一种与肺腺癌有关的KCNJ4基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种与肺腺癌有关的基因及其应用，是属于生物技术领域。

背景技术：

肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症。肺腺癌(lungadenocarcinoma)是肺癌的一种，属于非小细胞癌，多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部x线检查时被发现。表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移。淋巴转移则发生较晚。分化程度较好的腺癌主要由腺体结构组成，具有腺腔或分泌粘膜，有时呈乳头状结构。分化程度低的腺癌可无腺腔结构，癌细胞集聚，呈片状或索状。腺癌细胞一般较大，胞浆丰富，含有分泌颗粒或粘液泡，胞核较大，癌细胞表面可见到丰富的微绒毛。肺腺癌女性多见，在男性亦有增多的趋势。与吸烟关系不大，多生长在肺边缘小支气管的粘液腺，因此在周围型肺癌中以腺癌最为常见。腺癌约占原发性肺癌的25％。腺癌倾向于管外生长，但也循泡壁蔓延，常在肺边缘部形成直径2～4cm的肿块。腺癌富血管，故局部浸润和血行转移较鳞癌早。易转移至肝、脑和骨，更易累及胸膜而引起胸腔积液。

肺腺癌通常选用手术治疗和放射治疗、化学药物治疗、靶向药物治疗及免疫治疗等。手术治疗切除病灶后使用腔内、体外照射的设备作为术后的辅助治疗来提高手术的成功率。化学药物治疗是一种较为重要的方式，无论是早期还是晚期，无论手术还是放疗都需要结合化疗才能提高生存率。但是无论手术、放疗还是化疗都存在治疗的针对性不强、降低患者免疫力、治愈率不高的缺点。而靶向治疗及免疫治疗可以提高部分患者的有效率。

此外，一般早期肺腺癌患者病灶较小，肿瘤局限于一个肺叶内，及时进行妥善的治疗，清除癌变病灶，防止复发，可获得根治即早期肺腺癌的治愈率可达到80-90％，但是通常早期很难发现，而局部晚期的患者的总体治疗效果较差，ⅲa期患者的5年生存率为15-23％，ⅲb期仅为6-7％。因此，深入研究肺腺癌相关基因机制，对于肺腺癌的早期诊断和靶向治疗都有重要的意义。

基因kcnj4是构成钾进出通道的亚家族j的第四号基因，编码内向整流钾通道蛋白，其可能与难治性颞叶癫痫等一些疾病的致病有关。然而，kcnj4在肺腺癌中的表达及其生物学意义尚不清楚。

技术实现要素：

本发明首先筛选到一种在a549肺腺癌细胞株中高表达的kcnj4基因，然后以kcnj4基因为靶标，筛选出一种以rna干扰的方式敲除kcnj4的表达的抑制剂。敲除kcnj4的表达后，能够抑制a549细胞的增殖、侵袭和迁移能力，因此kcnj4基因可以作为预防或者治疗肺腺癌的基因靶点，筛选预防或治疗肺腺癌的制剂。而这种抑制kcnj4的表达的制剂也为肺腺癌的预防和治疗提供新思路和解决方案。

本发明首先提供了肺腺癌基因kcnj4在作为预防、治疗或者诊断肺腺癌的基因靶点中的应用。

本发明还提供了一种预防或治疗肺腺癌的制剂，该试剂含有定量的抑制kcnj4基因的抑制剂。

进一步的，所述抑制剂以rna干扰方式稳定并特异性的下调kcnj4基因的表达，从而有效抑制人肺腺癌肿瘤细胞的增殖。

进一步的，所述抑制剂可以为sirna。

所述抑制肺腺癌肿瘤细胞中kcnj4基因表达的sirna的构建方法，包括如下步骤：

1)采用人a549肺腺癌细胞株进行细胞培养；

2)针对人类的kcnj4基因，利用sirna设计工具设计sirna1和sirna2两种干扰序列，并进行合成；

3)使用步骤2)中所构建的sirna1和sirna2转染肺腺癌肿瘤细胞；

4)利用荧光定量实时pcr技术对肺腺癌肿瘤细胞中的kcnj4基因表达进行检测，kcnj4基因表达被抑制或敲除则sirna构建成功。

所述sirna的序列如seqidno.1-2所示，如seqidno.1所示序列即为sirna1，如seqidno.2所示序列即为sirna2；

sirna15’-ccgcuucgucaagaagaac-3’(seqidno.1)；

sirna25’-ugcaacguguacuucgcca-3’(seqidno.2)；

其中sirna1抑制kcnj4基因表达量的效果最佳，抑制肺腺癌肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力最佳。

所述肺腺癌肿瘤细胞为人a549肺腺癌细胞株。

上述sirna设计工具采用sidirectversion2.0sirna设计软件。

有益效果：

1、筛选到一种在a549肺腺癌细胞株中高表达的kcnj4基因，敲除kcnj4的表达后，能够抑制a549细胞的增殖、侵袭和迁移能力。kcnj4基因可以作为预防或者治疗肺腺癌的基因靶点，筛选预防或治疗肺腺癌的制剂。

2、以人kcnj4基因为目标，通过选取合适的靶基因序列，以rna干扰的方式设计出具有高效抑制人kcnj4基因的表达，并有效地抑制人肺腺癌肿瘤细胞的增殖的抑制剂，为肺腺癌的预防和治疗提供新思路和解决方案。

附图说明

图1kcnj4基因在不同肺腺癌细胞株中的表达情况。

图2sirna1和sirna2对a549细胞中kcnl4基因的mrna表达水平的影响。

图3sirna1和sirna2对a549细胞中kcnl4基因的蛋白表达水平的影响。

图4kcnj4基因对a549细胞增殖的影响。

图5kcnj4基因对a549细胞的克隆形成率的影响。

图6kcnj4基因对a549细胞的侵袭/迁移的影响。

图7kcnj4基因对表型作用的机制的影响。

具体实施方式

实施例1kcnj4基因在肺腺癌细胞株中的表达情况

一、材料和方法

1、细胞培养

人肺癌细胞株a549及正常细胞株均购自atcc。使用rpmi-1640培养液于37℃，5％co2环境下常规培养,血清浓度为10％，青霉素浓度为100u/ml,链霉素为0.1mg/ml；待细胞进入对数生长期时，使用pbs清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液，种植到六孔板中进行后续实验。

2、rna抽提和荧光定量pcr检测

使用rna抽提试剂盒分别抽提细胞总rna，反转录形成cdna后，实时荧光定量pcr检测kcnj4的表达效果。检测rna含量所用的rna引物如下：

f：5’-taaacttggccctgcgtctt-3’

r：5’-aggttggcgaagtacacgtt-3’

gapdh-f:5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’

gapdh-r：5’–ggctgttgtcatacttctcatgg-3’

荧光定量pcr程序：95℃5min,95℃30s,循环40次，60℃45s,72℃30min；每组设3个复孔，2-△△ct法计算kcnj4的表达量。独立重复三次。

二、统计分析

采用spss22.0统计分析软件对实验数据进行分析。等级资料两个构成比的比较采用卡方检验；多样本间的均值比较采用单因素anova方差分析。

三、结果

kcnj4基因在肺腺癌细胞株中的表达情况：qpcr检测发现，kcnj4基因在a549肺腺癌细胞株中高表达(如图1)。

实施例2检测侵染sirna干扰序列的肿瘤细胞中kcnj4的表达能力、肿瘤细胞的增殖能力、克隆率和侵染能力

一、材料与方法

1如实施例1中所述的细胞培养步骤。

2、设计sirna

针对人类的kcnj4基因，利用sidirectversion2.0sirna设计软件设计2对干扰序列并进行合成。

3、如实施例1所述的rna抽提和荧光定量pcr检测。

4、转染

按照lipofectamine2000转染试剂盒说明进行转染。待六孔板中的细胞长至对数期时，于转染前两小时更换新鲜的完全培养液。脂质体lipofectamine200010ul溶于250ul无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀后室温静置5min；将5ulsirna溶于250ul无血清无抗生素培养基中。(kcnj4sirna1：f:5’-ccgcuucgucaagaagaac-3’及sirna2：f:5’-ugcaacguguacuucgcca-3’)。30min内混合脂质体和sirna的混合液，轻轻混匀后室温静置30min。弃去6孔板中的旧培养基，pbs清洗细胞2次。将500ul脂质体和sirna混合液加入每孔细胞中，轻轻混匀，放培养箱中培养。将细胞放入培养箱孵育6h后，更换完全培养液。24h后可以观察转入sirna表达情况或进行后续实验。

5、westernblot实验

细胞转染48小时后，将六孔板置于冰上，加ripa裂解液(加蛋白酶抑制剂)裂解提取蛋白，bca法测定浓度，95℃加热5min。垂直电泳槽内每孔内加入约20μg蛋白，sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转膜至pvdf膜，5％脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，tbst洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后加ecl显影。quantityone软件扫描灰度值，以gapdh为内参对照，目的蛋白/内参计算各蛋白的相对表达量。显色条带扫描后用bioid软件进行检测，测定目的蛋白与β-actin内参蛋白产物条带的密度值。用目的蛋白与β-actin蛋白的光密度比值作为目的蛋白的相对含量。

6、cck8法测定细胞增殖情况

将转染24小时后的细胞消化计数，制备细胞悬液，取100ul细胞悬液,以每孔1000个细胞的标准种到96孔板中，二氧化碳培养箱中常规培养，每隔24h检测一次细胞活力，检测前每孔加10ulcck8试剂，37℃培养箱中孵育1.5h，使用酶标仪用450nm激发光检测od值，绘制增殖曲线。

7、平板克隆实验

将对数期的细胞用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，制成细胞悬液并计数。以每皿1500个细胞的梯度密度接种含5ml37℃预温培养液的60mm皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。对照组加千分之一dmso，实验组加10umphex。置37℃5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养1-2周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞5ml固定30分钟。然后移去固定液，加适量0.1％结晶紫染色液染30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。计数克隆，并比较克隆形成的大小和数目。

8、transwell迁移和侵袭实验

将提前过夜融解的matrigel基质胶100ul(无血清培养液按1：6稀释)加入到24孔板的transwell小室的上室中，晃匀后置于37℃二氧化碳培养箱中静置4-6小时成胶，后吸干培养液，下室中加500ul无血清培养液，静置半小时水化基底膜。将转染24h后的细胞使用无血清培养制备细胞悬液，100ul细胞悬液(1×105个)加入到上室中，下室中加入500ul完全培养液。过夜后，取出小室，棉签擦掉上室中残余的细胞，pbs清洗后，4％多聚甲醛固定30min。0.1％结晶紫染色20min，pbs清洗后，显微镜下随机选取5个视野，拍照观察计数。迁移实验步骤类似于侵袭实验，transwell小室无须进行铺胶处理，细胞数目将为5000个。二、统计分析

采用spss22.0统计分析软件对实验数据进行分析。等级资料两个构成比的比较采用卡方检验；多样本间的均值比较采用单因素anova方差分析。

三、结果

1、kcnj4敲除效率检测：

携带kcnj4sirna的敲除载体转染至内源性高表达kcnj4的肺癌细胞系a549细胞，以未转染及转染非特异性的序列做对照(scr)。转染72h后提取细胞总rna及蛋白，进行荧光定量pcr(如实施例1中所述)和westernblot检测，如图2所示，sirna1和sirna2可以显著降低a549细胞中kcnj4的rna及蛋白表达水平，敲除效率达90％以上。

2、cck8法检测细胞增殖的实验

如图3所示，转染sirna敲除kcnj4的表达后，能够抑制a549细胞的增殖。

3、克隆形成实验

如图4所示，转染sirna敲除kcnj4显著降低a549细胞的克隆形成率。

4、transwell迁移和侵袭实验

transwell实验结果表明(如图5)，转染sirna敲除kcnj4的表达后，能够抑制a549细胞的侵袭，结果差异显著(p<0.05)，迁移能力也相应的降低，结果差异显著(p<0.05)。放大倍数：100x。

5、kcnj4对表型作用的机制研究验证

如图6所示，转染sirna敲除kcnj4的表达后，mapk号通路被抑制，磷酸化的mek、磷酸化的erk表达量也随之下降。

sequencelisting

<110>山东省胸科医院

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