本发明涉及体外诊断试剂技术微生物鉴定领域，具体是涉及一种检测β-半乳糖苷酶的液体培养基及其在细菌鉴定中的应用。
背景技术：
β-半乳糖苷酶，全名为β-d-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-d-galactosidegalacto-hydrolase)，亦被称作乳糖酶(lactase)，广泛分布于人体、动物、植物和微生物中，能够催化β-半乳糖苷化合物中的半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。国内外学者对β-半乳糖苷酶进行了广泛深入的研究，其中，对大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶是研究最深入、最彻底的，并由此提出了乳糖操纵子学说。之后，β-半乳糖苷酶广泛运用于分子生物学、微生物学及临床检验当中。由于细菌是否含有β-半乳糖苷酶具有种间特异性，故β-半乳糖苷酶常作为特异性特征用于细菌种属区分及临床微生物细菌鉴定当中。
目前，β-半乳糖苷酶常作为进行细菌鉴定的商业化鉴定试验卡的重要组成进行试验，对临床肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌、链球菌科细菌等进行鉴定。如生物梅里埃公司的api20e采用邻硝基苯-β-d-半乳吡喃糖苷(onpg)检测β-半乳糖苷酶对肠杆菌和其它革兰氏阴性杆菌进行鉴别；api20ne采用对硝基苯-β-d-半乳吡喃糖苷(pnpg)检测β-半乳糖苷酶对非发酵细菌进行鉴别，vitek2gp卡采用onpg检测β-半乳糖苷酶对葡萄球菌和链球菌科细菌进行鉴别。上述商业化产品均利用细菌产生β-半乳糖苷分解底物pnpg和onpg，产生黄色产物进行检测，该试验在阳性结果判断时容易受到细菌生长浊度的影响。同时，hermantse等人在研究中发现，onpg等硝基苯酚类显色底物在检测葡萄球菌属细菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和路邓葡萄球菌时会出现假阳性现象，而运用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)则能准确的检测葡萄球菌属的β-半乳糖苷酶。
利用x-gal作为检测底物，细菌产生的β-半乳糖苷酶能对其进行分解并产生蓝色沉淀，结果分明容易判断，因此得到了广泛的研究利用。cn108285917公布了一种利用x-gal等显色底物检测大肠杆菌和沙门氏菌的方法。利用抑菌物质和显色底物，通过平皿检测法观察菌落颜色以此来区分和鉴别大肠杆菌和沙门氏菌；cn102827918亦公布了一种利用x-gal和丙烯乙二醇通过平皿检测法观察菌落颜色鉴别沙门氏菌。
上述专利均以x-gal作为检测底物，采用固定培养基对不同细菌的β-半乳糖苷酶进行检测从而对不同的细菌进行初步区分，不能对细菌进行精准鉴定，无法满足临床需求。采用生化鉴定方法的微生物鉴定试验卡是临床常见的细菌鉴定手段，其通常是将培养基通过干燥预先包被于试验卡的微量孔中，临床检测时将含细菌的生理盐水添加于试验孔，将培养基溶解从而实现测试。而x-gal作为一种非水溶性物质，难于溶解在水溶液中，因此将其包被在试验卡的微量孔中，检测效果差，结果判读不明确且容易出现假阴性。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供了一种检测β-半乳糖苷酶的液体培养基及其在细菌鉴定中的应用。该培养基利用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷作为底物，采用低毒性助溶剂和保护剂，能对活体细菌β-半乳糖苷酶进行液体法准确有效检测；且该培养基能运用于商业化的鉴定试验卡，其微量孔中的干燥底物能够有效的实现复溶并对活体细菌的β-半乳糖苷酶进行检测，从而使阴阳性结果更加分明，提高对临床常见革兰氏阴性和阳性细菌鉴定准确性。
为实现本发明的目的，本发明检测β-半乳糖苷酶的液体培养基，配方为：每1000ml培养基中含有营养物质5-50g，氯化钠2-10g，0.2mol/l的pbs50-250ml，特异性显色底物0.5～4g，酶诱导剂0.5～4g，助溶剂0.1～10ml，保护剂0.1～10ml。
优选的，所述特异性显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)。
优选的，所述酶诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)。
进一步的，所述营养物质可以是蛋白示磷酸盐肉汤和酵母粉，也可以是胰蛋白大豆肉汤、酵母粉和脑心浸液肉汤，还可以是酪蛋白水解物和酵母粉，还可以是脑心浸液肉汤和酵母粉。
优选的，所述助溶剂可以是二甲基亚砜(dmso)和吐温20，也可以是二甲基酰胺(dmf)和吐温20。
优选的，所述保护剂可以为甘油。
优选的，所述二甲基亚砜的浓度为0.01％～0.5％，例如0.2％。
优选的，所述吐温20的浓度为0.01％～0.25％，例如0.1％。
优选的，所述甘油的浓度为0.1％～0.5％，例如0.2％。
更优选的，所述二甲基亚砜、吐温20和甘油的体积比为(0.5～1.5):0.5:(0.5～1.5)，例如1:0.5:1。
更进一步的，所述每1000ml培养基中含有蛋白示磷酸盐肉汤5～20g，酵母粉2～8g，氯化钠3-10g，0.2mol/l的pbs50-150ml，特异性显色底物1～3g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)1～4g，助溶剂0.1～10ml，保护剂0.1～10ml。
更进一步的，所述每1000ml培养基中含有蛋白示磷酸盐肉汤5～30g，酵母粉2～20g，氯化钠5g，0.2mol/lpbs50-250ml，特异性显色底物0.5～3g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.5～4g，助溶剂0.1～10ml，保护剂0.1～10ml。
在本发明的一个实施例中，作为上述显色培养基进一步改进，每1000ml培养基中的蛋白示磷酸盐肉汤和酵母粉可替换成酪蛋白水解物10～50g，酵母粉1～10g。
在本发明的一个实施例中，作为上述显色培养基进一步改进，每1000ml培养基中的蛋白示磷酸盐肉汤和酵母粉可替换成胰蛋白大豆肉汤10～50g，酵母粉1～10g，脑心浸液肉汤1～10g。
在本发明的一个实施例中，作为上述显色培养基进一步改进，每1000ml培养基中的蛋白示磷酸盐肉汤和酵母粉可替换成脑心浸液肉汤10～50g，酵母粉1～10g。
本发明还提供了上述检测β-半乳糖苷酶的液体培养基在细菌鉴定中的应用，即作为液体培养基直接用于临床活菌的β-半乳糖苷酶检测。
此外，上述检测β-半乳糖苷酶的液体培养基还可通过干燥预先包被于试验卡的微量孔中，作为商品化检测试验卡或试剂盒用于临床细菌鉴定。
进一步的，本发明所述商品化检测试验卡的制备方法如下：
步骤(1)：制备液体培养基，用容器准确称量培养基配方中的营养物质，之后加入纯化水混匀溶解，待营养物质溶解完全后，加入所需量的保护剂，并搅拌混匀，置于高压蒸汽灭菌锅进行高压灭菌，灭菌后温度降至50-60℃时，将显色底物、酶诱导剂、助溶剂溶解混合后过滤除菌后的溶液倒入容器中得液体培养基；
步骤(2)：试验卡加样，在洁净环境下，将步骤(1)所得液体培养基添加至无菌试验卡中；
步骤(3)：干燥，在密闭的干燥设备对步骤(2)所得无菌试验卡进行干燥，使试验卡孔内培养基的水分逐渐散失；
步骤(4)：包装，在洁净环境下，对步骤(3)所得试验卡进行密封包装。
优选的，所述步骤(1)中高压灭菌可以是在121℃条件下灭菌15min。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
(1)解决了x-gal溶解性问题及对活菌检测的毒害问题。x-gal水溶性差只能采用有机溶剂进行溶解，传统平皿检测法由于细菌只与固体表面培养基接触，因此培养基中存在有机溶剂对细菌生长性影响较小，不会对检测结果造成重大影响，因此x-gal在平皿检测法中运用较普遍。但是，在液体活菌检测法中，由于有机溶剂对细菌生长具有毒害作用，限制了此类底物的应用。本发明采用低毒性的二甲基亚砜和表面活性剂吐温20组合作为助溶剂，同时采用甘油作为保护剂，既解决了x-gal显色底物的溶解性问题，同时又降低了培养基对细菌的毒害作用，保证细菌生长不受影响，使x-gal能应用于液体活菌检测中。
(2)增强了x-gal底物显色效果。通常用于检测β-半乳糖苷酶的培养基营养物质为蛋白胨、酵母粉(又称酵母浸粉)和牛肉浸膏，如cn108285917培养基营养物质为蛋白胨、酵母粉和牛肉浸膏；cn102827918培养基营养物质为蛋白胨和牛肉浸膏。此类营养物质在培养链球菌科细菌时效果较差，本发明优化培养基组合，满足链球菌等苛养菌的培养，同时提升了肠杆菌科细菌、非发酵菌和葡萄球菌的生长量，再加上适量的酶诱导剂，提高了β-半乳糖苷酶表达量，增强了底物显色效果。
(3)本发明解决了液体培养基包被及干燥后复溶问题，利于产品商业化。本发明通过添加二甲基亚砜和吐温20，既保证了底物的溶解，同时使液体培养基在干燥过程中牢牢粘附于试验卡的孔底部，确保干燥后试验卡不会出现“掉粉”现象。另外，孔内保留的二甲基亚砜和吐温20在活菌液体检测时能确保底物复溶，从而达到最佳的显色效果。本发明液体培养基可干燥并运用于商业化鉴定试验卡，能够有效的实现复溶并对活体细菌的β-半乳糖苷酶进行检测，提高对临床常见革兰氏阴性和阳性细菌鉴定准确性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种检测细菌β-半乳糖苷酶的液体显色培养基，每1000ml培养基中含有蛋白示磷酸盐肉汤25g，酵母粉5g，氯化钠5g，0.2mol/lpbs50ml，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷1g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)1g，二甲基亚砜2ml，吐温201ml，甘油2ml。
实施例2
一种检测细菌β-半乳糖苷酶的液体显色培养基，每1000ml培养基中含有酪蛋白水解物25g，酵母粉10g，氯化钠5g，0.2mol/lpbs50ml，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷1g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)1g，二甲基亚砜2ml，吐温201ml，甘油2ml。
实施例3
一种检测细菌β-半乳糖苷酶的液体显色培养基，每1000ml培养基中含有胰蛋白大豆肉汤20g，酵母粉5g，脑心浸液肉汤10g，氯化钠5g，0.2mol/lpbs50ml，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷1g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)1g，二甲基亚砜2ml，吐温201ml，甘油2ml。
实施例4
一种检测细菌β-半乳糖苷酶的液体显色培养基，每1000ml培养基中含有脑心浸液肉汤35g，酵母粉5g，氯化钠5g，0.2mol/lpbs50ml，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷1g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)1g，二甲基亚砜2ml，吐温201ml，甘油2ml。
对比例1
一种检测细菌β-半乳糖苷酶的液体显色培养基，每1000ml培养基中含有蛋白示磷酸盐肉汤25g，酵母粉5g，氯化钠5g，0.2mol/lpbs50ml，邻硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷2g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)1g。
对比例2
一种检测细菌β-半乳糖苷酶的液体显色培养基，每1000ml培养基中含有胰蛋白胨取25g，酵母粉5g，牛肉浸膏10g，氯化钠5g，0.2mol/lpbs50ml，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷1g，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)1g，二甲基亚砜2ml，吐温201ml，甘油2ml。
实施例5
不同浓度二甲基亚砜对细菌生长性及显色强度影响。按照实施例1培养基成份(二甲基亚砜除外)，采用不同浓度二甲基亚砜，制成液体液体培养基，观察不同浓度二甲基亚砜对底物显色强度和细菌生长性影响。检测方法为：向检测培养基中加入终浓度为105cfu/ml的细菌，置于35℃恒温箱孵育18-24h，观察不同浓度dmso培养基细菌阳性显色强度差别以及细菌生长性与对照培养基(不含显色底物和助溶剂)的差别。结果如表1所示。
表1不同浓度dmso对显色强度及细菌生长性影响
注：上表中显色强度“+”表示：蓝色；“v”表示：淡蓝色；“-”表示：无色；
生长性4+表示：细菌生长性与对照一致；生长性3+表示：细菌生长性与对照相比略差；生长性1+
和2+表示：细菌生长性与对照相比较差。
由表1可知，检测β-半乳糖苷酶培养基使用不同浓度二甲基亚砜会对细菌生长性和显色强度(阳性表型)造成影响。由测试结果可知，使用0.2％二甲基亚砜不会对细菌生长性造成明显影响，同时底物显色效果较佳，能够检测到明显的β-半乳糖苷酶阳性蓝色表型。
实施例6
添加保护剂甘油对显色强度影响。参照实施例1制作两种液体培养基，一种含有甘油(与实施例1一致)，另一种不包含甘油(其余成分与实施例1一致)。观察两种不同培养基底物显色强度差异。检测方法为：向检测培养基中加入终浓度为105cfu/ml的细菌，置于35℃恒温箱孵育18-24h，观察甘油对液体显色培养基显色强度的影响。结果如表2所示。
表2甘油对液体培养基显色强度的影响
注：上表中显色强度“+”表示：蓝色；“v”表示：淡蓝色；“-”表示：无色；
由表2可知，向液体培养基内添加适量甘油(0.2％)可以降低二甲基亚砜对细菌的毒害作用，使细菌正常生长并利用底物产生明显的蓝色阳性表型。
实施例7
特异性检测。将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和对比例1制成液体培养基，分别向培养基中加入终浓度为105cfu/ml的测试细菌，置于35℃恒温箱孵育18-24h。孵育完后观察培养基结果，蓝色或黄色则表示β-半乳糖苷酶阳性，记为“+”；无色则表示β-半乳糖苷酶阴性，记为“-”。观察结果如表3所示。
表3不同液体培养基β-半乳糖苷酶检测结果
由表3结果可知，采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷的实施例1、实施例2、实施例3和实施例4均能准确检测所测标准菌株的β-半乳糖苷酶，而采用邻硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷的对比例1检测金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌会出现假阳性现象。
实施例8
不同营养物质对β-半乳糖苷酶显色强度影响。将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和对比例2制成液体培养基，分别向培养基中加入终浓度为105cfu/ml的测试细菌，置于35℃恒温箱孵育18-24h。孵育完后观察培养基结果。观察结果如表4所示。
表4不同营养物质β-半乳糖苷酶显色结果
注：上表中显色强度“+”表示：蓝色；“v”表示：淡蓝色；“-”表示：无色；
由表4可知，实施例1、实施例2、实施例3和实施例4的β-半乳糖苷酶阳性结果明显，为蓝色表型。对比例2木糖葡萄球菌和屎肠球菌阳性均不明显，为淡蓝色表型。可见本发明通过优化培养基营养物质，增强了β-半乳糖苷酶阳性表型，提升了β-半乳糖苷酶检测效果。
实施例9
液体培养基和经干燥后微孔板(孔内含培养基粉末)效果比对。按照实施例1配方制成液体培养基，一部分直接用于细菌β-半乳糖苷酶检测，另一部分参照本发明方法制成微孔板。检测方法为：向液体培养基和微孔板内加入终浓度为105cfu/ml的细菌，并使液体培养基中液体体积和微孔板复溶后液体体积一致。之后置于35℃恒温箱孵育18-24h，观察液体培养基和微孔板内细菌β-半乳糖苷酶检测结果。观察结果如表5所示。
表5液体培养基和微孔板检测效果对比
注：上表中“+”表示：阳性蓝色表型；“-”表示：阴性无色表型；
由表5可知，本发明液体培养基和经干燥后微孔板均能检测细菌β-半乳糖苷酶，并能获得一致的明显阴阳性结果。本发明不仅使临床检验者能够方便的配置β-半乳糖苷酶显色培养基用于细菌β-半乳糖苷酶检测，而且可制成商品化β-半乳糖苷酶检测试验卡或试剂盒，对于提高临床检验者的工作效率和细菌鉴定准确性具有现实意义。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。