一种检测PRRSV的RT-LAMP引物组合物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测prrsv的rt-lamp引物组合物及其应用。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)也叫蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)引起的一种猪重大疫病。猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)全基因组长约15kb，是一种正链小rna病毒，与马动脉炎病毒(eav)、促乳酸脱氢酶病毒(ldv)和猴出血热病毒(shfv)同属于动脉炎病毒科。该病于1987年首次在美国的北卡罗纳、依阿华等州暴发，并在全美迅速蔓延。在美国，每年因为prrs造成的经济损失达5.6亿～6.6亿美元。在中国，自1996年首次分离到prrsv以来，很快传遍了国内各大猪场，其主要临床症状是仔猪呼吸困难、体温高热不退、皮肤发红以及母猪流产、死胎等繁殖障碍，给中国的养猪业带来了巨大的经济损失，并引起了业界广泛的关注。目前，对该病的诊断主要是对疑似病猪进行病料采集后进行病毒分离、elisa或rt-pcr等实验室相关检测，但这些诊断方法耗时长、成本高、对设备要求高，不利于疫病现场简便、快速、准确的确诊和应用，从而影响了该病的防控。

环介导恒温扩增技术(loopmediatedisothermalamplification,lamp)是一种在恒温反应条件下利用特异性引物和扩增酶的协助对模板进行周而复始扩增的一种快速诊断技术。该技术以其灵敏度高，特异性强，反应时间短、操作简单等特点，使其很快在流行病学监测、疾病诊断、动物病原物检测、食品安全检测等领域得到了广泛的应用。逆转录环介导恒温核酸扩增(rt-lamp)是一种在原反应液中加入适量的逆转录酶和bstdna聚合酶就可实现的rna病毒快速检测技术。近年来，该技术已广泛运用于病原体检测中，如猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细环病毒、埃博拉病毒等都相继建立了此技术。本发明基于rt-lamp技术原理，针对prrsv的orf5基因片段设计特异性引物，旨在建立适用于基层诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测prrsv的特异性rt-lamp引物组合物及其rt-lamp检测试剂盒和rt-lamp(环介导逆转录等温扩增)检测方法，该方法快速、便捷、灵敏、高效、特异性强，克服了目前病毒检测的操作繁琐、成本高、用时长等问题。

为了达到上述技术效果，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种检测prrsv的rt-lamp引物组合物，所述引物组合物包括：外引物f3和b3、内引物fip和bip以及环引物lf和lb，所述的外引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述的内引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示，所述的环引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示。

优选的，所述的引物还包括将f3、b3、fip、bip、lf和lb引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的dna分子。

本发明提供了上述引物组合物在rt-lamp方法中用以检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用。

所述的rt-lamp的反应条件为95℃5min高温变性；65℃温浴45min；80℃2min终止反应。

本发明还提供了上述引物组合物在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂盒中的应用。所述试剂盒的制备方法包括将各条引物单独包装的步骤。

一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，所述的试剂盒通过rt-lamp方法进行检测，所述的试剂盒包含seqidno.1～6所示引物。

本发明的有益效果为：

本发明针对prrsv设计六条引物，利用rt-lamp技术可快速实现对猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，经试验证明本发明技术耗时短，全程恒温，无需大型精密仪器，可在养猪场或者小型房间完成。减少了样品中病原物质降解的可能，整个过程操作简单，结果检出方便，所以也无需极其专业的人员来操作，适合大规模推广使用。

附图说明

图1是本发明实施例2环引物组检测prrsv的电泳图；m：dl2000dnamarker；1：常规引物；2：含loop引物；3：阴性对照；

图2是本发明引物组的特异性实验电泳图；m，dnamarker；1-5，分别为csfv、pcv-2、prrsv、ppv、prv；

图3是本发明引物组的灵敏性实验电泳图；a：m，dnamarker；1-5，分别为10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1稀释度的模板；b：m，dnamarker；1-5，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释度的模板；

图4是本发明引物组的临床应用验证电泳图；a：lamp电泳图，b：rt-pcr电泳图，m：superdnamarker，1-10：疑似临床病料。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

病毒与病料：猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪细小病毒(ppv)、猪圆环病毒2型(pcv2)由绵阳师范学院动物应用技术研究所保存；血清、淋巴结等临床病料由四川铁骑力士集团冯光德实验室提供。

主要试剂：10×thermopol反应缓冲液、bstdna聚合酶、mgso4购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；dntpmixture、dnamarker、minibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0、primescripttmonesteprt-pcrkitver.2、primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit购自takara公司；琼脂糖购自invitrogen公司；sybrgreeni购自厦门致善生物科技有限公司。

实施例1rna提取与病毒cdna合成

使用微量病毒核酸提取试剂盒takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0进行prrsv的核酸提取。根据该试剂盒说明书，提取该病毒活疫苗核酸rna，保存于-80℃备用或者立即使用。

利用以上所提取的prrsv核酸rna为模板，采用反转录试剂盒(primescriptrtmatermix(rr036a))进行反转录，合成病毒核酸对应的第一条dna链，即cdna。反转录体系见表1。

表1反转录体系

实施例2引物的设计与合成

参照genbank的prrsv基因序列(登录号：eu860248)设计引物，设计6条lamp引物，其中包括两条内引物fip和bip，两条外引物f3和b3,两条环引物f和b，引物信息见表2。

表2lamp引物序列

设计一对特异性loop引物(loop-b/loop-f)，loop引物能结合在扩增反应中形成的茎环结构上，加快环的形成，更有利于目的序列的快速扩增，提高扩增效率。因此，在反应体系中加入loop引物更有利于反应的进行，并在一定程度上缩短反应时间，提高反应效率。反应体系中加入loop引物进行lamp反应，结果如图1所示。由图可知，加入loop引物后，反应扩增效果更佳。因此本实验建立的loop引物是成功的。

实施例3prrsvrt-lamp检测方法的建立

反应体系的建立见表3。配制lamp反应体系时，需要注意：在加入bstdna聚合酶之前，需要将已配制好的其他反应物的混合液在95℃温浴5min，使dna变性，立即置于冰上冷却，冷却后再加入一定量的bstdna聚合酶，混合均匀。反应条件为：95℃5min高温变性；65℃温浴45min；80℃2min终止反应。反应终止后取4μl所得反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳(eb染色)，凝胶浓度为1.5％，结合凝胶成像系统显示结果。

表3初步建立的lamp反应体系

实施例4lamp反应引物的特异性

提取prrsv、csfv、pcv-2、ppv和prv五种病毒核酸，按照所建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒rt-lamp检测方法进行特异性试验和传统rt-pcr试验，验证建立的prrsvrt-lamp检测方法的特异性。

以prrsv、csfv、pcv-2、ppv和prv5种病毒核酸为模板检测rt-lamp体系的特异性，结果如图2所示。由图2可知，猪繁殖与呼吸综合征病毒rt-lamp检测法只能扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸而不能检测到其他非目标核酸，所以建立的rt-lamp具有很好的特异性。

实施例5prrsvrt-lamp的灵敏性试验

用去离子水对样品进行连续10倍梯度稀释，采用优化后的rt-lamp反应和传统rt-pcr反应，验证建立的prrsvrt-lamp检测方法的灵敏性。

以10^-1-10^-5稀释度的猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸为模板分别进行rt-lamp和rt-pcr反应，分析rt-lamp检测灵敏性，结果如图3。如图3a所示，rt-lamp可以检测到10^-5浓度核酸，而如图3b所示，rt-pcr只能检测到10^-3浓度核酸。通过多次试验都获得相同的结果。所以建立猪繁殖呼吸综合征病毒rt-lamp检测法比rt-pcr灵敏性高100倍。

实施例6prrsvrt-lamp临床应用验证

本实验计划对采集的10份疑似临床病料(血清、淋巴结等)采用lamp检测法进行检测，并且同时进行传统pcr方法检测，相互对比检测，验证二者的符合度。

采用对照的方法，对lamp反应进行临床应用的验证。将lamp反应和常规的pcr同时进行，对采集的10份疑似临床病料(血清、淋巴结等)进行检测，结果如图4所示。由图4可知，lamp检测与pcr检测的结果中都显示此批病料中有4个阳性样品，因此二者的符合度为100％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>绵阳师范学院

<120>一种检测prrsv的rt-lamp引物组合物及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggcttgcgaagaactgca18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tggttaaaggggttgccg18

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgccaacgatagagtttgcccttcctggcgctactcttgt40

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>5

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

taaggttgaggtcgaaggtcacctg25