免疫力、加速伤口愈合等。
胆盐（bilesalt)是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐，它是胆汁中参与脂肪消化和吸收的主要成分。由于其具有降低细胞膜表面张力，使细胞膜损坏或菌体裂解等特性，使一些细菌难以生长，对革兰氏阳性杆菌有较强的抑制能力。
氯化两面针碱是从芸香科花椒属植物两面针的干燥根中提取的一种生物碱，其具有抗炎、抗真菌、抗氧化的作用。氯化两面针碱来源于植物，可提取分离，能定性定量控制，高效低毒，是一种很有发展前途的抗肿瘤、抗真菌生物活性成分。
作为一种改进：所述培养基包括以下组分：
dmem/f12培养基60-80%；
间充质干细胞专用血清替代物5-15%；
间充质干细胞培养上清15-25%。
作为一种改进：所述培养基内含有80-100u/ml的青链霉素。
作为一种改进：所述间充质干细胞培养上清的制备方法包括以下步骤：
a1、收集细胞培养两天以上，生长状态好，融合率70%以上的细胞培养上清液；
a2、收集到的上清液2000-4000rpm离心10-20min，弃沉淀；
a3、离心后的上清液用0.22um微孔滤膜过滤。
作为一种改进：所述培养皿经过明胶溶液包被，明胶溶液完全覆盖培养皿底，然后室温放置0.5-2h，弃掉明胶，用pbs洗涤，室温放置0.5-2h，所述明胶溶液包括以下组分：
明胶0.1-2%；
溶剂为pbs。
明胶(gelatin)是一种高分子量的水溶性蛋白混合物，主要存在于胶原中。易溶于水，无异味，属无毒无刺激性原料，适用于牙用制剂、吸入制剂、注射剂、口服胶囊、锭剂、糖浆剂、片剂、外用制剂和阴道制剂。
作为一种改进：所述明胶溶液高温高压蒸汽灭菌15-20min。
作为一种改进：在步骤s1中，对采集的牙齿进行消毒，在超净台中取出牙齿，用酒精擦洗浸泡4-6min，再用含抗菌肽、猪胆盐和氯化两面针碱的pbs冲洗。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：
1、提供的培养基中含有人间充质干细胞培养上清液，细胞对数生长期的培养上清中含有大量干细胞生长因子，能够在牙髓组织贴壁培养初期供其所需，有效促进牙髓干细胞生长，缩短收获牙髓干细胞所需的时间。
2、提供的运输液中含有抗菌肽、猪胆盐和氯化两面针碱，能有效抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，既可有效降低细菌和真菌对牙髓干细胞的污染，又防止了抗生素的滥用。
3、提供的细胞培养皿需经明胶包被，用pbs冲洗后晾干，有利于牙髓间充质干细胞贴壁生长，可以获取更多的间充质干细胞。
4、提供的消化贴壁法所用的酶为ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的混合物，ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶的作用都比较温和，既可以降低周围组织对干细胞的禁锢，又不会对细胞造成损伤，即保证了分离干细胞的纯度，又缩短了收获细胞所需的时间。
具体实施方式
实施例1：一种制备牙髓干细胞的方法，包括以下步骤：
s1、牙齿的采集；采集的牙齿需完整，无龋无牙髓炎和牙髓坏死等症状，采集后牙齿置于运输液中保存和运输，将采集的牙齿放入预冷的运输液中，然后放入4℃恒温运输箱中运输至实验室，24h内分离。
所述运输液包括以下组分：
抗菌肽10ug/ml；
猪胆盐0.3mg/ml；
氯化两面针碱1ug/ml；
溶剂为无菌pbs。
有效防止革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌污染，且三者均为天然化合物，减少抗生素滥用。
对采集的牙齿进行消毒；在超净台中取出牙齿，用酒精擦洗浸泡5min，再用4℃预冷的含抗菌肽、猪胆盐和氯化两面针碱的pbs冲洗2遍。
s2、分离牙髓干细胞，用镊子固定住牙齿，持牙釉凿对准牙冠沟，轻敲牙釉凿劈开牙冠，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓，将取出的牙髓放入无菌pbs中冲洗2遍，然后用剪刀将取出的牙髓制成1mm3的块状，转移到50ml离心管中，加入牙髓等体积的0.025%的ⅰ型胶原酶和0.025%的中性蛋白酶的混合液，37℃消化10min，加入牙髓4倍体积的pbs，1000rpm离心弃上清，沉淀加入培养基浸润，将组织块贴到细胞培养皿中，培养皿中组织块与组织块间隔4mm，每块组织上滴培养基置co2培养箱中培养，所述co2培养箱内饱和湿度，5%co2，37℃。
先用ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶对牙髓组织块进行轻微消化，再将组织块进行贴壁培养，ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶的作用比较温和，既可以降低周围组织对干细胞的禁锢，又不会对细胞造成损伤，既保证了分离干细胞的纯度，又缩短了收获细胞所需的时间。
所述培养基包括以下组分：
dmem/f12培养基60%；
间充质干细胞用血清替代物15%；
间充质干细胞培养上清25%；
所述培养基内含有80u/ml的青链霉素。
所述间充质干细胞培养上清的制备方法包括以下步骤：
a1、收集细胞培养两天以上，生长状态好，融合率70%以上的细胞培养上清液，无血清培养体系下复苏一管人牙髓、骨髓、胎盘或脐带间充质干细胞，收集细胞培养上清，需要注意的是，细胞复苏后第一次培养的上清不收集；
a2、收集到的上清液2000rpm离心10min，弃沉淀；
a3、离心后的上清液用0.22um微孔滤膜过滤；
a4、分装后-20℃保存备用。
所述间充质干细胞培养上清为生长对数期的间充质干细胞培养上清液，含有大量干细胞生长因子，能够有效促进牙髓干细胞的生长，缩短收获牙髓干细胞所需的时间。
所述培养皿经过明胶溶液包被，明胶溶液完全覆盖培养皿底，然后室温放置0.5h，弃掉明胶，用pbs洗涤，室温放置0.5h，所述明胶溶液包括以下组分：
明胶0.1%；
溶剂为无菌pbs。
所述明胶溶液高温高压蒸汽灭菌15min，分装后-20℃保存备用。
培养皿经过明胶包被，有利于牙髓间充质干细胞贴壁生长，可以获取更多的间充质干细胞。
s3、后期培养，4h后补加培养基，第3天继续补加培养基，观有无污染，第7天有细胞爬出，半量换液，第10天显微镜下观察细胞克隆情况，有5块组织爬出细胞，弃组织块全换液，此后每2天换液一次。
实施例2：一种制备牙髓干细胞的方法，包括以下步骤：
s1、牙齿的采集；采集的牙齿需完整，无龋无牙髓炎和牙髓坏死等症状，采集后牙齿置于运输液中保存和运输，将采集的牙齿放入预冷的运输液中，然后放入4℃恒温运输箱中运输至实验室，24h内分离。
所述运输液包括以下组分：
抗菌肽20ug/ml；
猪胆盐0.5mg/ml；
氯化两面针碱5ug/ml；
溶剂为无菌pbs。
有效防止革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌污染，且三者均为天然化合物，减少抗生素滥用。
对采集的牙齿进行消毒；在超净台中取出牙齿，用酒精擦洗浸泡5min，再用4℃预冷的含抗菌肽、猪胆盐和氯化两面针碱的pbs冲洗3遍。
s2、分离牙髓干细胞，用镊子固定住牙齿，持牙釉凿对准牙冠沟，轻敲牙釉凿劈开牙冠，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓，将取出的牙髓放入无菌pbs中冲洗3遍，然后用剪刀将取出的牙髓制成2mm3的块状，转移到50ml离心管中，加入牙髓等体积的0.1%的ⅰ型胶原酶和0.1%的中性蛋白酶的混合液，37℃消化20min，加入牙髓5倍体积的pbs，1500rpm离心弃上清，沉淀加入培养基浸润，将组织块贴到细胞培养皿中，培养皿中组织块与组织块间隔5mm，每块组织上滴培养基置co2培养箱中培养，所述co2培养箱内饱和湿度，5%co2，37℃。
先用ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶对牙髓组织块进行轻微消化，再将组织块进行贴壁培养，ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶的作用比较温和，既可以降低周围组织对干细胞的禁锢，又,不会对细胞造成损伤，既保证了分离干细胞的纯度，又缩短了收获细胞所需的时间。
所述培养基包括以下组分：
dmem/f12培养基70%；
间充质干细胞用血清替代物10%；
间充质干细胞培养上清20%；
所述培养基内含有100u/ml的青链霉素。
所述间充质干细胞培养上清的制备方法包括以下步骤：
a1、收集细胞培养两天以上，生长状态好，融合率70%以上的细胞培养上清液，无血清培养体系下复苏一管人牙髓、骨髓、胎盘或脐带间充质干细胞，收集细胞培养上清，需要注意的是，细胞复苏后第一次培养的上清不收集；
a2、收集到的上清液2500rpm离心15min，弃沉淀；
a3、离心后的上清液用0.22um微孔滤膜过滤；
a4、分装后-20℃保存备用。
所述间充质干细胞培养上清为生长对数期的间充质干细胞培养上清液，含有大量干细胞生长因子，能够有效促进牙髓干细胞的生长，缩短收获牙髓干细胞所需的时间。
所述培养皿经过明胶溶液包被，明胶溶液完全覆盖培养皿底，然后室温放置1h，弃掉明胶，用pbs洗涤，室温放置1h，所述明胶溶液包括以下组分：
明胶0.15%；
溶剂为无菌pbs。
所述明胶溶液高温高压蒸汽灭菌18min，分装后-20℃保存备用。
培养皿经过明胶包被，有利于牙髓间充质干细胞贴壁生长，可以获取更多的间充质干细胞。
s3、后期培养，5h后补加培养基，第4天继续补加培养基，观察无污染，第8天有细胞爬出，半量换液，第11天显微镜下观察细胞克隆情况，有6块组织爬出细胞，弃组织块全换液，此后每3天换液一次。
实施例3：一种制备牙髓干细胞的方法，包括以下步骤：
s1、牙齿的采集；采集的牙齿需完整，无龋无牙髓炎和牙髓坏死等症状，采集后牙齿置于运输液中保存和运输，将采集的牙齿放入预冷的运输液中，然后放入4℃恒温运输箱中运输至实验室，24h内分离。
所述运输液包括以下组分：
抗菌肽30ug/ml；
猪胆盐0.8mg/ml；
氯化两面针碱10ug/ml；
溶剂为无菌pbs。
有效防止革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌污染，且三者均为天然化合物，减少抗生素滥用。
对采集的牙齿进行消毒；在超净台中取出牙齿，用酒精擦洗浸泡5min，再用4℃预冷的含抗菌肽、猪胆盐和氯化两面针碱的pbs冲洗4遍。
s2、分离牙髓干细胞，用镊子固定住牙齿，持牙釉凿对准牙冠沟，轻敲牙釉凿劈开牙冠，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓，将取出的牙髓放入无菌pbs中冲洗4遍，然后用剪刀将取出的牙髓制成3mm3的块状，转移到50ml离心管中，加入牙髓等体积的0.2%的ⅰ型胶原酶和0.2%的中性蛋白酶的混合液，37℃消化30min，加入牙髓6倍体积的pbs，1500rpm离心弃上清，沉淀加入培养基浸润，将组织块贴到细胞培养皿中，培养皿中组织块与组织块间隔5mm，每块组织上滴培养基置co2培养箱中培养，所述co2培养箱内饱和湿度，5%co2，37℃。
先用ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶对牙髓组织块进行轻微消化，再将组织块进行贴壁培养，ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶的作用比较温和，既可以降低周围组织对干细胞的禁锢，又不会对细胞造成损伤，既保证了分离干细胞的纯度，又缩短了收获细胞所需的时间。
所述培养基包括以下组分：
dmem/f12培养基80%；
间充质干细胞用血清替代物5%；
间充质干细胞培养上清15%；
所述培养基内含有100u/ml的青链霉素。
所述间充质干细胞培养上清的制备方法包括以下步骤：
a1、收集细胞培养两天以上，生长状态好，融合率70%以上的细胞培养上清液，无血清培养体系下复苏一管人牙髓、骨髓、胎盘或脐带间充质干细胞，收集细胞培养上清，需要注意的是，细胞复苏后第一次培养的上清不收集；
a2、收集到的上清液4000rpm离心20min，弃沉淀；
a3、离心后的上清液用0.22um微孔滤膜过滤；
a4、分装后-20℃保存备用。
所述间充质干细胞培养上清为生长对数期的间充质干细胞培养上清液，含有大量干细胞生长因子，能够有效促进牙髓干细胞的生长，缩短收获牙髓干细胞所需的时间。
所述培养皿经过明胶溶液包被，明胶溶液完全覆盖培养皿底，然后室温放置2h，弃掉明胶，用pbs洗涤，室温放置2h，所述明胶溶液包括以下组分：
明胶2%；
溶剂为无菌pbs。
所述明胶溶液高温高压蒸汽灭菌20min，分装后-20℃保存备用。
培养皿经过明胶包被，有利于牙髓间充质干细胞贴壁生长，可以获取更多的间充质干细胞。
s3、后期培养，6h后补加培养基，第5天继续补加培养基，观察无污染，第9天有细胞爬出，半量换液，第15天显微镜下观察细胞克隆情况，有7块组织爬出细胞，弃组织块全换液，此后每3天换液一次。
以上对本发明的数个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。