转基因玉米L239及其子代纯合体和杂合体的KASP检测引物的制作方法

本发明属于分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及转基因玉米l239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的kasp检测引物及应用。
背景技术：
：相对于传统育种技术而言，转基因育种技术具有精准和高效的优势。通过遗传转化直接获得的转基因品系，往往由于综合农艺性状表现不佳，不能够直接应用于生产，需要通过回交的手段，将外源基因导入一个具有优良农艺性状背景的材料中，然后才能获得可用于生产的转基因品系。在回交育种中，需要对转基因植株中外源片段的纯合和杂合情况进行判定。目前主要方法有实时定量pcr、普通pcr以及southern杂交。上述检测方法中，普通pcr需要电泳以及紫外观察的过程，操作繁琐，耗时长。southern杂交的过程更加复杂，而且需要用到放射性元素。荧光定量pcr相对前两者流程简化了很多，但是如果染色体上有多个外源片段插入时，利用荧光定量pcr的方法进行检测，结果的准确度会受到影响。三种方法的自动化程度均不高，单位时间内能检测的样本数量有限，而且手动操作容易导致实验误差和实验污染。依靠上述常规的方法，很难实现对转基因作物进行高通量且低成本的纯合体和杂合体的有效区分。转基因玉米l239是袁隆平农业高科技股份有限公司与北京大北农科技基团股份有限公司合作开发的一个对鳞翅目昆虫具有较好的抗性并对草甘膦除草剂具有较好的耐受性的转基因玉米自交系，而且农艺性状表现优良，产量与非转基因玉米自交系l239相当。因此，亟需开发一种高效且费用低廉的区分转基因玉米l239及其衍生品系纯合体和杂合体的方法。竞争性等位基因pcr(kompetitiveallelespecificpcr，kasp)是一种基于荧光检测的基因分型技术。该技术现阶段主要被应用于snp或indel基因分型研究中，正逐渐成为分子辅助育种、性状基因的精细定位，以及种子资源鉴定的主要技术手段。目前尚未见到利用kasp技术区分转基因玉米l239及其衍生品系纯合体和杂合体的引物及检测方法。技术实现要素：本发明的目的是提供转基因玉米l239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的kasp检测引物及应用。为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供转基因玉米l239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的kasp检测引物，所述引物包括(seqidno:1-3)：引物f:5’-tagtacgaaagcgaccccacc-3’引物h:5’-ccaacaccgtgaggctagtg-3’引物c:5’-gcaaataggaaacaggaaaggagac-3’第二方面，本发明提供含有所述引物f、h和c的检测试剂或试剂盒。第三方面，本发明提供所述引物f、h和c，或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定或筛选对鳞翅目昆虫具有较好抗性且对草甘膦除草剂具有较好耐受性的转基因玉米l239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体中的应用。进一步地，本发明提供一种用于鉴定对鳞翅目昆虫具有较好抗性且对草甘膦除草剂具有较好耐受性的转基因玉米l239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的方法，包括以下步骤：1)提取待测玉米基因组dna；2)向步骤1)提取的dna模板中加入特异的kaspprimermix和通用的kaspmastermix，进行pcr扩增；3)采用荧光检测仪分析pcr扩增产物。其中，所述kaspprimermix中含有三种特异性引物：引物f、h和c，它们的浓度分别为12um、12um和30um。进一步地，所述引物f的5’端添加fam荧光标签序列5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’，所述引物h的5’端添加hex荧光标签序列5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’。所述kaspmastermix包含如下各组分：通用的fretcassette荧光引物，rox内参染料，kleartaqdna聚合酶，dntp和mgcl2。步骤(2)中采用的pcr反应体系如下：组分384孔板100μmkaspprimermix0.02-0.022μl2×kaspmastermix0.6-0.9μldna模板0.6-0.9μl总体积1.22-1.822μl反应体系优选为：组分384孔板100μmkaspprimermix0.022μl2×kaspmastermix0.8μldna模板0.8μl总体积1.622μl步骤(2)中采用的pcr反应条件如下：90-95℃预变性10-20分钟；第一步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，退火并延伸30-90秒，5-20个touchdown循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.1-3.0℃)；第二步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，57-60℃退火并延伸30-90秒，20-30个循环。优选地，第一步扩增反应，退火起始的温度为60-65℃，退火结束的温度57-60℃，退火并延伸30-90秒，经历5-20个touchdown循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.15-2.6℃)。pcr反应条件优选为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个touchdown循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，35个循环。反应结束后对产物进行荧光扫描。步骤(3)具体为：若扩增产物中检测到与引物f对应的荧光，则判定待测玉米为野生型，若扩增产物中检测到与引物h对应的荧光，则判定待测玉米为转基因纯合体，若扩增产物中检测到两种不同荧光，则判定待测玉米为转基因杂合体。在本发明的一个具体实施方式中，由于引物f具有fam标签序列，引物h具有hex标签序列。不同基因型植物样品的反应产物将具有不同的荧光：(1)野生型植物dna：利用引物f和引物c能扩增出目的片段，但利用引物h和引物c不能扩增出目的片段；(2)转基因杂合体植物dna：利用引物f和引物c、引物h和引物c都能扩增出相应的目的片段；(3)转基因纯合体植物dna：利用引物h和引物c能扩增出目的片段，但利用引物f和引物c不能扩增出目的片段。因此，利用上述引物进行kasp反应，得到反应产物将释放出不同的荧光信号，最后能根据荧光信号的种类区分植物样品是转基因纯合体、杂合体还是野生型。根据上述原理，如果从某样品的产物中检测出显著的fam荧光和hex荧光，则表明该样品是转基因杂合体；如果仅检测到显著的fam荧光但没有检测到hex荧光，则表明该样品是不含转基因片段，可能为野生型；如果检测到显著的hex荧光但没有检测到fam荧光，则表明该样品是转基因纯合体；如果没有检测到显著的hex荧光以及fam荧光，则需要重新检测(图2)。因此，本发明通过对引物起点位置的设置，可以达到单个反应就能够确定待测样品为转基因纯合体、转基因杂合体或野生型。利用本方法进行检测时，需向反应体系中加入3条引物，如何保证3条引物之间不互相干扰是本发明有效解决的技术问题之一。另外利用本方法对大批量样品进行高通量检测时，保证检测结果的准确性和可靠性是本发明成功解决的另一个技术难点。为了测试本发明引物的效果以及利用本方法进行高通量检测的准确性，对已知基因型的转基因玉米l239样品进行纯合体和杂合体的检测，然后将检测的结果和样品本身的基因型信息进行比较。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：利用本发明提供的kasp引物能够高效且低成本地鉴定出转基因玉米l239及其子代和衍生品系是转基因纯合体、杂合体或野生型。以往lgc对于大片段插入缺失(>50bp)是分别在插入缺失的两端和内部分别设计两两配对的4条引物，而且必须有一条正向引物的3’端落在插入或缺失序列的第一个碱基上，因此该方法存在特定位点不一定满足引物设计要求的问题。本发明独创性地设计2条添加不同荧光基团的正向引物和一条通用的反向引物，在dna质量满足一般kasp反应(或常规pcr反应)需求的情况下，检测准确率可达100％。检测效率是荧光定量pcr的12～24倍，但检测成本仅为荧光定量pcr的1/10-1/4。同时反应体系构建可实现自动化，真正实现了高通量、低成本、自动化检测。附图说明图1为本发明kasp引物设计位置示意图。其中，深灰色两端代表植物基因组，中间大箭头线代表外源插入片段t-dna，小箭头标识出引物设计位置。图2为本发明实施例2中对已知基因型转基因玉米l239样品的检测结果图。其中，ntc表示反应孔中没有dna模板。图3为本发明实施例1中将转基因玉米dbn9936(与本发明中转基因玉米l239携带有相同的转基因抗虫耐除草剂事件)的3’基因组114bp序列，5’基因组130bp序列比对到玉米b73参考基因组上的结果。图4-图7分别为利用不同的候选kasp引物对转基因玉米l239样品的检测结果。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。以下实施例中使用的kaspmastermix购自lgc公司，产品编号为kbs-1016-012。热循环仪(hydrocycler)为lgckasp基因分型平台的水浴pcr仪。实施例1用于鉴定转基因玉米l239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的kasp引物的设计及优化根据cn201510220034.6中公开的转基因玉米dbn9936(与本发明中转基因玉米l239携带有相同的转基因抗虫耐除草剂事件)的t-dna3’基因组114bp序列，5’基因组130bp序列，使用oligo7软件设计了一系列kasp引物，然后用ncbi在线工具primer-blast进行引物评价，挑选出评分高，且在玉米参考基因组上特异性较好，且其他参数也表现较佳的3组候选kasp引物，交由赛默飞合成，并用已知基因型材料(与实施列2中所用材料相同)进行验证，结果表明这些kasp引物均不能有效区分转基因植物l239的杂合纯合，引物组合1～3对应的检测结果分别如图4～图6所示。3组kasp引物如下(5′-3′)：引物组合1：f1primer:gaaggtgaccaagttcatgctatgggcacacaagacacatc1primer:ccgtatccgcaatgtgttath1primer:gaaggtcggagtcaacggattatgggcacacaagacacaac2primer:aggaaacaggaaaggagacc引物组合2：f2primer2:gaaggtgaccaagttcatgctgaggctagtgccatcaataagc3primer2:cctcgctttcaaacactgath2primer:gaaggtcggagtcaacggattatgggcacacaagacacaac4primer:aggaaacaggaaaggagacc引物组合3：dbn-f-1:gaaggtgaccaagttcatgctaggggcaagaaaacatcccaadbn-h-1:gaaggtcggagtcaacggattagttatcagtcaaacggtcccdbn-c-1:gcaaataggaaacaggaaaggagac进一步地，利用maizegdb网站中blast工具将转基因玉米dbn9936中携带的t-dna的3’基因组114bp序列，5’基因组130bp序列比对到玉米b73参考基因组上，结果(图3)发现当将两端序列比对到参考基因组上，中间有91个碱基缺失(seqidno:4)，是不连续的，而kasp引物的有效扩增长度恰好为100bp左右，由于不确定该缺失的91个碱基究竟位于转基因事件的上游还是下游，因此分别以这91bp作为上游序列和下游序列设计了2组kasp引物，经过评价分别在每组中挑选出各参数表现最佳的kasp引物进行合成并验证，结果表明根据缺失的91bp在转基因事件的上游(3’端)设计的引物(seqidno:1-3)可以准确区分转基因玉米l239的杂合、纯合以及野生型(图2)，而另一候选kasp引物(seqidno:5-7)无法有效区分杂合、纯合以及野生型(图7)。由此获得本发明的kasp引物：引物f、h和c。实施例2用于鉴定转基因玉米l239及其子代和衍生品系纯合体和杂合体的方法l239是抗虫抗除草剂转基因玉米。利用本方法对l239纯合体、l239杂合体、非转基因的dna进行检测，然后对比检测结果是否与样品本身的基因型是否一致。实验的具体步骤如下：1、dna模板的准备：分别准备l239纯合体、l239杂合体以及非转基因玉米自交系l239玉米的dna。利用ctab提取方法分别从l239纯合体和非转基因l239玉米提取出dna，转基因杂合体dna是从以非转基因l239为轮回亲本并以转基因l239为供体的回交后代材料中提取。2、引物的设计以及合成：针对转基因玉米外源片段的插入位点分别设计了3条kasp引物(图1)，其中2条正向引物分别在外源插入片段5'基因组区域(引物f)和外源插入片段内部(引物h)，引物f的5'端添加了fam荧光标签序列(gaaggtgaccaagttcatgct)；引物h的5'端添加了hex荧光标签序列(gaaggtcggagtcaacggatt)，另外1条反向引物位于外源插入片段3'基因组区域(引物c)，引物序列的具体序列如表1所示。表1引物序列(合成引物时需要在引物f和h的5'端添加标签序列)引物名称seqidno:引物序列(5′-3′)f1tagtacgaaagcgaccccacch2ccaacaccgtgaggctagtgc3gcaaataggaaacaggaaaggagac3、反应体系的构建：将添加了标签序列引物、dna模板以及kasp反应液(表2)构建反应体系应用lgc的intelliqube全自动化pcr/qpcr体系建立系统。每个反应的dna模板量为30ng左右。表2反应体系组分384tape100μmkaspprimermix0.022μl2×kaspmastermix0.8μldna模板0.8μl总体积1.622μl所述kaspprimermix中引物f、h和c的浓度分别为12um、12um和30um。4、将加样完毕的反应板在热循环仪(hydrocycler)中进行pcr反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个touchdown循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，35个循环。5、结果分析：反应结束后对产物进行荧光扫描，扫描结果会以散点图的形式出现，根据散点图判断该样品的基因型：图形的横坐标表示产物释放的fam荧光，纵坐标表示产物释放的hex荧光。如果能检测出显著的fam荧光和hex荧光，则表明样品是l239转基因杂合体；如果仅检测到显著的hex荧光但没有检测到显著的fam荧光，则表明样品是l239转基因纯合体；如果仅检测到显著的fam荧光但没有检测到hex荧光，则表明样品是野生型；如果hex荧光和fam荧光都没有检测到，则需要重新检测(图2)。6、结果比较：将样品的检测结果与样品的基因型信息进行比较(表3)，一共检测了92个样品，其中92个样品的检测结果与样品本身的基因型信息一致，检测结果的准确率达100％，表明使用本发明方法对样品进行高通量检测具有很高准确性和可靠性。表3检测结果与样品本身的基因型信息比较虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>袁隆平农业高科技股份有限公司<120>转基因玉米l239及其子代纯合体和杂合体的kasp检测引物<130>khp181117461.0<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tagtacgaaagcgaccccacc21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccaacaccgtgaggctagtg20<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcaaataggaaacaggaaaggagac25<210>4<211>91<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4actagcagtagtagtagtacgaaagcgaccccaccaattggggaggaggagggacagacc60cgaagcgacggcaaatgaaagcgaggcgagg91<210>5<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gaaggtgaccaagttcatgctaggggcaagaaaacatcccaa42<210>6<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gaaggtcggagtcaacggattccaacaccgtgaggctagtg41<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gctttcatttgccgtcgcttc21当前第1页12