一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)是人体肠道菌之一，在人体肠道中的丰度较低，一般在3％以下。其从属于akkermansia属、疣微菌门，为革兰氏阴性严格厌氧菌，无质粒；其生长要求较低的氧化还原电势，在有氧情况下不生长；且其可以肠道杯状细胞分泌的黏蛋白作为唯一的碳源、氮源和能源物质。目前，已经有研究表明，阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)在肠道中的丰度与多种生理病理状态相关，肥胖、糖尿病及肠炎人群肠道中的akkermansiamuciniphila丰度会显著降低；动物实验也表明，补充akkermansiamuciniphila可以缓解高脂膳食诱导的小鼠肥胖症状、急慢性酒精灌胃小鼠引起的肝脏炎症等；此外，akkermansiamuciniphila已被证明与癌症pd-1免疫疗法的疗效相关，pd-1免疫疗法起作用的癌症患者粪便中含有更多的akkermansiamuciniphila。因此，akkermansiamuciniphila在糖尿病、酒精性及非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病的治疗以及提高肠道屏障功能、缓解炎症等方面均具有极大的应用前景，如何筛选出更多akkermansiamuciniphila以供研究十分重要。akkermansiamuciniphila最初是由荷兰瓦格宁根大学学者willemdevos团队分离得到(internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,2004)，国内南方医科大学珠江医院彭永正教授团队也依靠瓦格宁根大学willemdevos团队的分离方法从中国南方人群中分离到22株akkermansiamuciniphila菌株。这两个团队的分离方法为：先采用添加了经过纯化的猪胃蛋白的基础培养基作为富集培养基(使用富集培养基进行筛选分离的原理为富集培养基中含有黏蛋白作为唯一的碳源、氮源及能源物质，可使得akkermansiamuciniphila在此培养基中大量增殖而其他肠道微生物因为不能降解黏蛋白而出现生长抑制)对稀释成各梯度的粪便进行富集培养，得到富集培养液；再选择出现浑浊的最低稀释梯度的富集培养液，以添加了0.75％nobleagar的富集培养基作为分离培养基(使用分离培养基进行筛选分离的原理为分离培养基中含有黏蛋白作为唯一碳源、氮源及能源物质，可支持akkermansiamuciniphila的生长)进行分离培养。然而，上述分离方法在实际操作过程中具有许多缺陷：首先，上述分离方法要求所有操作过程在无氧、充氮环境下进行且上述分离方法所使用的培养基要求提前进行气体置换除氧且所有操作过程均不能混入氧气，而多数实验室(尤其是国内实验室)仅配有厌氧工作站，并不具备前期气体置换除氧的装置，使得实验室在进行气体置换除氧时，需采用加热煮沸的方法，给akkermansiamuciniphila的培养造成一定的困难；其次，上述分离方法中要求配置出的液体富集培养基澄清透明，以判断富集管是否有生长，但是，由于willemdevos团队及彭永正教授团队均只公开了其所用富集培养基的配方，并未公布富集培养基的配制方法，而发明人在实际操作中发现，按照常规的溶液配制方法配置得到的富集培养基呈现浑浊状态，完全不能用于akkermansiamuciniphila的筛选；再次，上述分离方法所使用的富集培养基在配方上以nahco3为缓冲溶液，而nahco3在高温高压灭菌的过程中不稳定，极易使得培养基呈碱性，与培养基中金属阳离子如ca2+、mg2+发生沉淀，形成混浊液；最后，上述分离方法使用的nobleagar价格昂贵，不适用于大批量的分离筛选；并且，为了达到深层厌氧培养的目的，上述分离方法使用分离培养基进行分离培养时，使用的是倾注法，倾注法会使得在固体培养基内部生长的菌落小，且没有典型的菌落形态，对于后期筛选来说十分不方便，并不适用于菌种的筛选分离培养。综上，应用已发表的方法进行akkermansiamuciniphila分离中国人群的粪便样本时，akkermansiamuciniphila的阳性率为0。因此，如何进行akkermansiamuciniphila筛选培养基(尤其在成分、配制方法两方面)以及akkermansiamuciniphila筛选方法的优化是亟待解决的技术问题。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用。此阿克曼氏菌特异性筛选培养基包含富集培养基、分离培养基以及初筛培养基；所述富集培养基含有黏蛋白作为唯一碳源；所述分离培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；所述初筛培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；利用此艾克曼菌特异性筛选培养基对粪便进行阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)的筛选，可使阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)的阳性率高达70％。本发明的技术方案如下：本发明提供了一种阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基，所述培养基包含富集培养基、分离培养基以及初筛培养基；所述富集培养基含有黏蛋白作为唯一碳源；所述分离培养基含有脑心浸出液肉汤或含有黏蛋白以及脑心浸出液肉汤；所述初筛培养基含有脑心浸出液肉汤。在本发明的一种实施方式中，所述黏蛋白在富集培养基中的添加量为0.25～2.5g/l；所述黏蛋白在分离培养基中的添加量为0.25～2.5g/l。在本发明的一种实施方式中，所述黏蛋白是经过乙醇洗涤纯化的；所述黏蛋白经乙醇洗涤的次数为2次。在本发明的一种实施方式中，所述黏蛋白的纯化方法为取黏蛋白溶解于缓冲液a中，调节ph至7.8，于25～35℃搅拌1h，得到混合液a；将混合液a调节ph至7.0～7.4，于25～35℃搅拌21h，得到混合液b；将混合液b离心取上清，预冷至0～2℃，得到上清液a；在上清液a中加入预冷至0～2℃的乙醇至上清液a与乙醇的混合液中乙醇的终浓度达60％，得到混合液c；将混合液c于4℃静置2h，去上清，得到沉淀a；将沉淀a用nacl溶液溶解，得到混合液d；将混合液d离心取上清，预冷至0～2℃，得到上清液b；在上清液b中加入预冷至0～2℃的乙醇至上清液b与乙醇的混合液中乙醇的终浓度达60％，得到混合液e；将混合液e于4℃静置2h，去上清，得到沉淀b；将沉淀b用预冷至0～2℃的无水乙醇洗涤后用水重新溶解，得到纯化后的黏蛋白；所述缓冲液a的成分包含kh2po4、na2hpo4、nacl以及吐温80。在本发明的一种实施方式中，所述黏蛋白的纯化方法为取黏蛋白溶解于缓冲液a中，调节ph至7.8，于25～35℃搅拌1h，得到混合液a；将混合液a用浓度为2mol/l的hcl溶液调节ph至7.0～7.4，于25～35℃搅拌21h，得到混合液b；将混合液b在10000g的条件下离心取上清，预冷至0～2℃，得到上清液a；在上清液a中加入预冷至0～2℃的乙醇至上清液a与乙醇的混合液中乙醇的终浓度达60％，得到混合液c；将混合液c于4℃静置2h，去上清，得到沉淀a；将沉淀a用浓度为0.1mol/l的nacl溶液溶解，得到混合液d；将混合液d在10000g的条件下离心取上清，预冷至0～2℃，得到上清液b；在上清液b中加入预冷至0～2℃的乙醇至上清液b与乙醇的混合液中乙醇的终浓度达60％，得到混合液e；将混合液e于4℃静置2h，去上清，得到沉淀b；将沉淀b用预冷至0～2℃的无水乙醇洗涤后用水重新溶解，得到纯化后的黏蛋白；所述缓冲液a的成分包含0.23g/l的kh2po4、2.60g/l的na2hpo4、5.84g/l的nacl以及0.05～0.15ml/l的吐温80。在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基的成分包含黏蛋白以及na2hpo4。在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基成分不包含na2s·9h2o。在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基的成分包含黏蛋白、na2hpo4、l-半胱氨酸盐酸盐、nh4cl、nacl、cacl2·2h2o、mgcl2·6h2o、fecl2·4h2o、h3bo3、zncl2、cucl2·2h2o、mncl2·4h2o、cocl2·6h2o、nicl2·6h2o、na2seo3·5h2o、na2wo4·2h2o、na2moo4·2h2o以及c12h6nnao4。在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基的成分包含0.25～2.5g/l黏蛋白、2.5g/lna2hpo4、0.5～1g/ll-半胱氨酸盐酸盐、0.3g/lnh4cl、0.3g/lnacl、0.11g/lcacl2·2h2o、0.1g/lmgcl2·6h2o、0.00149g/lfecl2·4h2o、1μmol/lh3bo3、0.5μmol/lzncl2、0.1μmol/lcucl2·2h2o、0.5μmol/lmncl2·4h2o、0.5μmol/lcocl2·6h2o、0.1μmol/lnicl2·6h2o、0.1μmol/lna2seo3·5h2o、0.1μmol/lna2wo4·2h2o、0.1μmol/lna2moo4·2h2o以及0.5mg/lc12h6nnao4。在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基的ph为6.5～7。在本发明的一种实施方式中，所述分离培养基的成分包含脑心浸出液肉汤；或所述分离培养基的成分包含脑心浸出液肉汤以及l-半胱氨酸盐酸盐；或所述分离培养基的成分包含脑心浸出液肉汤、l-半胱氨酸盐酸盐以及琼脂；或所述分离培养基的成分包含黏蛋白、脑心浸出液肉汤、l-半胱氨酸盐酸盐以及琼脂。在本发明的一种实施方式中，所述分离培养基的成分包含30～40g/l脑心浸出液肉汤；或所述分离培养基的成分包含30～40g/l脑心浸出液肉汤以及0.5～1g/ll-半胱氨酸盐酸盐或所述分离培养基的成分包含30～40g/l脑心浸出液肉汤、0.5～1g/ll-半胱氨酸盐酸盐以及15～20g/l琼脂；或所述分离培养基的成分包含0.25～2.5g/l黏蛋白、30～40g/l脑心浸出液肉汤、0.5～1g/ll-半胱氨酸盐酸盐以及15～20g/l琼脂。在本发明的一种实施方式中，所述初筛培养基的成分包含脑心浸出液肉汤；或所述初筛培养基的成分包含脑心浸出液肉汤以及l-半胱氨酸盐酸盐。在本发明的一种实施方式中，所述初筛培养基的成分包含30～40g/l脑心浸出液肉汤；或所述初筛培养基的成分包含30～40g/l脑心浸出液肉汤、0.5～1g/ll-半胱氨酸盐酸盐。在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基的制备方法为将水与a液、b液、c液、d液、na2hpo4以及l-半胱氨酸盐酸盐混合，得到混合液；在混合液中加入黏蛋白溶液，离心取上清，得到富集培养基；所述a液(无机盐溶液)的成分包含nh4cl、nacl、cacl2·2h2o以及mgcl2·6h2o。所述b液(酸性微量元素液)的成分包含fecl2·4h2o、h3bo3、zncl2、cucl2·2h2o、mncl2·4h2o、cocl2·6h2o、nicl2·6h2o以及盐酸溶液。所述c液(碱性微量元素液)的成分包含na2seo3·5h2o、na2wo4·2h2o、na2moo4·2h2o以及naoh。所述d液(刃天青储备液)的成分包含c12h6nnao4。在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基的制备方法为将900ml水与12.5mla液、1mlb液、1mlc液、1mld液、2.5gna2hpo4以及1gl-半胱氨酸盐酸盐混合，得到混合液；在混合液中加入40ml的黏蛋白溶液，于5000～12000rpm的转速下离心10～30min后取上清，得到富集培养基；将富集培养基于115℃的条件下进行高压灭菌20min后静置至富集培养基温度为25～35℃。在本发明的一种实施方式中，所述a液(无机盐溶液)的成分包含24g/l的nh4cl、24g/l的nacl、8.8g/l的cacl2·2h2o、以及8g/l的mgcl2·6h2o。在本发明的一种实施方式中，所述b液(酸性微量元素液)的成分包含0.15g/l的fecl2·4h2o、0.062g/l的h3bo3、0.068g/l的zncl2、0.017g/l的cucl2·2h2o、0.099g/l的mncl2·4h2o、0.119g/l的cocl2·6h2o、0.024g/l的nicl2·6h2o以及0.42ml/l的盐酸溶液。在本发明的一种实施方式中，所述盐酸溶液为浓度12mol/l的浓盐酸溶液。在本发明的一种实施方式中，所述c液(碱性微量元素液)的成分包含0.026g/l的na2seo3·5h2o、0.033g/l的na2wo4·2h2o、0.024g/l的na2moo4·2h2o以及0.4g/l的naoh。在本发明的一种实施方式中，所述d液(刃天青储备液)的成分包含0.5g/l的c12h6nnao4。在本发明的一种实施方式中，所述黏蛋白溶液中黏蛋白的含量为0.5～2.4g/l。本发明提供了一种筛选阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)的方法，所述方法为使用权利要求1-6任一所述的一种阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基。在本发明的一种实施方式中，所述方法为将待筛选样品用含有l-半胱氨酸盐酸盐的pbs缓冲溶液按照10倍梯度稀释至肉眼不可见浑浊，得到第一个肉眼不可见浑浊样品；将第一个肉眼不可见浑浊样品再稀释1个10倍梯度、2个10倍梯度以及3个10倍梯度，分别得到第二个肉眼不可见浑浊样品、第三个肉眼不可见浑浊样品以及第四个肉眼不可见浑浊样品；将第一个肉眼不可见浑浊样品、第二个肉眼不可见浑浊样品、第三个肉眼不可见浑浊样品以及第四个肉眼不可见浑浊样品分别接种至权利要求1-6任一所述的一种阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基中的富集培养基中，于37℃厌氧恒温培养48～72h，得到富集样品；选择在富集培养基中生长浑浊、没有沉淀、结块或丝状物且稀释梯度更高的富集样品进行第一次pcr检测，得到阳性的富集样品；将阳性的富集样品用pbs缓冲溶液进行梯度稀释至10-1～10-9，得到稀释后富集样品；取10-3～10-9稀释梯度的稀释后富集样品涂布于权利要求1-6任一所述的一种阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基中的分离培养基中，于37℃厌氧恒温培养1～2周，得到分离菌落；挑取分离培养基中周围无杂菌、直径在1mm以内、乳白色、粘稠状的分离菌落接种至权利要求1-6任一所述的一种阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基中的初筛培养基中，于37℃厌氧恒温培养48～96h，得到初筛菌液；选取吸光度od600低于0.4的初筛菌液进行第二次pcr鉴定及测序鉴定，得到阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)；所述第一次pcr鉴定的引物序列如seqidno.1、seqidno.2所示；所述第二次pcr鉴定的引物序列如seqidno.3、seqidno.4所示。在本发明的一种实施方式中，所述分离菌落是通过将接种了稀释后富集样品的分离培养基置于厌氧产气袋中进行培养得到的。在本发明的一种实施方式中，所述所述分离菌落是通过先是将厌氧产气袋放入密封盒中，然后将接种后的培养基置于密封盒中进行培养得到的。在本发明的一种实施方式中，所述待删选样品包含粪便。本发明提供了上述一种阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基或上述一种阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)特异性筛选培养基的制备方法或上述一种筛选阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)的方法在筛选阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)方面的应用。有益效果：(1)本发明对针对akkermansiamuciniphila的筛选培养基(在成分、配制方法两方面)以及筛选方法进行了优化，利用本发明的筛选培养基以及筛选方法，可使阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)的阳性率高达70％；(3)本发明重新设计了akkermansiamuciniphila富集培养基的配制方法，使得配置出的akkermansiamuciniphila富集培养基澄清透明，能够用于判断akkermansiamuciniphila是否在富集培养基中有生长；(4)本发明重新设计了akkermansiamuciniphila富集培养基的配方，以na2hpo4替换了原有配方中的nahco3，使得akkermansiamuciniphila富集培养基不会在高温高压灭菌的过程中不稳定，呈碱性，与培养基中金属阳离子如ca2+、mg2+发生沉淀，形成混浊液；(5)本发明重新设计了akkermansiamuciniphila分离培养基的配方，不需要前期气体置换也可以达到厌氧条件，且本发明用厌氧产气袋和密封盒保证了菌株在分离培养基表面生长时所需的严格厌氧环境，替代了用深层半固体培养，此分离培养基只需要普通琼脂，不需使用价格昂贵的nobleagar来保证培养基保持一定的透明度，适用于大批量的分离筛选，操作简单，可行性高；(6)由于应用厌氧产气袋和密封盒可以保证严格厌氧环境，本发明在使用分离培养基进行分离培养时，不需使用倾注法，而可使用平板涂布法，使得细菌可形成典型的菌落形态，对于后期筛选来说十分方便，适用于菌种的筛选分离培养。附图说明图1是本发明的富集培养基的配置方法；图2是本发明经高压灭菌完后的黏蛋白富集培养基；图3是实施例3中的fahbz样本(稀释10000倍)在本发明的富集培养管中的生长3天后的示意图；图4是实施例3中的fahbz样本在本发明的分离培养基中的生长7天后的示意图；图5是akkermansiamuciniphila及其他菌株分别在脑心浸出液肉汤(bhi)中生长3天后的示意图；其中，圈中为典型akkermansiamuciniphila的菌落；其中，从左至右，分别为e.coli菌株、akkermansiamuciniphila以及空白对照；图6是利用本发明的方法对akkermansiamuciniphila进行筛选的流程图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。下述实施例中的黏蛋白为购自sigma公司的mucinfromporcinestomach,typeii,sigma,m2378；粪便来自健康人群；脑心浸出液肉汤(bhi)购自青岛海博生物技术有限公司；厌氧产气袋购买自日本三菱公司。阳性率的计算方法：每个样本从分离培养上挑选15～30个疑似菌落，阳性率即为阳性菌落占该样品所有挑取的总菌落数的百分比。实施例1：富集培养基的配置虽然willemdevos团队发表了akkermansiamuciniphila富集培养基的组成成分，但是配置方法并未详细提及，发明人按照文献报道的组分配合常规方法进行配置时，出现富集培养基浑浊的现象，而液体管富集培养最终需要观察培养液的浑浊程度以判定是否富集到目标菌株，故而培养基的浑浊会使得后续试验无法进行，因此，需对akkermansiamuciniphila富集培养基的组成成分及配置方法进行进一步改进。由于培养基成分复杂，配置繁琐，为简化培养基的配置，下面先将不同培养基组分配置成高浓度储备液，即方便取用，也可以达到抑菌的效果。1、配置高浓度储备液高浓度储备液配置过程中需考虑的因素：其一，h2po4-、hpo42-易与ca2+、mg2+在高浓度或高温条件下产生白色沉淀，不宜一起配置和灭菌；其二，nahco3则在高温高压过程中容易分解产生naoh，使得培养基成碱性，故而不宜高压灭菌；其三，l-半胱氨酸盐酸高温易分解产生h2s，不宜高压灭菌。综上所述，可以将培养基主要成分配置如下母液备用：①10×缓冲溶液：称取4.1gkh2po4、5.3gna2hpo4、40gnahco3，加800ml蒸馏水溶解后，调节ph至7.2，加蒸馏水定容至1l；每配置1l培养基需要取100ml10×缓冲溶液。在取出的缓冲液中加入0.5g加入l-半胱氨酸盐酸，调节ph至7.2，膜过滤除菌。②无机盐溶液：称取24gnh4cl、24gnacl、8.8gcacl2·2h2o、8gmgcl2·6h2o，加蒸馏水定容至1l(配置富集培养基时按照每1l富集培养基12.5ml无机盐溶液的量加入)。③酸性微量元素(配方见表1)：除fecl2·4h2o、浓盐酸外，其余先配置10×工作液1l，再取20ml10×母液，加入fecl2·4h2o、浓盐酸，定容至200ml(配置富集培养基时按照每1l富集培养基1ml酸性微量元素的量加入)。表1酸性微量元素配方④碱性微量元素(配方见表2)：先配置10×工作液1l，再取20ml加蒸馏水定容至母液200ml(配置富集培养基时按照每1l富集培养基1ml碱性微量元素的量加入)。表2碱性微量元素配方2、na2s·9h2o对培养基稳定性的影响按照willemdevos团队发表了akkermansiamuciniphila富集培养基配方配置时，发现富集培养基在厌氧工作站中空培养一段时间后，会出现白色沉淀，培养基变浑浊，不利于观察，初步认为培养基组分中na2s不稳定，在水中分解为h2s和naoh，导致培养基成碱性，从而与培养基中ca2+、mg2+形成白色沉淀，导致培养基浑浊。为验证这一猜想，配置培养基模拟液(不加入黏蛋白)时，分为两组，一组中不加入na2s(组一)，一组中按照0.25gna2s·9h2o/1l的量加入na2s(组二)，具体步骤如下：(1)配置组一：量取100ml①，加入0.5g加入l-半胱氨酸盐酸，加入约为900ml蒸馏水，加入②12.5ml、③1ml、④1ml，加蒸馏水定容至1l；(2)配置组二：在组一的基础上加入0.25gna2s·9h2o；将组一、组二于室温下静置8小时后发现：组一，澄清透明，ph值没有发生显著变化；组二，开始变浑浊，有臭鸡蛋气味，ph值升高，而白色沉淀可以被酸所溶解。将组一、组二经过8小时静止后发现：组一，澄清透明，ph值没有发生显著变化；组二，开始变浑浊，有臭鸡蛋气味，ph值升高，而白色沉淀可以被酸所溶解。这一现象表明na2s·9h2o会使得培养基变得不稳定，除去这一组分后，培养基更加澄清透明稳定。3、黏蛋白纯化及加入量对培养基浑浊度的影响willemdevos团队发表了akkermansiamuciniphila富集培养基配方中提及到的黏蛋白纯化方法需要用60％预冷的乙醇沉淀黏蛋白，再经过双蒸水复溶、过夜膜透析、冻干等步骤得到黏蛋白，最终称取2.5g经过纯化的黏蛋白加入富集培养基中，而实际上，膜透析、冻干等步骤比较繁琐且会损失黏蛋白，冻干后黏蛋白重新溶解需要较长时间，会增加富集培养基配置的繁琐程度。故而实施例为了简化配置步骤，尝试省去膜透析及冻干的步骤，将双蒸水复溶的黏蛋白分装冻存，直接用于培养基的配置，其中，需要优化的步骤有：乙醇沉淀的次数、黏蛋白的加入量等，具体步骤如下：(1)称取黏蛋白25g(mucinfromporcinestomach,typeii,sigma,m2378)，溶解于1l缓冲液a中，调节ph至7.8，室温下，磁力搅拌1小时，1小时后，用2n的hcl调节ph至7.0～7.4，室温下，搅拌21小时，21小时后，于10000g离心20min，取上清，预冷至0-2℃(此过程为黏蛋白溶解过程)，得到上清液；(2)在(1)得到的上清液中加入预冷至4℃的乙醇，至乙醇的终浓度为60％，轻轻颠倒混匀，4℃静置2h后弃去上清，沉淀用0.1mnacl溶解，于10000g离心20min，取上清，预冷至0-2℃(此过程为60％冰乙醇洗涤过程)，得到上清液；(3)在(2)得到的上清液中再次加入预冷至4℃的乙醇，至乙醇的终浓度为60％，轻轻颠倒混匀，4℃静置2h；弃去上清，沉淀用预冷的无水乙醇洗涤，用400ml蒸馏水重新溶解沉淀，将纯化好的黏蛋白按照每管40ml分装于50ml离心管中，至于-20℃冰箱中，备用；其中，缓冲液a的配置方法为：称取0.23gkh2po4、2.60gna2hpo4、5.84gnacl、1～3滴吐温80，加蒸馏水至900ml，用2nnaoh调节ph至7.8(1～2滴)，定容至1l。在此过程中，冰乙醇沉淀蛋白的洗涤过程可以重复进行多遍，冰乙醇洗涤次数越多，粘蛋白越纯，相应地损失也会增加，故而分别用冰乙醇洗涤1次、2次、3次，将得到的粘蛋白溶液40ml加入到960ml的蒸馏水中，8000rpm离心20min，取上清，观察培养基澄清度。结果表明，洗涤1次后得到的粘蛋白溶液加入培养基中杂质较多，即使经过离心也无法保证培养基澄清透明；洗涤2次、3次以后则可以保证培养基澄清透明，但是洗涤3次与2次相比，澄清度没有显著差异，故而冰乙醇沉淀蛋白的洗涤过程重复两次即可。纯化后得到的粘蛋白分别按照每1l蒸馏水加入20ml、40ml、80ml纯化后的粘蛋白溶液，8000rpm离心20min，取上清，观察培养基澄清度。结果表明，80ml组经离心得到上清液略呈浑浊，而为在保证澄清度的情况下尽量多的加入菌株生长所需要的碳源、氮源，可以选择在1l培养基中加入40ml纯化后的粘蛋白溶液。4、维生素溶液对akkermansiamuciniphila分离培养的影响willemdevos团队已发表的分离方法中含有混合维生素溶液，1l液体培养基中包括：4μg生物素、40μg烟酸、100μg吡哆醇、20μg核黄素、40μg硫胺素、20μg对氨基苯甲酸、20μgd-泛酸钙。本实施例中考察了加入维生素储备液对akkermansiamuciniphila培养效果的影响，实验分为两组，一组中不加入维生素储备液(组一)，一组中加入维生素储备液(组二)，具体步骤如下：(1)制备维生素储备液：900ml蒸馏水中加入0.004g生物素、0.04g烟酸、0.1g吡哆醇、0.02g核黄素、0.04g硫胺素、0.02g维生素b12，0.02g对氨基苯甲酸、0.02gd-泛酸钙，最后加蒸馏水定容至1l；(2)制备组一：量取100ml①，加入0.5g加入l-半胱氨酸盐酸，加入约为900ml蒸馏水，加入②12.5ml、③1ml、④1ml，加蒸馏水定容至1l；(3)配置组二：在组一的基础上加入维生素储备液；试验表明，不加维生素溶液，akkermansiamuciniphila也可以生长。5、改变缓冲体系成分对培养基稳定性的影响由于当前培养基中缓冲体系(见上①)中，含有大量nahco3，高压灭菌不稳定，会使培养基呈碱性，需要膜过滤灭菌，而膜过滤除菌加入培养基中，后续需要无菌环境下以无菌操作调节ph，操作过程并不简单。故而本实施例考虑改变缓冲物质，采用磷酸盐缓冲体系，即每1l的培养基中加入2.5gna2hpo4，加入后待全部配置完成调节ph，高压灭菌即可，实验分为两组，一组使用nahco3，一组使用na2hpo，具体步骤如下：(1)制备组一：量取100ml①，加入0.5g加入l-半胱氨酸盐酸，加入约为900ml蒸馏水，加入②12.5ml、③1ml、④1ml，再加入40ml纯化后的黏蛋白，加蒸馏水定容至1l；(2)在900ml蒸馏水中加入2.5g/lna2hpo4，再加入②12.5ml、③1ml、④1ml、40ml纯化后的黏蛋白，加蒸馏水定容至1l；组一和组二中的培养基均经过115℃高压灭菌20min，分别接种1mlakkermansiamuciniphilamuct培养液，置于37℃的厌氧培养箱中培养3天，观察两组菌生长状态。试验表明，添加2.5g/lna2hpo4可以替代原培养基成分中的nahco3。综上，应用willemdevos团队发表的培养基成分配置的培养基，经过高温高压灭菌后，培养基浑浊，对富集管是否生长的断定造成困扰，而去除培养基中不稳定的成分以及非必须的成分，替换培养基中缓冲盐，可以使得液体富集培养基变得澄清透明，便于后期阳性富集管的判定，同时，采用已报道的方法进行富集培养，需要对每个梯度的富集管(6个稀释梯度，每个稀释梯度3个平行，每个样本约有18支富集管)进行pcr鉴定，而按照本案例所述方法，由于可以通过观察富集管的浑浊度来判定是否有微生物生长，从而剔除阴性样本管，每个样本只需要检测最多3支富集管，可以将工作量减少约6倍。此时，富集培养基的成分包含0.25～2.5g/l黏蛋白、2.5g/lna2hpo4、0.5～1g/ll-半胱氨酸盐酸盐、0.3g/lnh4cl、0.3g/lnacl、0.11g/lcacl2·2h2o、0.1g/lmgcl2·6h2o、0.00149g/lfecl2·4h2o、1μmol/lh3bo3、0.5μmol/lzncl2、0.1μmol/lcucl2·2h2o、0.5μmol/lmncl2·4h2o、0.5μmol/lcocl2·6h2o、0.1μmol/lnicl2·6h2o、0.1μmol/lna2seo3·5h2o、0.1μmol/lna2wo4·2h2o、0.1μmol/lna2moo4·2h2o以及0.5mg/lc12h6nnao4。此富集培养基的配制方法见图1，经高压灭菌完后的状态见图2。实施例2：分离培养基的配置以及筛选环境的构建由于akkermansiamuciniphila生长要求较低的氧化还原电势，在有氧情况下不生长，因此，willemdevos团队要求所有操作过程在无氧、充氮环境下进行且要求所使用的培养基要求提前进行气体置换除氧且所有操作过程均不能混入氧气，且willemdevos团队采用的分离方法也是倾注法，其分离原理为为利用深层倾注法菌体可以生长在培养基内部相对较高的厌氧环境中，但是，由于多数实验室(尤其是国内实验室)仅配有厌氧工作站，并不具备前期气体置换除氧的装置，且倾注法会使得在固体培养基内部生长的菌落小，且没有典型的菌落形态，对于后期筛选来说十分不方便，此方法难以实现。故而本实施例考虑改变分离培养基以及尝试构建新的筛选环境以满足akkermansiamuciniphila筛选的需求，具体如下：(1)为考察akkermansiamuciniphila在平板上的生长状况，按照willemdevos团队的方法配置分离培养基(即在实施例1得到的富集培养基的基础上加入18g/l琼脂)，倒好平板后，冷却吹干，按照每个平板50μl的量涂布akkermansiamuciniphila标准株，一共涂布6个平板，其中3个平板放入厌氧工作站中，另3个平板放入5.5llocklockpp密封盒中，在盒底部放置mgcanaeropack-anaero-3.5l厌氧产气袋两个，迅速将盒子密封，至于37℃恒温培养箱中，培养2周后，观察是否长出akkermansiamuciniphila单菌落。结果表明：在厌氧工作站中放置的平板始终呈淡粉色，无akkermansiamuciniphila生长；而在locklockpp密封盒中放置的平板呈无色，平板上有极小的白色菌落。因为菌落形态极小且与培养基颜色接近，无典型的菌落形态，故而需对分离培养基进行进一步的改进以用于分离akkermansiamuciniphila。(2)将50μlakkermansiamuciniphila标准株涂布粘蛋白固体培养基(成分包含0.25～2.5g/l黏蛋白、2.5g/lna2hpo4、0.5～1g/ll-半胱氨酸盐酸盐、0.3g/lnh4cl、0.3g/lnacl、0.11g/lcacl2·2h2o、0.1g/lmgcl2·6h2o、0.00149g/lfecl2·4h2o、1μmol/lh3bo3、0.5μmol/lzncl2、0.1μmol/lcucl2·2h2o、0.5μmol/lmncl2·4h2o、0.5μmol/lcocl2·6h2o、0.1μmol/lnicl2·6h2o、0.1μmol/lna2seo3·5h2o、0.1μmol/lna2wo4·2h2o、0.1μmol/lna2moo4·2h2o、0.5mg/lc12h6nnao4以及18g/l琼脂)和脑心浸固体培养基(成分包含bhi)，并放入5.5llocklockpp密封盒中，在盒底部放置mgcanaeropack-anaero-3.5l厌氧产气袋两个，迅速将盒子密封，至于37℃恒温培养箱中，培养2周后，观察akkermansiamuciniphila菌落形态。结果表明，生长在脑心浸固体培养基上的菌落更大，形态更为明显，呈白色粘稠状，故而采用脑心浸固体培养基分离akkermansiamuciniphila。综上，应用willemdevos团队发表的方法进行akkermansiamuciniphila的分离时，深层固体培养会造成严重污染，菌落生长在培养基内部，挑取的单菌落讲过培养后发现均不是akkermansiamuciniphila，阳性率为0；而本实施例中采用5.5llocklockpp密封盒中与mgcanaeropack-anaero-3.5l厌氧产气袋(2个/盒)，可以使得固体平板的厌氧环境达到akkermansiamuciniphila的生长要求，且在本实施例的实施条件下，通过形态鉴定后，akkermansiamuciniphila的阳性率可以达到70％左右，即在分离平板上可以观察到疑似阳性菌落，经过鉴定后一般都可以挑取到阳性菌落。此时，分离培养基的成分包含bhi、粘蛋白(可以不加)。筛选环境的构建方法为利用厌氧产气袋和密封盒构建较为严格的厌氧环境。实施例3：粪便样本中akkermansiamuciniphila的筛选具体步骤如下：1、材料来源安徽豪州粪便样品7份，样品采集自2017年7月31号，样品与无菌的30％的甘油混匀，以无菌操作分装于保菌管中，-80℃冻存备用，样品编号分别为fahbz-9，fahbz-12，fahbz-19，fahbz-26，fahbz-28，fahbz-30，fahbz-31，fahbz-39。2、样品稀释及富集培养以fahbz-12样品为例：吸取200μl甘油管中样品，加入4.5mlpbs，记为10-1；稀释至10-2时，肉眼不可见浑浊；继续向下稀释3个梯度，记为10-3、10-4、10-5；从10-2稀释管中吸取500μl，加入4.5ml实施例1得到的富集培养基中；将10-3～10-5按同样的方法接种富集培养基，每个梯度接种3管，将富集管放置于37℃厌氧恒温培养箱培养3天(富集管培养3天的状况可见图3和表3)；表3富集管培养状况注：+表示浑浊，-表示不浑浊。3、pcr鉴定结果选择浑浊的富集管；在浑浊的液体管中选择比较均一、悬浊、没有沉淀、结块或丝状物的富集管；选择的富集管必须包含高稀释梯度的浑浊管，如10-3和10-4都满足上述要求，必须检测10-4稀释度中的浑浊管；在满足上述要求的情况下，可以包含不同稀释度的浑浊管；每个样品选择1-3支管进行检测，表3中加粗部分即为选出的待检测的富集管。选出的富集管，以无菌操作吸取1ml培养液，加入1.5ml离心管中，做好相应的标记；将富集管放回37℃厌氧恒温培养箱中，待得到检测结果后进行后续处理；将吸取出的培养液12000rpm离心5min；尽量弃尽上清后，根据沉淀量用50～200μl无菌水重新悬浮沉淀，并用枪头反复吹吸混匀；此后，将重悬的菌体置于金属浴，98.5℃孵育15～20min；12000rpm离心1min，将此步骤得到的上清液作为pcr模板，进行检测(pcr引物见表4)；表4pcr引物am1(5’→3’)cagcacgtgaaggtggggac(seqidno.1)am2(5’→3’)ccttgcggttggcttcagat(seqidno.2)pcr反应体系为(10μl)：2×pcrmastermix5μl，am1(10μm)0.5μl，am2(10μm)0.5μl，模板2μl，用ddh2o补足2μl；pcr反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；72℃，10min；10℃，∞。pcr产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，上样量6μl，目标条带为327bp的片段，根据目的条带的有无可以初步判定菌株是否为akkermansiamuciniphila，选择pcr鉴定为阳性的更高稀释度的富集管进行固体平板的分离培养，例如，富集管10-3和10-4都为阳性，则选择富集管10-4进行后续实验，每个样品选择1支富集管。经检测后，仅fahbz-39样品10-3①、10-4①有强的阳性条带；而10-2管仅有很弱的一条带，故而选择fahbz-3910-4①管进行分离培养，此外，fahbz-2610-3①仅有很弱的一条带，不进行固体分离培养。4、固体平板分离培养将fahbz-3910-4①管稀释10-1～10-9，选择10-3～10-9在实施例2得到的分离培养基上进行涂布，每个皿涂布500μl稀释液，10-5～10-7稀释度，每个稀释度涂布3个平皿，其余每个稀释度涂布1个平皿，将固体平板至于5.5llocklockpp密封盒中，在盒底部放置mgcanaeropack-anaero-3.5l厌氧产气袋两个，迅速将盒子密封，至于37℃恒温培养箱中，培养2周(利用分离培养基分离培养7天的状况可见图4，akkermansiamuciniphila及其他菌株分别在脑心浸出液肉汤(bhi)中生长3天后的状况可见图5)。5、单菌落液体初筛将培养好的固体平板取出，在强灯光下，挑取周围无杂菌、直径在1mm以内、乳白色、粘稠状菌落，以无菌操作接种于5mlbhi液体培养基(即初筛培养基，成分包含bhi、l-半胱氨酸盐酸盐，此初筛的原理为利用akkermansiamuciniphila在缺乏粘蛋白的bhi培养基中的生长弱势快速识别可能的目标菌株，此初筛步骤可缩小后期筛选的工作量，进一步提高阳性率)中，至于37℃厌氧恒温培养箱培养72小时；共挑取疑似阳性菌落20株，其中有9株在bhi液体培养基中生长后，培养基略浑浊；对这9株进行特异性引物pcr鉴定，经鉴定9株菌均有阳性条带；用16s通用引物27f(seqidno.3：agagtttgatcctggcctca)、1492r(seqidno.4：ggttaccttgttacgactt)对这9株均的dna进行pcr扩增，扩增片段长度为1500～1600bp，扩增产物双向测序，拼接好后，去掉两端20bp的碱基，所得pcr产物交由生物公司测序，得到的序列结果使用blast在genebank中进行搜索和相似性比对；pcr体系为：27f引物溶液1μl，1492r引物溶液1μl，2×pcrmastermix15μl，无菌水7μl，模板6μl；pcr反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min。比对结果为：这些菌株16s相似性与ncbi数据库中模式菌株akkermansiamuciniphilamuct的相似性大于99％，均为akkermansiamuciniphila纯菌落。综上所述，应用willemdevos团队发表的方法进行akkermansiamuciniphila分离中国人群的粪便样本时，akkermansiamuciniphila的阳性率为0；而在本实施例的条件下，阳性率为70％左右。此时，初筛培养基的成分包含bhi、l-半胱氨酸盐酸盐。(akkermansiamuciniphila筛选流程可见图6)虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>江南大学<120>一种阿克曼氏菌特异性筛选培养基及其制备方法和应用<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1cagcacgtgaaggtggggac20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ccttgcggttggcttcagat20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3agagtttgatcctggcctca20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4ggttaccttgttacgactt19当前第1页12