本发明涉及微生物工程
技术领域：
，具体涉及一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法。
背景技术：
：藻类生物燃料是全球可再生资源系统的重要组成部分。微藻中的油脂作为生物燃料的主要形式，是利用微藻中的油脂在催化剂条件下进行反应所制备的生物柴油，与传统的生物燃料相比，藻类生物燃料具有更多的优势。衣藻(chlamydimonas)是绿藻门、团藻目、衣藻属的单细胞真核绿藻，它的生活周期简单、培养方法简便、生长速度快，既可以在固体平板上形成单藻落，也可以进行液体培养，具有“绿色酵母”之称，因此可作为培养制备生物燃料。莱茵衣藻作为衣藻的一种，但并不是所有的莱茵衣藻都含有丰富的油脂。如果利用传统的育苗筛选出高产油脂的莱茵衣藻不仅周期长，而且筛选出来的莱茵衣藻并不能稳定保持高产油脂的特性。因此，只能通过诱变育种的方式来改变莱茵衣藻的遗传基因，从而短时间获得大量稳定性高的高产油脂莱茵衣藻。现有的诱变育种的方式有紫外线照射诱变育种、诱变剂诱变育种以及太空诱变育种三大类方式，但是都无法获得稳定性高的高产油脂莱茵衣藻。专利号为cn106591281a的发明公开了一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，该发明利用紫外线诱变与喹禾灵筛选相结合的方法对莱茵衣藻进行定向选育，筛选出高产油脂且品质优良的藻株，并对诱变藻株的总油脂含量进行测定分析；该发明首次采用紫外线诱变与喹禾灵筛选相结合的方法来进行诱变育种，为高产油脂藻株的选育提供良好的技术方案，也为微藻能源产业化发展提供了优良的藻株。但经过多次实验发现其诱变育种得到的诱变藻株数量少，而且多代培养后的莱茵衣藻油脂产量降低。因此，发明一种能解决上述问题的高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法是一项有待解决的技术问题。技术实现要素：(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法。(二)技术方案本发明通过以下技术方案予以实现：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，包括以下步骤：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于液体培养基中，活化培养20-32h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加入诱变剂后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养10min；3)高压诱变：将经过诱变剂处理处理后的莱茵衣藻利用高压进行诱变，其诱变压力为350-500mpa，诱变时间为1-3h；4)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于普通固体培养基中，培养5-7天；5)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15-20min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；6)传代培养：取步骤5中得到的突变藻株，放入液体培养基中活化培养并稀释，再放入固体培养基中进行传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。优选地，所述步骤1和步骤6中的活化培养的温度为35℃，光照强度为60000-100000lx。优选地，所述步骤2中的诱变剂为亚硝基乙基脲、硫酸二乙酯或乙烯亚胺其中的一种。优选地，所述步骤4和步骤6中的固体培养的温度为25℃，光照强度为4000-6000lx。优选地，所述液体培养基为lb液体培养基，固体培养基为em固体培养基。优选地，所述步骤6中的传代培养为三代以上的传代培养。(三)有益效果本发明与现有技术相比较，通过化学诱变和物理诱变相结合得到的诱变莱茵衣藻不仅油脂含量高于现有技术，与有诱变前莱茵衣藻相比油脂含量平均提高86.7％，而且经过三代以上的传代培养发现其稳定性高。另外，本发明诱变的方法简单，诱变条件容易实现，极大降低了诱变育苗的成本，实用性更强。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和80000lx光照强度下活化培养24h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加0.5g的亚硝基乙基脲后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养10min；3)高压诱变：将经过诱变剂处理后的莱茵衣藻利用400mpa高压诱变2h；4)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养6天；5)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；6)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。实施例2：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和70000lx光照强度下活化培养28h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加0.5g的硫酸二乙酯后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养10min；3)高压诱变：将经过诱变剂处理后的莱茵衣藻利用450mpa高压诱变1.5h；4)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为5800lx的条件下培养7天；5)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色20min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；6)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。实施例3：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和100000lx光照强度下活化培养24h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加0.5g的乙烯亚胺后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养15min；3)高压诱变：将经过诱变剂处理后的莱茵衣藻利用500mpa高压诱变3h；4)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为6000lx的条件下培养5天；5)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；6)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。实施例4：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和80000lx光照强度下活化培养28h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加0.5g的亚硝基乙基脲后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养20min；3)高压诱变：将经过诱变剂处理后的莱茵衣藻利用400mpa高压诱变3h；4)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养6天；5)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；6)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。实施例5：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和80000lx光照强度下活化培养24h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加0.5g的硫酸二乙酯后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养10min；3)高压诱变：将经过诱变剂处理后的莱茵衣藻利用400mpa高压诱变2h；4)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养6天；5)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；6)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。实施例6：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和80000lx光照强度下活化培养24h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加0.5g的乙烯亚胺后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养10min；3)高压诱变：将经过诱变剂处理后的莱茵衣藻利用400mpa高压诱变2h；4)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养6天；5)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；6)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。对比组1：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和80000lx光照强度下活化培养24h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)高压诱变：将莱茵衣藻利用400mpa的高压诱变2h；3)稀释培养：将高压诱变后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养6天；4)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；5)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。对比组2：一种高产油脂莱茵衣藻的诱变育种方法，其具体操作步骤如下：1)样品培养：将莱茵衣藻接种于lb液体培养基中，在35℃温度和80000lx光照强度下活化培养24h，使培养基中的莱茵衣藻的浓度范围在12000-20000cfu/ml；2)诱变剂处理：用试管取用5ml的活化后莱茵衣藻，向试管中加0.5g的亚硝基乙基脲后用玻璃棒搅拌20s，然后置于温室培养10min；3)稀释培养：将诱变剂处理后的莱茵衣藻放入烧杯中利用生理盐水进行10倍体积的稀释，然后将稀释后的莱茵衣藻均匀涂布于em固体培养基表面，然后在温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养6天；4)尼罗红染色筛选：将上述固体培养基中的琼脂切成1mm薄片，并用尼罗红染色液染色15min，再将诱染色后的琼脂片置于显微镜上观察，用接种针挑取琼脂片中油脂体积较大且数目较多的突变藻株；5)传代培养：取突变藻株放入lb液体培养基中活化培养并稀释至溶液体积扩大10倍，再放入固em固体培养基进行五代的传代培养得到高产油脂莱茵衣藻。为对比本发明的有益效果，取实施例1至对比组2中的诱变育种后的突变藻株，对其进行培养一个星期后测量藻株中脂肪占藻株干重的百分比，同时选取未经过由于的藻株培养一个星期后测量藻株中脂肪占藻株干重的百分比，并记录数据如下表1：表1实施例/脂肪比诱变藻株％普通藻株％实施例136.619.6实施例237.419.8实施例337.119.3实施例438.618.9实施例537.919.1实施例639.019.0对比组123.619.5对比组227.619.2从表1可以看出，通过诱变剂和高压诱变的莱茵衣藻，其内部脂肪含量提升高达87.6％以上，而仅通过诱变剂诱变或者高压诱变后的莱茵衣藻内部脂肪含量提升远不如两者的相结合。从以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12