一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法与流程

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法，该方法尤其可用于非诊断治疗目的的端粒酶活性检测。

背景技术：

端粒酶是一种逆转录酶，通过在染色体末端添加重复单位(ttaggg)n，在维持端粒长度方面发挥重要作用。众所周知，在大多数正常细胞的细胞分裂过程中，端粒逐渐缩短，并且没有可检测到的端粒酶活性。端粒酶表达与肿瘤发生有关，因此端粒酶活性检测也是癌症早期诊断的一个重要标准。已经开发了多种方法来检测端粒酶活性，其中端粒重复序列扩增方案(trap)最常用，已成为一种黄金方法。虽然trap及其改进的检测方法灵敏度高和特异性好，但这些基于聚合酶链反应(pcr)的方法也存在明显的缺点，如操作复杂、耗时、假阳性、无法原位检测。近年来，荧光方法由于灵敏且简单而备受关注，并且已广泛用于靶标的可视化检测。

分子信标(mb)是基于荧光共振能量转移(fret)的发夹dna探针。一般地，分子信标由寡核苷酸序列、荧光基团和淬灭基团组成，其中寡核苷酸序列可以形成茎区和环区，环区由18-30个与靶链核苷酸序列互补的碱基组成，茎区由5-7个互补的碱基组成，荧光基团与寡核苷酸序列的5'端连接，淬灭基团与寡核苷酸序列的3'端连接。分子信标在自由状态下，寡核苷酸序列形成茎区和环区，使得荧光基团与淬灭基团靠近，由于fret效应，荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭，当分子信标的寡核苷酸序列与链核苷酸序列杂交时，分子信标的寡核苷酸序列的茎区和环区被打开，使得荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团发出的荧光不被淬灭，从而显现出来而可以被检测。量子点(quantumdots,qd)是一种纳米半导体材料，直径在2-20nm之间。由于量子点的电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。与传统荧光染料相比，量子点作为分子信标的荧光基团具有许多优点，如具有光化学稳定性、生物兼容性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的端粒酶检测方法和检测试剂盒，其中采用包含量子点荧光基团的分子信标。

因此，在一个方面，本发明提供一种端粒酶活性检测试剂盒。该检测试剂盒包括端粒酶底物引物、dntps、端粒酶逆转录缓冲液、量子点分子信标，其中该量子点分子信标由寡核苷酸茎环、量子点荧光基团和淬灭基团组成，该端粒酶底物引物为5’-aatccgtcgagcagagtt-3’(seqidno:1)，该寡核苷酸茎环的序列为5’-g*g*g*g*g*g*g*g*g*g*aaaaaccctaaccctaaccctaaaactctgctcctctttagggttaggg-3’(seqidno:2)，其中*表示硫代磷酸酯键，该量子点荧光基团与该寡核苷酸茎环的序列的5’端连接，该淬灭基团与该寡核苷酸茎环的序列的3’端连接。

在本发明的实施方案中，该荧光基团可以为cdte:zn²⁺量子点、cdzntes量子点或cdte/cds量子点。在本发明的优选实施方案中，该荧光基团为cdte:zn²⁺量子点。

在本发明的实施方案中，该淬灭基团可以为bhq1、bhq2或bhq3。在本发明的优选实施方案中，该淬灭基团为bhq2。

在本发明的优选实施方案中，该端粒酶逆转录缓冲液包含20mmtris-hcl(ph＝8.3),1.5mmmgcl2,63mmkcl,0.005％tween20,bsa0.1mg/ml。

在本发明的优选实施方案中，该检测试剂盒还包括tris缓冲液，该量子点分子信标溶于该tris缓冲液中形成量子点分子信标溶液。

在本发明的具体实施方案中，该检测试剂盒包括：

第一试剂容器，该第一试剂容器包含该端粒酶底物引物、dntps和该端粒酶逆转录缓冲液，

第二试剂容器，该第二试剂容器包含该量子点分子信标溶于该tris缓冲液中形成的该量子点分子信标溶液。

在本发明的优选实施方案中，该检测试剂盒还包括第三试剂容器，该第三试剂容器包含端粒酶细胞提取物标准品溶液。

通常，该检测试剂盒还附有端粒酶活性检测说明书。

在另一个方面，本发明提供一种用于非诊断治疗目的的体外端粒酶活性检测方法，该方法包括以下步骤：

获取待测的端粒酶样品；

向该待测的端粒酶样品加入根据权利要求1-6中任一项该的检测试剂盒中的该端粒酶底物引物、dntps和端粒酶逆转录缓冲液进行延伸反应，形成端粒酶延伸反应产物；

向该端粒酶延伸反应产物加入根据权利要求1-6中任一项该的检测试剂盒中的该量子点分子信标进行杂交反应；

检测该杂交反应的荧光，其中荧光的出现指示端粒酶的存在。

术语“待测的端粒酶样品”是指任何需要测量其中的端粒酶活性的样品，优选生物样品，例如但不限于组织细胞液、血液、体液、尿液等。该样品的获取方法是本领域公知的，例如将组织或细胞破碎获得组织细胞液，或者通过抽取的方法获得血液、体液或尿液。

在又一个方面，本发明提供一种用于非诊断治疗目的的细胞内端粒酶活性检测方法，该方法包括以下步骤：

获取待测的细胞；

将该待测的细胞与根据权利要求1-6中任一项该的检测试剂盒中的该端粒酶底物引物在37℃下孵育，然后与该量子点分子信标孵育；

检测该待测的细胞的荧光，其中荧光的出现指示端粒酶的存在。

术语“待测的细胞”是指任何需要测量其中的端粒酶活性的细胞，包括正常体细胞，如肾脏细胞、肝脏细胞等，也包括任何癌变或怀疑癌变的肿瘤细胞，如肾脏肿瘤细胞、肝脏肿瘤细胞等。

本发明中的量子点分子信标可以参考中国发明专利申请cn201710509991(一种合成染料修饰dna功能化含镉量子点的方法及其应用)中公开的方法来制备。简单地讲，可以通过将猝灭基团如bhq2连接到硫代磷酸酯修饰的5’-g*g*g*g*g*g*g*g*g*g*aaaaaccctaaccctaaccctaaaactctgctcctctttagggttaggg-3’(seqidno:2)的3'末端，得到硫代磷酸酯修饰的发夹bhq2-dna，然后用该bhq2-dna与量子点(如cdte:zn²⁺qd)合成所需原料混合，一步法得到dna功能化量子点，随后95℃退火5分钟得到本发明的量子点分子信标，如量子点分子信标qd-bhq2。本方法采用一步法合成量子点分子信标qd-bhq2，无需进一步的功能化修饰，使操作更简单，成本更低廉，量子点分子信标的制备效率更高。

本发明中的量子点分子信标如qd-bhq2无需过多的化学修饰，无需进行信号放大，具有优异的生物相容性、荧光恢复、检测灵敏度和光稳定性，并且没有细胞毒性。该量子点分子信标qd-bhq2在不使用时，发夹bhq2-dna使得bhq2接近cdte:zn²⁺qd纳米颗粒并淬灭后者的荧光。当在通过将端粒酶引物(ts引物)、dntps和端粒酶提取物进行孵育得到的端粒酶反应产物体系中加入该量子点分子信标qd-bhq2时，发夹bhq2-dna与端粒酶反应产物杂交而被打开，使得bhq2远离cdte:zn²⁺qd纳米颗粒而不能淬灭后者的荧光，即cdte:zn²⁺qd纳米颗粒的荧光恢复。恢复的荧光信号可直接用于端粒酶活性的灵敏可视化检测。

附图说明

图1显示使用qd-bhq2量子点分子信标作为荧光探针在活细胞中进行端粒酶活性测定的原理示意图；

图2显示本发明一个实施方案制备的qd-bhq2量子点分子信标的表征，其中图2a显示该量子点分子信标的tem图像，右上角的插图显示高分辨率tem图像(hrtem图像)，该量子点分子信标的平均直径约4nm(图2a)，与游离qd相近(图2b)，通过动态光散射(dls)表征，该量子点分子信标的平均流体动力学直径为12.3nm(图2c)，而游离qd的平均流体动力学直径仅为6.2nm(图2d)；

图3显示该qd-bhq2量子点分子信标和游离qd的zeta电位；

图4显示该qd-bhq2量子点分子信标的紫外-可见光吸收光谱，可见具有两个特征峰，对于dna为257nm，对于bhq2为570nm；

图5显示通过mts测定法测试该qd-bhq2量子点分子信标的细胞毒性作用，可见对hela细胞没有表现出不利影响；

图6(a)显示该qd-bhq2量子点分子信标与不同靶序列的荧光光谱，图6(b)显示该qd-bhq2量子点分子信标与不同浓度的靶序列的荧光强度，其中图标nb标示纳米信标；

图7显示该qd-bhq2量子点分子信标与用不同浓度的ts引物合成的端粒酶反应产物孵育的荧光强度比率；

图8(a)显示该qd-bhq2量子点分子信标与递增数量的hela细胞的荧光光谱，图8(b)显示荧光强度比率与hela细胞数目(从10至600个细胞)对数值的线性关系图，误差条基于三个重复实验获得；

图9显示热失活的hela细胞的提取物的端粒酶活性检测结果；

图10显示与该qd-bhq2量子点分子信标一起孵育的hela细胞的共聚焦显微图像，其中图10(a)显示细胞与10、20、30μl的探针孵育3小时的结果；图10(b)显示细胞与20μl的该量子点分子信标孵育0、30、60、120、240分钟的结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细描述。应当理解，这些描述仅出于说明本发明的目的，并不意在以任何方式限制本发明。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域技术人员通常理解的含义相同。如果有冲突，以本说明书的定义为准。除另有说明的外，本文所用的化学物质和仪器可市售获得。本文中使用的材料、方法和示例仅作说明用途，无意作为限制，除非特别指明。

1.实验部分

1.1材料和仪器

碲(te)粉末、cdcl2·2.5h2o和zncl2购自上海化学试剂公司。n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)购自美国sigma-aldrich公司。所有化学试剂均为分析试剂级，无需进一步纯化即可使用。所有溶液均用超纯水制备，超纯水通过millipore水净化系统获得(18.25mω·cm,25℃)。

实验中所用的寡核苷酸序列如表1所示。寡核苷酸序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成和hplc纯化。

表1实验中所用的寡核苷酸序列

^a)*表示硫代磷酸酯键。

用uv-2250分光光度计(日本岛津)获取紫外-可见光吸收光谱。用rf-6000pc分光光度计(日本岛津)获取荧光光谱。用jeol(jem2100)电子显微镜(日本)获取透射电子显微图像(tem)和高分辨率tem图像(hrtem)。用zetasizer仪器zen3600(英国malvern)进行动态光散射(dls)测量。

1.2qd-bhq2量子点分子信标的制备

将20mgte粉末和11mgnabh4加入圆底烧瓶中，并加入1ml超纯水。将混合物在无氧条件下在冰浴中搅拌约5小时以获得nahte将57mgcdcl2、34mgzncl2和147mgn-乙酰-l-半胱氨酸用38ml超纯水溶解，制备cd前体，然后用naoh将cd前体的ph调节至9.0。将400μlcd前体和用1600μl超纯水溶解的不同数量的bhq2和硫代磷酸酯共修饰dna混合以获得cd-dna溶液。将nahte(5μl)快速加入到cd-dna溶液中，并将反应体系转移到teflon衬里的不锈钢高压釜中，在200℃下加热30分钟，得到bhq2-dna官能化的cdte:zn²⁺qd。冷却至室温后，在8000rpm离心10分钟纯化bhq2-dna官能化的cdte:zn²⁺qd，并用amiconultra-4离心过滤装置(截留分子量为50kda，美国millipore公司)用超纯水洗涤4次。

1.3从培养细胞中提取端粒酶

将hela细胞在含有10％fbs的dmem中培养，用胰蛋白酶收集细胞。将1×10⁶个细胞转移到1.5mlep管中，并以1000rpm离心10分钟收集沉淀物。用pbs(ph7.4)洗涤沉淀物，再次离心，然后分配到200μl冰冷的1×chaps裂解缓冲液中。将混合物在冰上孵育30分钟，并在4℃下以12000rpm离心20分钟。将含有端粒酶的上清液转移到新的1.5mlep管中并在-80℃下储存备用。

1.4从尿液样本中提取端粒酶

收集新鲜尿液样本(200ml)并在4℃下以1000rpm离心10分钟收集沉淀物。用pbs(ph7.4)洗涤沉淀物，并在4℃下以1800rpm离心5分钟。然后将沉淀物重悬于2ml冰冷的1×chaps裂解缓冲液中。将混合物在冰上孵育30分钟，然后在4℃以12000rpm离心20分钟。将含有端粒酶的将上清液转移到新的1.5mlep管中并在-80℃下储存备用。

1.5端粒酶延伸反应

将得自hela细胞或尿液样本的1μl端粒酶提取物和含有63mmkcl、0.04mmdntp和200nm端粒酶底物(ts)引物的9μl延伸反应缓冲液在管中混合。将混合物在37℃下孵育60分钟，得到端粒酶反应产物。对于对照实验，将端粒酶提取物在95℃下热处理30分钟。

1.6端粒酶检测

将不同浓度的端粒酶反应产物和退火的qd-bhq2量子点分子信标(100nm)加入到tris-hcl(20mm，ph7.90)中并在室温下孵育30分钟。混合溶液的总体积为400μl。在330nm的激发波长和510-640nm的发射波长下收集所有荧光光谱。

1.7活细胞成像

将hela细胞(5×10⁵个细胞)接种在20mm共聚焦培养皿中24小时，然后用250μlopti-mem中的10μllipofectamine3000在37℃转染0.5μmts引物1小时。随后，除去opti-mem转染混合物，并将含有10、20或30μl量子点分子信标的2ml新鲜培养基加入37℃的共聚焦培养皿中4小时。然后用新鲜的opti-mem替换上清液，在具有nikonti-e显微镜(60x物镜)和细胞培养环境室(tokaihit)的ultraviewvox旋转盘共聚焦激光扫描系统(perkinelmer公司)下观察细胞。具有红色发光发射的qd在561nm处被激发。

1.8mts测定

通过mts测定评估qd-bhq2量子点分子信标的细胞毒性。将hela细胞接种到96孔板中24小时。将上清液用含有0、5、25、50、75、100或125nm退火的qd-bhq2量子点分子信标的新鲜培养基替换，在37℃下保持24小时。然后，向每个孔中加入20μlmts并孵育4小时。使用nanodrop2000测量450nm处的吸光度。

2.结果与讨论

2.1qd-bhq2量子点分子信标的表征

本发明人用cdte:zn²⁺qd纳米颗粒作为荧光团，bhq2作为淬灭剂，设计了无细胞毒性的量子点分子信标(qd-bhq2)，用于测定体外和活细胞中的端粒酶活性。用硫代磷酸酯修饰的发夹bhq2-dna对cdte:zn²⁺qd纳米颗粒进行官能化，得到单分散的该量子点分子信标，其透射电子显微(tem)图像如图2a所示，图中右上角显示高分辨率tem图像(hrtem)。该量子点分子信标的平均直径约4nm(图2a)，与游离qd相近(图2b)，通过动态光散射(dls)表征，该量子点分子信标的平均流体动力学直径为12.3nm(图2c)，而游离qd的平均流体动力学直径仅为6.2nm(图2d)。此外，zeta电位分析显示，与游离qd纳米粒子相比，该量子点分子信标具有更大的负zeta电位，说明bhq2-dna成功偶联在qd的表面(图3)。紫外-可见光吸收光谱显示，bhq2-dna官能化的qd纳米颗粒具有两个特征峰，对于dna为257nm，对于bhq2为570nm(图4)。通过mts测定法测试该量子点分子信标的细胞毒性作用，显示对hela细胞没有表现出不利影响(图5)。这些结果表明，通过用硫代磷酸酯修饰的发夹bhq2-dna装配cdte:zn²⁺qd，成功开发了具有优异生物相容性的量子点分子信标。

2.2qd-bhq2量子点分子信标用于端粒酶体外检测

为了验证该量子点分子信标对端粒酶反应产物的响应，通过与不同靶序列孵育来测定该量子点分子信标的荧光光谱(图6a)。在330nm的激发波长下，该量子点分子信标中bhq2-dna官能化的qd纳米颗粒由于bhq2的淬灭作用而显示出弱的荧光强度，并且ts引物不能明显改变荧光强度。在存在extenddna(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)的情况下，荧光强度显著增强，这表明发夹bhq2-dna可以通过杂交被靶dna序列打开，并提供光学信号用于特异性检测。随着extenddna浓度的增加，qd荧光逐渐增加，而在不同浓度的引物下荧光强度保持不变(图6b)。

对反应体系中的ts引物的浓度进行优化，以获得端粒酶活性检测的高灵敏度。与一系列端粒酶反应产物孵育显著增加了qd荧光，所述端粒酶反应产物通过不同浓度的ts引物(10-800nm)和一定浓度的端粒酶(500个细胞)和dntps(40μm)合成(图7)。使用50nm的ts引物，量子点分子信标可以实现最佳的荧光恢复。

此外，我们在从人宫颈癌细胞(hela)提取的端粒酶活性的分析中，评估了所设计的量子点分子信标。如图8a所示，随着hela细胞数量从0增加到600个细胞，580nm处的qd荧光显示出明显的增强。荧光强度与hela细胞的数量成比例，并且如图8b所示，线性检测范围在10至600个细胞之间。获得了具有良好线性度(r²＝0.9789)的校准函数y＝0.24385+0.84569x(y，荧光强度；x，细胞数目的对数)。通过基于3σ/s(σ，标准偏差；s，标准曲线的斜率)计算，检测限(lod)为1个细胞。作为对照，在95℃下灭活的端粒酶提取物不能增强荧光强度(图9)。

我们还将本发明的方法与之前报道的一些方法进行了比较。可见，本发明的方法不用过多的化学修饰和信号放大，就可以实现相当的或更敏感的端粒酶活性检测，参见表1。

表1.本发明的端粒酶检测方法与之前报道的一些方法的比较

参考文献：

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这些结果表明，所构建的量子点分子信标显示出优异的荧光信号，可用于端粒酶活性的灵敏且有选择性的检测。

2.3qd-bhq2量子点分子信标用于端粒酶临床检测

作为第二常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，膀胱癌的发病率和复发率随年龄增长而增加。采用来自膀胱癌患者和正常人的17个尿液标本(深圳市第二人民医院提供)来评价所设计的量子点分子信标在临床诊断中的应用价值。与健康人的尿液相比，癌症患者的尿液能够明显恢复qd荧光，如表2所示。

表2.通过临床诊断和通过本发明方法获得的结果的比较

结果表明，qd-bhq2可用于非侵入性的基于尿液的端粒酶活性检测，具有良好的灵敏度，在复杂环境中具有良好的临床诊断潜力。

2.4qd-bhq2量子点分子信标用于端粒酶的细胞内检测

为了实现癌症早期诊断和治疗，有必要评估活细胞中的端粒酶活性。选择hela细胞作为模型细胞系，将其与不同浓度的qd-bhq2一起孵育，用于胞内端粒酶活性的原位成像。将细胞接种在20mm共聚焦培养皿中24小时，并将0.5μmts引物在37℃下转染到细胞中1小时。随后，除去转染混合物并用含有10、20或30μl量子点分子信标的新鲜培养基替换。随着量子点分子信标浓度的增加，通过旋转盘共聚焦显微镜观察hela细胞中荧光信号的显著增强(图10a)。在最初的30分钟内，没有观察到明显的荧光信号，在60分钟后发生弱荧光，然后荧光强度随着孵育时间的延长而逐渐增加(图10b)。因此，本发明的qd-bhq2量子点分子信标能够提供用于活细胞中端粒酶活性检测的光学信号，因而提供了一种用于癌症的早期诊断和治疗的新方法。

以上证明了本发明中使用的qd-bhq2量子点分子信标可以实现端粒酶活性的有效灵敏的检测，以下用非限制性实施例说明本发明的端粒酶活性检测试剂盒和端粒酶活性检测方法。

实施例1：端粒酶活性检测试剂盒

将20μl体积的端粒酶底物引物5’-aatccgtcgagcagagtt-3’、5μl体积的dntps和875μl体积的端粒酶逆转录缓冲液(20mmtris-hcl(ph＝8.3),1.5mmmgcl2,63mmkcl,0.005％tween20,bsa0.1mg/ml)装入第一个2ml体积的试剂容器中。将1mg重量的按上文实验部分的描述制备的qd-bhq2量子点分子信标溶于300μl体积的tris缓冲液(ph＝8.0)中，制备qd-bhq2量子点分子信标溶液。将100μl体积的该qd-bhq2量子点分子信标溶液装入第二个0.5ml体积的试剂容器中。将100μl端粒酶细胞提取物标准品溶液装入第三个0.5ml体积的试剂容器中。

将第一个试剂容器、第二个试剂容器和第三个试剂容器与端粒酶活性检测说明书一起装入包装盒中，得到端粒酶活性检测试剂盒。

实施例2：端粒酶活性的体外检测

收集新鲜尿液样本(200ml)并在4℃下以1000rpm离心10分钟收集沉淀物。用pbs(ph7.4)洗涤沉淀物，并在4℃下以1800rpm离心5分钟。然后将沉淀物重悬于2ml冰冷的1×chaps裂解缓冲液中。将混合物在冰上孵育30分钟，然后在4℃以12000rpm离心20分钟。将含有端粒酶的将上清液转移到新的1.5mlep管中并在-80℃下储存备用。

取该上清液1μl体积，并取实施例1的端粒酶活性检测试剂盒中的端粒酶底物引物0.2μl体积、dntps0.05μl体积、端粒酶逆转录缓冲液8.75μl体积，进行延伸反应(温度37℃，时间1h)。然后，取1μl反应体系，向其中加入实施例1的端粒酶活性检测试剂盒中的qd-bhq2量子点分子信标溶液1μl体积，并加入398μl体积的tris缓冲液(ph＝8.0)进行杂交反应(室温，时间10min)。观察是否存在580nm处被激发的红色荧光(激发波长340nm)。荧光的出现指示尿液中存在端粒酶。

如要对尿液样本中的端粒酶进行定量，可以先用一系列浓度的标准端粒酶溶液用同样的测定方法制作端粒酶浓度-荧光强度标准曲线，然后再测量尿液样本的荧光强度，通过该标准曲线得到尿液样本中的端粒酶含量。

实施例3：端粒酶活性的细胞外检测

将5×10⁵个hela细胞接种在20mm共聚焦培养皿中24小时。然后并取实施例1的端粒酶活性检测试剂盒中的端粒酶底物引物10μl体积。加入到250μlopti-mem中的10μllipofectamine3000中，在37℃下转染细胞1小时，随后除去opti-mem转染混合物。取实施例1的端粒酶活性检测试剂盒中的量子点分子信标20μl，加入到2ml新鲜培养基中，然后将混合物加入到细胞，共聚焦培养皿中37℃培养4小时。然后用2ml体积的新鲜的opti-mem替换上清液，在具有nikonti-e显微镜(60x物镜)和细胞培养环境室(tokaihit)的ultraviewvox旋转盘共聚焦激光扫描系统(perkinelmer公司)下观察细胞。观察是否存在580nm处被激发的红色荧光(激发波长340nm)。荧光的出现指示细胞中存在端粒酶。

以上应用了具体实例对本发明进行了阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形或替换。这些推演、变形或替换方案也落入本发明的权利要求范围内。

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<110>深圳市第二人民医院

<120>一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法

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