定量检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种荧光定量pcr试剂盒及其应用，特别涉及一种定量检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量pcr试剂盒及其应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术：

鸡的马立克氏病(marek’sdisease，md)是鸡的一种重要病毒性传染病，病原为鸡马立克氏病病毒(marek’sdiseasevirus，mdv)。md流行病学研究证实我国的mdv野毒株持续发生变异，向更强的毒力方向进化，现地已经出现能够突破现有md疫苗(cvi988株、814株)保护的mdv强毒株。

针对mdv毒力不断增强、严重危害养禽业发展的状况，我国学者通过基因重组技术，缺失mdv流行毒株的主要毒力基因-meq基因，研发了具有更高免疫效力的鸡马立克氏病病毒meq基因缺失疫苗株(rmsδmeq株，该毒株记载在公开号为cn102363769b，发明名称为“鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用”的专利申请中，其微生物保藏编号是：cgmccno.4612)，该疫苗株对mdv变异毒株能提供良好的疫苗保护作用。md疫苗抗肿瘤但不能阻止野毒株的感染，野毒株可以和疫苗毒株共存于体内，并且可以排放到环境中，而鸡体内疫苗毒株和野毒株的分别定量对于该病的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。目前尚没有一种有效的、准确的区分mdv基因缺失疫苗和野毒株的荧光定量方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可定量检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量pcr试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种定量检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量pcr试剂盒，含有两套分别用于检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量pcr引物和探针，其中用于检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株的荧光定量pcr引物序列如seqidno.1以及seqidno.2所示，探针序列如seqidno.3所示；用于检测鸡马立克氏病毒野毒株的荧光定量pcr引物序列如seqidno.4以及seqidno.5所示，探针序列如seqidno.6所示，所述的探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括用于扩增作为内参的鸡的管家基因卵铁转蛋白基因(ovo)的引物和探针。

其中，优选的，所述的用于扩增作为内参的鸡的管家基因卵铁转蛋白基因(ovo)的引物序列如seqidno.7以及seqidno.8所示，探针序列如seqidno.9所示，所述的探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括extaqdna聚合酶，10×extaq缓冲液、dntp混合物以及阳性标准品。

其中，优选的，所述的阳性标准品包括分别含有鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株片段的质粒，所述的质粒是用上述的引物从鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株上分别扩增出各自的片段连接到pmd18t载体上得到的。

其中，优选的，鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株为rmsδmeq，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号是：cgmccno.4612。该毒株已记载在公开号为cn102363769b，发明名称为“鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用”的专利申请中。

其中，优选的，使用所述的试剂盒用于定量检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株时，按照以下步骤进行：

(1)提取待检样本的总dna；

(2)荧光定量方法标准曲线建立

将阳性标准品质粒从10⁹copies/ul到10¹copies/ul系列稀释作为模板，以本发明所述的引物和探针进行荧光定量pcr扩增，用于建立标准曲线；

(3)以步骤(1)提取的总dna为模板，以本发明所述的引物和探针进行荧光定量pcr扩增；

(4)pcr反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量。

其中，优选的，还包括以步骤(1)提取的总dna为模板，以权利要求2或3中所述的引物和探针进行荧光定量pcr扩增，计算病毒拷贝数和管家基因卵铁转蛋白基因拷贝数的比值，得到单位细胞里的病毒拷贝数。

其中，优选的，荧光定量pcr的反应体系为25ul，25ul体系里含有0.25ulextaqdna聚合酶，2.5ul10×extaq缓冲液，2uldntp混合物，1ul上游引物，1ul下游引物，1ul探针，2ul模板dna和15.25ul无菌水。

其中，优选的，荧光定量pcr的反应条件为：95℃5min；95℃15s、60℃45s，40个循环；37℃5min。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

md对养禽业有重大危害，它的防控主要依靠疫苗免疫。md疫苗不能清除mdv野毒株的感染和阻止野毒株排放，因此疫苗毒株和野毒株往往在鸡体内共存，且由于疫苗毒株和野毒株在基因组水平上的特异性差异较小，这给它们在体内载量的精确定量带来困难。

本发明针对鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗和mdv野毒建立了两套荧光定量pcr方法，一套荧光定量pcr方法只能检测到鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株，检测不到其它mdv野毒株；另外一套荧光定量pcr方法能检测到所有mdv野毒株，检测不到鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株。经过体外实验证明这两套荧光定量pcr方法敏感性高，特异型好，重复性好，能分别准确定量鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和mdv野毒株。

此外，本发明的方法可以在鸡同时接种或感染mdv疫苗毒株和野毒株的情况下，通过计算病毒拷贝数和管家基因卵铁转蛋白基因拷贝数的比值，得到单位细胞里的病毒拷贝数，从而对它们进行精确定量。本发明的提出对mdv的感染进程的分析研究、对于鸡马立克氏病的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。

附图说明

图1为rms-qpcr上下游引物探针设计模式图，引物和探针在meq基因的位置用黑色箭头和灰色线段标示；

图2为mdv-qpcr上下游引物探针设计模式图，引物和探针在meq基因的位置用黑色箭头和灰色线段标示；

图3为mdv-qpcr的敏感性试验结果(a)及标准曲线(b)；

图4为rms-qpcr的敏感性试验结果(a)及标准曲线(b)；

图5为mdv-qpcr的特异性检测；

图中1代表rmsδmeq株的扩增曲线，2-9分别代表mdv中国分离株lcc、bs、hs、lts、lms株，中国疫苗株814株和mdv美国株ga、md5株的扩增曲线；

图6为rms-qpcr的特异性检测；

图中1代表rmsδmeq株的扩增曲线，2-9分别代表mdv中国分离株lcc、bs、hs、lts、lms株，中国疫苗株814株和mdv美国株ga、md5株的扩增曲线；

图7为基因缺失疫苗株rmsδmeq对mdv-qpcr检测的干扰分析；

将mdvdna(感染中国分离株lms细胞的总dna提取物)分别10倍梯度稀释到基因缺失疫苗株dna(感染rmsδmeq的细胞的总dna提取物)和对照dna(空白细胞培养物提取的总dna)中，应用mdv-qpcr进行检测；●代表在基因缺失疫苗rmsδmeq株干扰情况下的检测值，■代表无干扰情况下的检测值；

图8为mdv毒株对rms-qpcr检测的干扰分析；

将基因缺失疫苗株dna(感染rmsδmeq的细胞的总dna提取物)分别10倍梯度稀释到mdvdna(感染中国分离株lms细胞的总dna提取物)和对照dna(空白细胞培养物提取的总dna)中，应用rms-qpcr进行检测；●代表在mdvdna干扰情况下的检测值，■代表无干扰情况下的检测值；

图9为应用mdv-qpcr对免疫攻毒的spf鸡体内mdv野毒病毒载量的动态检测；

图中横坐标为免疫时间(天)，纵坐标为log10(每10⁶细胞中mdv野毒株在羽髓的复制拷贝数)；●、■、▲、▼曲线分别为rmsδmeq疫苗免疫和非免疫情况下，mdv分离株lts、lcc株攻毒后鸡的羽髓中病毒载量动态检测值；

图10为应用rms-qpcr对免疫攻毒的spf鸡体内rmsδmeq病毒载量的动态检测。

图中横坐标为免疫时间(天)，纵坐标为log10(每10⁶细胞中mdv野毒株在羽髓的复制拷贝数)；●、■、▲曲线分别为rmsδmeq疫苗免疫攻毒(mdvlts、lcc株)及只免疫未攻毒鸡的羽髓中rmsδmeq疫病毒载量动态检测值；

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1定量检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量pcr方法的建立

1、引物和探针设计

仅能检测鸡马立克氏病病毒meq基因缺失疫苗株rmsδmeq株(该毒株记载在公开号为cn102363769b，发明名称为“鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用”的专利申请中，其微生物保藏编号是：cgmccno.4612)的荧光定量pcr命名为：rms-qpcr，rms-qpcr的上下游引物和探针设计如图1所示；检测所有mdv野毒株的荧光定量pcr命名为：mdv-qpcr，mdv-qpcr的上下游引物和探针设计如图2所示。所有引物以及探针序列见表1，所述的探针的5’端标记有报告基团fam，3’端标记有荧光淬灭基团tamra。

表1荧光定量pcr所用的引物和探针序列

2、荧光定量体系及反应条件

荧光定量pcr的反应体系为25ul，25ul体系里含有0.25ulextaq，2.5ul10×extaq缓冲液，2uldntp混合物(takarabiotechnologyco.，ltd.，dalian，china)，1ul上游引物(10umol)，1ul下游引物(10umol)，1ul探针(10umol)，2ul模板dna和15.25ul无菌水。反应条件：95℃5min；95℃15s、60℃45s，40个循环；37℃5min。在60℃下检测荧光信号。

3、荧光定量方法标准曲线建立

用上述荧光定量方法的上下游引物，以mdv毒株病毒dna为模板分别扩增出相应片段，克隆到pmd18t载体上用作阳性标准品。根据公式n＝(c×10^-9)/(m×660)×6.02×10²³(c为标准品浓度，m为构建的质粒碱基数)计算质粒拷贝数。将质粒从10⁹copies/ul到10¹copies/ul10倍系列稀释作为模板，用于建立荧光定量方法的标准曲线。以此方法建立的mdv-qpcr标准曲线见图3b，rms-qpcr的标准曲线见图4b。

4、敏感性试验

将标准品质粒从10⁹copies/ul到10¹copies/ul来进行10倍稀释，将稀释后的标准品质粒作为模板进行荧光定量pcr反应，mdv-qpcr以及rms-qpcr的敏感性试验结果见图3a和图4a，两套荧光定量pcr的灵敏度均能达到10拷贝。

5、特异性试验

分别从实验室保存的mdv分离株lcc、bs、hs、lts、lms株，疫苗株814，美国毒株ga和md5株以及rmsδmeq株细胞感染物中提取总dna，以其为模板，进行荧光定量pcr反应，验证这两套荧光定量方法的特异性。mdv-qpcr能检测到所有mdv野毒株，检测不到rmsδmeq株，结果见图5；rms-qpcr能检测到rmsδmeq株，检测不到其它mdv野毒株，结果见图6。

6、重复性试验

以10倍系列稀释的3个梯度的标准质粒为模板，分别进行组内和组间平行试验。组内平行试验方法是在一次pcr检测中，每个样品做3个重复；组间平行试验方法是每个样品做3次不同批次的检测。计算组内和组间变异系数，分析试验的可重复性。实验结果显示这两套荧光定量检测方法的组内变异均低于1％，组间变异均低于2％。mdv-qpcr的重复性试验结果见表2，rms-qpcr的重复性试验结果见表3。

表2mdv-qpcr的重复性试验

表3rms-qpcr的重复性试验

7、rmsδmeq株和mdv野毒株体外混合感染的定量检测

将mdvdna(感染中国分离株lms细胞的总dna提取物)以1:10000,1:1000,1:100,1:10,1:1五个稀释度，分别稀释到基因缺失疫苗株dna(感染rmsδmeq的细胞的总dna提取物)和对照dna(空白细胞培养物提取的总dna)中，应用mdv-qpcr对上述两种系列模板进行检测。结果表明，不同梯度稀释情况下，混有疫苗毒株和空白对照的定量检测值无显著差异，检测结果一致，证实rmsδmeq株的dna对mdv-qpcr的检测没有影响，结果见图7。

将基因缺失疫苗株dna(感染rmsδmeq的细胞的总dna提取物)以1:10000,1:1000,1:100,1:10,1:1五个稀释度，分别稀释到mdvdna(感染中国分离株lms细胞的总dna提取物)和对照dna(空白细胞培养物提取的总dna)中，应用rms-qpcr对上述两种系列模板进行检测。检测结果显示，在rmsδmeq1:100、1:10和1:1稀释情况下，两个系列无显著差异；较高稀释度情况下(1:10000,1:1000)，混有mdv野毒的rmsδmeq拷贝数检测要略小于对照。检测结果见图8。上述试验表明当mdv野毒株的dna含量要远高于rmsδmeq株的dna含量时(1:10000,1:1000)，rms-qpcr对rmsδmeq株的dna的检测值会比真实值略小，但随着rmsδmeq株的dna的比例增大时，rms-qpcr能准确定量rmsδmeq株的拷贝数。证实在正常的混合感染比例范围内，rms-qpcr可以对rmsδmeq的拷贝数进行精确定量。

8、rms-qpcr和mdv-qpcr在免疫攻毒的spf鸡体内定量检测应用

将24只1日龄spf白色来亨鸡随机分成6组，每组4只鸡。分组如下：第1组，rmsδmeq株疫苗免疫组；第2组，rmsδmeq株免疫-lcc攻毒组；第3组，rmsδmeq株免疫-lts攻毒组；第4组，lcc攻毒组；第5组，lts攻毒组；第6组，空白对照组。1日龄，1-3组颈背部皮下免疫接种rmsδmeq株，接种剂量为2000pfu；7日龄，2、4组分别腹腔接种1000pfu的mdv野毒株lcc,3、5组分别腹腔接种1000pfu的mdv野毒株lts；6组为空白对照组。于攻毒后7天、14天、21天、28天、35天采集羽髓，提取总dna，用本发明的两套荧光定量检测方法进行检测，并根据标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量。同时，用鸡的管家基因卵铁转蛋白基因(ovo)作为内参，对相应的采集样品中的细胞拷贝数进行定量pcr检测。

ovo引物探针序列(5’-3’)如下：

ovo-f:cactgccactgggctctgt(seqidno.7)；

ovo-r:gcaatggcaataaacctccaa(seqidno.8)；

ovo-p:fam-agtctggagaagtctgtgcagcctcca-tamra(seqidno.9)。

荧光定量体系及反应条件：

荧光定量pcr的反应体系为25ul，25ul体系里含有0.25ulextaq，2.5ul10×extaq缓冲液，2uldntp混合物(takarabiotechnologyco.，ltd.，dalian，china)，1ulovo-f(10umol)，1ulovo-r(10umol)，1ul探针(10umol)，2ul模板dna和15.25ul无菌水。反应条件：95℃5min；95℃15s、60℃45s，40个循环；37℃5min。在60℃下检测荧光信号。

计算病毒拷贝数和细胞拷贝数(即管家基因拷贝数)的比值，得到单位细胞里的病毒拷贝数，便于对体内病毒载量的分析。

首先，应用mdv-qpcr对采集的样品中野毒株的载量进行检测，结果显示，非免疫野毒攻毒组(4、5组)的野毒株载量在鸡体内呈现逐渐上升的趋势，由最初的10^2-3拷贝数/10⁶细胞数上升到10^6-7拷贝数/10⁶细胞数，符合mdv野毒株在鸡体内的复制规律。免疫攻毒组(2、3组)野毒株载量显著低于相应的攻毒组，病毒滴度下降几十到100倍以上，显示rmsδmeq显著地抑制了野毒株在鸡体内的复制。同时对rmsδmeq疫苗免疫组的检测没有荧光信号，也显示在体内mdv-qpcr只能检测到mdv野毒株，不能检测到rmsδmeq疫苗，检测结果见图9。

随后，应用rms-qpcr对采集的样品中rmsδmeq疫苗株的载量进行检测，结果显示，rmsδmeq疫苗在体内的病毒滴度在14天到达较高值(10⁶拷贝/10⁶细胞数)，随着时间的推移，至免疫28日之后，疫苗在体内的滴度下降至较低水平(10^2-3拷贝/10⁶细胞数)，符合一般的md疫苗毒株在体内的复制规律。同时也发现，在整个感染进程中，野毒株对疫苗毒株的复制也有一定的干扰作用，攻毒后疫苗在体内的复制水平有所下降。另外，结果也表明rms-qpcr只能检测到rmsδmeq株，对攻毒组的检测没有荧光信号，证实了它检测不到mdv野毒株。检测结果见图10。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

哈尔滨维科生物技术有限公司

<120>定量检测鸡马立克氏病毒meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量pcr试剂盒及其应用

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