一种小RNA高通量测序检测微生物的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体提出了一种基于小rna高通量测序(smallrnasequencing，srna-seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。根据本发明的方法可以一次性检测样本中几千种微生物，并可以达到极高的灵敏度。这种方法由南开大学高山和中国农科院陈泽等在国际上首次提出，并命名为rna捕获-小rna高通量测序(rnacaptureandsrna-seq，rc&srna-seq)。

背景技术：

基于高通量测序检测微生物的方法具有灵敏度高、覆盖种类多和能够检测新病毒等优势，已成为微生物检测领域的一类重要方法。小rna(smallrna，srna)是长度在200nt以下的rna分子的总称，小rna高通量测序是高通量测序的一种。2013年，南开大学高山等在国际微生物大会(wcm2013)上首次提出小rna高通量测序可以用于临床病毒检测，并通过大数据挖掘检测到六类严重危害人类健康的病毒，分别是人乳头状瘤病毒(hpv)、乙肝病毒(hbv)、丙肝病毒(hcv)、艾滋病病毒(hiv)、松鼠猴病毒(smrv)和eb病毒(ebv)。但是，由于哺乳动物(特别是人类等高级哺乳动物)生命系统的复杂性，常规的小rna高通量测序检测的信噪比(病毒序列与宿主序列比例)一直难以提高。直到2016年，南开大学高山和中国农科院陈泽等通过开发新的rna捕获-小rna高通量测序的方法，将病毒检测信噪比大大提高，并推广到可以检测细菌和真菌，为这一方法的广泛应用奠定了基础。

技术实现要素：

本发明提供了一种通过rna捕获-小rna测序(rnacaptureandsrna-seq，rc&srna-seq)检测微生物的方法。所述方法包括以下步骤：

(1)提取生物样品中的总rna，通过酶切或物理打断得到片段化的rna；

(2)将步骤(1)中所述片段化的rna与带有标记物(如生物素biotin)的dna探针进行杂交，得到经标记的rna-dna杂交产物；

(3)将步骤(2)中所述经标记的rna-dna杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体(如链霉亲和素streptavidin，sav)的磁珠混合，使磁珠吸附所述经标记的rna-dna杂交产物，洗脱除去未杂交的dna探针与污染物；

(4)加热使磁珠上的rna-dna杂交产物变性，洗脱回收rna，向回收物中加入dna酶降解dna片段；

(5)将接头连接到步骤(4)中回收的rna的3′端，得到带有3′端接头的rna；

(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的rna与反转录引物退火杂交，得到rna-引物杂交产物；

(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述rna-引物杂交产物的rna的5′端，得到带5′端接头的rna-引物杂交产物；

(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的rna-引物杂交产物中rna片段为模板进行反转录pcr，得到扩增的cdna片段，选择长度在130-200bp范围内的cdna片段进行测序，测序长度在50bp以上；

(9)去除步骤(8)中测序获得的序列(即原始读段)3′端的测序接头，再去除15bp长度以下的序列，得到清理后的序列；

(10)使用bowtie或bwa软件，将清理后的序列与目标微生物基因组序列进行比对，将与所述目标微生物基因组序列的比对区域相比存在至多1个碱基不同的所述清理后的序列确定为目标小rna序列；对目标小rna序列进行计数，将5′端或3′端比对到所述目标微生物基因组序列中相同位置的所有目标小rna序列计数为一次；如果样品中目标小rna序列计数值超过指定阈值，则将该样品中该目标微生物的检测结果确定为阳性。

优选地，其中步骤(8)中扩增cdna片段所用的引物为illumina公司的pcr引物。

优选地，所述目标小rna序列与所述目标微生物基因组序列的比对区域完全相同。

优选地，所述微生物包括病毒、细菌和真菌。

优选地，所述dna探针的序列为来自病毒、细菌和/或真菌基因的特异序列；优选地，所述特异序列的长度范围为21到50个核苷酸。

优选地，所述dna探针的序列与步骤(10)中所述目标微生物基因组序列来源的微生物种类相同。

优选地，当所述目标微生物为病毒时，其指定阈值为100；当所述目标微生物为细菌和真菌时，其指定阈值为1000。

在某些优选实施方案中，所述生物样品为来源于动物(例如人)的血液、唾液、尿液、粪便、各种组织和/或细胞系；更优选地，为血液或患病组织。

在某些优选实施方案中，所述病毒包括人乳头状瘤病毒(hpv)、乙肝病毒(hbv)、丙肝病毒(hcv)、艾滋病病毒(hiv)、松鼠猴病毒(smrv)、eb病毒(ebv)和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(sars-cov)；优选地，所述细菌为布鲁氏菌；优选地，所述真菌为烟曲霉菌。

在某些优选实施方案中，所述特异序列包括病毒特异序列、细菌特异序列或真菌特异序列；优选地，所述病毒特异序列包括人乳头状瘤病毒(hpv)特异序列、乙肝病毒(hbv)特异序列、丙肝病毒(hcv)特异序列、艾滋病病毒(hiv)特异序列、松鼠猴病毒(smrv)特异序列、eb病毒(ebv)特异序列和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(sars-cov)特异序列；优选地，所述细菌特异序列为布鲁氏菌特异序列；优选地，所述真菌特异序列为烟曲霉菌特异序列。

发明的有益效果

本发明提供的通过rna捕获-小rna高通量测序检测微生物的方法可以一次性检测样品中几千种微生物；且与常规的通过小rna高通量测序(不经过rna捕获)检测微生物的方法相比，可以提高病毒、细菌和真菌检测的信噪比，从而具有更高的灵敏度。

附图说明

图1为本发明的小rna高通量测序检测微生物的方法的流程图。

具体实施方式

实施例1

根据来自hpv-18病毒基因组参考序列(genbank数据库索引为m20325.1)的2个25bp的特异性片段(atggcgcgctttgaggatccaacac和agattagcaggtagtagaataatga)制备探针。从感染hpv-18病毒的hela细胞中提取总rna，然后根据本发明提供的通过rna捕获-小rna高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测hpv-18病毒，步骤(8)中高通量测序使用illumina公司的hiseq2000测序仪，测序方式为单端50bp。其中，步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)为15,210,932条，进一步经步骤(9)得到的清理后的序列为12,076,158条，上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小rna序列计数值为6,038。因此确定该样品的hpv-18病毒检测结果呈阳性。定义所述目标小rna序列计数值与所述清理后的序列数量之比为信噪比，得到根据本发明的方法检测hpv-18病毒的信噪比为0.05％(6,038/12,076,158)，显著高于常规的小rna高通量测序(不经过rna捕获)方法检测hpv-18病毒的信噪比0.01％(1,228/12,285,476)。

实施例2

根据来自布鲁氏菌基因组参考序列(genbank数据库索引为cp013964.1)的3个25bp长度的特异性片段(agggaaacttgtgctaataccgtat、gagtgatcaagtgtcttaagggcat和cctggtggttatggcggagcggctg)制备探针。从感染布鲁氏菌的猪的血液中提取总rna，然后根据本发明提供的通过rna捕获-小rna高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测布鲁氏菌，步骤(8)中高通量测序使用illumina公司的hiseq2000测序仪，测序方式为单端50bp。其中，步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)21,504,891条，进一步经步骤(9)得到所述清理后的序列18,461,371条，上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小rna序列计数值为960,613。因此确定该样品的布鲁氏菌检测结果呈阳性。定义所述目标小rna序列计数值与所述清理后的序列数量之比为信噪比，得到根据本发明的方法检测布鲁氏菌的信噪比为5.2％(960,613/18,461,371)，显著高于常规的小rna高通量测序(不经过rna捕获)方法检测布鲁氏菌的信噪比0.93％(160,613/17,260,345)。

实施例3

根据来自烟曲霉菌基因组参考序列(genbank数据库索引为nc_007194.1)的一个20bp长度的特异性片段(uggcucagaauucugagcca)制备探针。从感染烟曲霉菌基因组的细胞中提取总rna，然后根据本发明提供的通过rna捕获-小rna高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测烟曲霉菌，步骤(8)中高通量测序使用illumina公司的hiseq2000测序仪，测序方式为单端50bp。其中，步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)为16,014,040条，进一步经步骤(9)得到所述清理后的序列13,951,269条，上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小rna序列计数值为960,613。因此确定该样品的烟曲霉菌检测结果呈阳性。定义所述目标小rna序列与所述清理后的序列数量之比为信噪比，得到根据本发明的方法检测烟曲霉菌的信噪比为0.8％(112,003/13,951,269)，显著高于常规的小rna高通量测序(不经过rna捕获)方法检测烟曲霉菌的信噪比0.53％(72,003/13,564,430)。