检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法与流程

本发明涉及基因检测
技术领域：
，具体为一种检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法。
背景技术：
：苯丙酮尿症(pku)是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸(pa)代谢途径中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出。该病症在遗传性氨基酸代谢缺陷疾病中比较常见，其遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现不均一，主要临床特征为智力低下、精神神经症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等、脑电图异常。随着生物工程技术的不断发展，导致苯丙酮尿症的一系列基因突变位点已经被发现。针对该病症目前已经有了一些基因检测方法。如采用dna测序方法，将突变热点基因的碱基全部测出进行对比分析，从而得到检测结果，但是这种方法耗费时间非常长。专利cn101899518a公开了一种针对pku的基因检测方法，在该发明中，通过设计间隔突变位点一段距离的上游引物和下游引物，然后进行pcr扩增，最后进行凝胶电泳，通过操作人员肉眼观察条带来判断。这种方法中其引物设计使得扩增的dna片段较长，扩增效率不高，并且凝胶电泳操作很繁琐，肉眼观察电泳条带主观性强，对操作人员的能力和经验要求极高，在实际操作中，当有若隐若现的亮点时，极其不好判断，还需要另外单独进行测序进行辅证，而且电泳过程中易受到污染，准确率不是很高。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法。为实现上述目的，所采用的技术方案如下：检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法，先制得检测y204c、r243q、y356x和r413p四个位点的四组引物，其中，y204c突变位点的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-ccttgtataaaacccatgcttgcta-3’；突变型引物f2：5’-ccttgtataaaacccatgcttgctg-3’；共同下游引物r：5’-ccattgaccctgatgtggact-3’；r243q突变点位的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-actggtttccgcctccg-3’；突变型引物f2：5’-actggtttccgcctcca-3’；共同下游引物r：5’-tactcacggttcgggggtat-3’；y356x突变点位的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-tttcacttggggcctacagtac-3’；突变型引物f2：5’-tttcacttggggcctacagtaa-3’；共同下游引物r：5’-agctagtggctcacctttgtc-3’；r413p突变点位的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-tcggcccttctcagttcg-3’；突变型引物f2：5’-tcggcccttctcagttcc-3’；共同下游引物r：5’-aaaccgagtggcctcgtaag-3’；针对上述各个突变位点，将待检测的样本dna分别采用对应的引物进行realtime-pcr扩增并获取荧光数据，以判断各位点的情况。本发明是应用突变扩增系统原理(arms-pcr)结合荧光定量扩增(realtime-pcr)技术进行检测。根据pcr扩增时引物和模板精确互补时扩增效率大幅增加的特性，设计3’末端碱基和待测位点野生(正常)型碱基互补匹配的引物，同时设计3’末端碱基和待测位点突变型碱基互补的引物，分别进入体系进行扩增，只有对应的引物会特异结合模板，通过高保真dna聚合酶的扩增，体系中自带的荧光物质与扩增后的产物结合发出荧光，通过real-timepcr仪器绘制的荧光扩增曲线直接判断模板是正常型或者突变型。在申请人进行的约5000例国内临床样本检测中，y204c、r243q、y356x和r413p这四个位点所占比例达90％以上，突变率最高，在苯丙酮尿症基因中权重最大，中国人群突变携带率高。因此，针对上述四个位点，设计各位点处前端的正常型引物和突变型引物以及共同下游。本发明的引物设计使得扩增产物更短，约70-200bp，能够大量有效扩增，提升检测效率。通过荧光定量pcr仪进行扩增循环，在每次循环后在线同时读取荧光数据。在全部循环结束后，直接通过配套软件：cfx-manager得到荧光扩增曲线图，直观的判断相应的位点是否突变本方法简单高效，无需碱基测序，也不需要进行凝胶电泳，因此不需要操作人员肉眼读凝胶条带，极大提高了准确性，减少了操作步骤，节省电泳操作时间1小时以上。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。图1为r413p位点阴性的荧光曲线图；图2为r413p位点阳性的荧光曲线图；图3为r413p位点杂合的荧光曲线图；图4为y356x位点阴性的荧光曲线图；图5为y356x位点阳性的荧光曲线图；图6为y356x位点杂合的荧光曲线图；图7为y204c位点阴性的荧光曲线图；图8为y204c位点阳性的荧光曲线图；图9为y204c位点杂合的荧光曲线图；图10为r243q位点阴性的荧光曲线图；图11为r243q位点阳性的荧光曲线图；图12为r243q位点杂合的荧光曲线图。具体实施方式下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。1、预先制得检测y204c、r243q、y356x和r413p四个位点的四组引物，将所述引物存储于各个管内。其中，y204c突变位点的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-ccttgtataaaacccatgcttgcta-3’；突变型引物f2：5’-ccttgtataaaacccatgcttgctg-3’；共同下游引物r：5’-ccattgaccctgatgtggact-3’；r243q突变点位的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-actggtttccgcctccg-3’；突变型引物f2：5’-actggtttccgcctcca-3’；共同下游引物r：5’-tactcacggttcgggggtat-3’；y356x突变点位的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-tttcacttggggcctacagtac-3’；突变型引物f2：5’-tttcacttggggcctacagtaa-3’；共同下游引物r：5’-agctagtggctcacctttgtc-3’；r413p突变点位的引物碱基序列为：野生型引物f1：5’-tcggcccttctcagttcg-3’；突变型引物f2：5’-tcggcccttctcagttcc-3’；共同下游引物r：5’-aaaccgagtggcctcgtaag-3’。2、从人体取得edta抗凝全血2ml，血液样本的保存和运输需满足相关的要求。到达实验室后，使用相关试剂盒提取人体基因组dna，并检测浓度。3、检测试验时，取出引物储存管，简短离心使干粉聚集在管底部。按照引物管壁上的标注量，加适量灭菌超纯水，震荡混匀，使得干粉状引物配置成10um浓度的预混液备用。根据不同位点，将反应试剂分别加入每个pcr扩增管中，每个管中体系配制方法如下表，体系总共20ul，其中，q-pcrmastermix由厂家promega生产，其内含荧光染料。成分体积(ul)q-pcrmastermix10f1或f20.4r0.4超纯水7.2dna样本2如需配制多个反应体系，可以将试剂按照比例配制到离心管中，漩涡震荡混匀后，简短离心，再分装到pcr扩增管中。以y204c突变位点为例在配制时，先取其野生型引物f1和共同下游引物r按照上表成分配制加入pcr扩增管中，然后取其突变型引物f2和共同下游引物r也按照上表成分配制加入另一pcr扩增管中。将配制好的pcr扩增管插入到real-timepcr反应仪中，本实施例反应仪采用美国bio-rad厂家生产的cfx-connect荧光定量pcr仪。按照下表参数扩增在每一个循环后rt-pcr仪自动读取每一个反应孔中的荧光数据，所有循环完成后，通过cfx-manager软件收集到所有数值，并形成一张对应位点的荧光曲线图，四个位点即得到四张曲线图。在各荧光曲线图中会直观展现对应位点的野生型基因扩增曲线和突变型基因扩增曲线，通过曲线图来判断本次检测的dna样本在对应位点上是否存在突变。在判断前首先需要对曲线总体进行分析，观察整体扩增曲线，tm值是否一致，曲线是否有偏移等，以判断实验系统是否有污染，样本状态，浓度是否正常。其中，判断基因位点为野生型的条件是：f1和r配对扩增管所形成的的野生型基因扩增曲线的tm值应小于30，且扩增曲线呈典型扩增曲线状。f2和r配对扩增管所形成的突变型基因扩增曲线应在阈值下，如有扩增曲线，tm值应与野生型基因扩增曲线的值相差5以上。判断基因位点为杂合的条件是：f2和r配对扩增管所形成的突变型基因扩增曲线tm值应小于30，且扩增曲线呈扩增曲线状。同时f1和r配对扩增管所形成的突变型基因扩增曲线tm值应小于30，且扩增曲线呈扩增曲线状。判断基因位点为突变的条件是：f2和r配对扩增管所形成的突变型基因扩增曲线tm值应小于30，且扩增曲线呈扩增曲线状。f1和r配对扩增管所形成的的正常型基因扩增曲线应在阈值下，如有扩增曲线，tm值应与突变型基因扩增曲线的值相差5以上。如图1至图12所示为采用上述方法获得的y204c、r243q、y356x和r413p四个位点的典型的荧光曲线图，图中的l1指f1和r配对扩增管所形成的的野生型基因扩增曲线，l2指f2和r配对扩增管所形成的突变型基因扩增曲线，t指读取获得阈值线，tm值则表示l1或l2与阈值线相交点的横坐标值。其中，图1为r413p位点的阴性情况，该图中野生型基因扩增曲线l1后段呈指数扩增状，其tm值约24，小于30。突变型基因扩增曲线l2一直处于阈值线下。因此，判断其为r413p位点为野生正常型。图2为r413p位点的阳性情况，该图中突变型基因扩增曲线l2后段呈指数扩增状，其tm值约26，小于30。野生型基因扩增曲线l1一直处于阈值线下。因此，判断其为r413p位点为突变型。图3为r413p位点的杂合情况，图中l1和l2都呈扩增状，其tm值都小于30，因此判断r413p位点处一条染色体正常，另一条突变，即为杂合型。图4为y356x位点的阴性情况，该图中野生型基因扩增曲线l1呈扩增状，其tm值小于30。突变型基因扩增曲线l2一直处于阈值线下。因此，判断其为y356x位点为野生正常型。图5为y356x位点的阳性情况，该图中突变型基因扩增曲线l2呈扩增状，其tm值约25，小于30。野生型基因扩增曲线l1一直处于阈值线下。因此，判断其为y356x位点为突变型。图6为y356x位点的杂合情况，图中l1和l2都呈扩增状，其tm值都小于30，因此判断r413p位点处一条染色体正常，另一条突变，即为杂合型。图7为y204c位点的阴性情况，该图中野生型基因扩增曲线l1呈扩增状，其tm值为25，小于30。突变型基因扩增曲线l2最后段扩增，其tm值约32，与野生型基因扩增曲线的值相差5以上。因此，判断其为y204c位点为野生正常型。图8为y204c位点的阳性情况，该图中突变型基因扩增曲线l2呈扩增状，其tm值约19，小于30。野生型基因扩增曲线l1最后段扩增，其tm值为30，与突变型基因扩增曲线的值相差5以上。因此，判断其为y204c位点为突变型。图9为y204c位点的杂合情况，图中l1和l2都呈扩增状，其tm值都小于30，因此判断y204c位点处一条染色体正常，另一条突变，即为杂合型。图10为r243q位点的阴性情况，该图中野生型基因扩增曲线l1后段呈指数扩增状，其tm值约23，小于30。突变型基因扩增曲线l2一直处于阈值线下。因此，判断其为r243q位点为野生正常型。图11为r243q位点的阳性情况，该图中突变型基因扩增曲线l2后段呈明显上扬扩增状，其tm值约20，小于30。野生型基因扩增曲线l1一直处于阈值线下。因此，判断其为r243q位点为突变型。图12为r243q位点的杂合情况，图中l1和l2都呈扩增状，其tm值都小于30，因此判断r243q位点处一条染色体正常，另一条突变，即为杂合型。另外，在实验室中为了确保结果准确，还会同时进行阴性质控品、阳性质控品以及空白对照试验。阴性质控品试验：用预先准备的已知的正常型基因dna样本按照上述方法进行检测，其应该得到的荧光曲线图应满足f1和r配对扩增管所形成的的野生型基因扩增曲线tm值应小于30，且扩增曲线呈扩增曲线状。f2和r配对扩增管所形成的突变型基因扩增曲线应在阈值下，如有扩增曲线，tm值应与正常型基因扩增曲线的值相差5以上，否则视为试验无效，应检测试验中有无污染情况。空白对照试验：采用已灭菌的2μl纯水作为样本进行检测，其形成的野生型基因扩增曲线和突变型基因扩增曲线都应无扩增上扬，结果都显示为“n/a”。如有扩增上升曲线，则视为实验无效，应检测试验中有无污染情况。阳性质控品试验：用预先准备的已知的位点突变基因dna样本进行检测，其应满足f2和r配对扩增管所形成的突变型基因扩增曲线tm值应小于30，且扩增曲线呈扩增曲线状。f1和r配对扩增管所形成的的野生型基因扩增曲线应在阈值下，如有扩增曲线，tm值应与突变型基因扩增曲线的值相差5以上。否则视为试验无效，应检测试验中有无污染情况。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。序列表<110>重庆芯超医学检验所有限公司<120>检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法<130>2018<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>25<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>1ccttgtataaaacccatgcttgcta25<210>2<211>25<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>2ccttgtataaaacccatgcttgctg25<210>3<211>21<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>3ccattgaccctgatgtggact21<210>4<211>17<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>4actggtttccgcctccg17<210>5<211>17<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>5actggtttccgcctcca17<210>6<211>20<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>6tactcacggttcgggggtat20<210>7<211>22<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>7tttcacttggggcctacagtac22<210>8<211>22<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>8tttcacttggggcctacagtaa22<210>9<211>21<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>9agctagtggctcacctttgtc21<210>10<211>18<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>10tcggcccttctcagttcg18<210>11<211>18<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>11tcggcccttctcagttcc18<210>12<211>20<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>12aaaccgagtggcctcgtaag20当前第1页12