一种马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种马铃薯卷叶病毒plrv的反转录环介导等温扩增rt-lamp检测试剂。

背景技术：

马铃薯(solanumtuberosum)是世界第四大粮食作物。病毒病是引起马铃薯退化的主要原因。马铃薯卷叶病毒(potatoleafrollvirus,plrv)是一种单链正义的rna病毒，属黄花病毒组，侵染马铃薯，引起叶片卷曲，叶肉革质化，叶色黄化，植株矮化等症状，是严重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一，给马铃薯产业造成巨大损失。我国国家标准(gb18133马铃薯种薯)和行业标准(ny/t1212-2006马铃薯脱毒种薯繁育技术规程)将马铃薯卷叶病毒列为马铃薯种薯上包括马铃薯x病毒pvx、马铃薯y病毒pvy、马铃薯s病毒pvs、马铃薯a病毒pva和马铃薯m病毒pvm等在内的必须剔除的6种病毒病之一。

病毒检测是马铃薯病毒病害防治、预测预报、脱毒种薯(苗)培育等过程中的一个重要环节。马铃薯卷叶病毒plrv检测主要有elisa、普通rt-pcr、多重rt-pcr、real-timert-pcr、基因芯片亦称为dna微点阵(dnamicroarray)等方法。elisa法虽然高通量，但程序繁杂、耗费时间、又灵敏度较低；而rt-pcr、多重rt-pcr和real-timert-pcr核酸检测技术虽然具有灵敏度和特异性高以及多同步性等优点，但仪器昂贵、成本高、耗时长，正是由于技术难度和成本问题，仅局限于试验室，难于在生产实际中推广应用。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)，是日本的荣研株式会社的notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增分子检测技术，该技术针对靶基因的6个特定区域设计4条特异性引物，在链置换dna酶(bstdnapolymerase)的作用下，在恒温(60-65℃左右)条件下快速对靶基因进行扩增，15～60min即可观察结果。lamp具有特异性强、灵敏度高、产物易检测、操作简单、快速且适合于多种检测环境等优点，自开发以来，其作为一种分子生物学检测技术，被广泛应用于许多领域的基因检测。反转录环介导等温扩增(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification，rt-lamp)技术在rna植物病毒检测方面的应用亦有报道，表现出简便、快捷、准确的特点。有关马铃薯卷叶病毒plrvrt-lamp检测方法前人做了尝试性研究，但迄今作为一项成熟技术在生产上特别是田间现场应用还未见报道。为了rt-lamp技术在马铃薯科研，特别是基层单位和生产一线的方便应用，需要建立简便、快捷、准确检测马铃薯卷叶病毒plrv的rt-lamp检测体系。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，针对plrv现有检测技术之不足，本发明提供了一种效率高的马铃薯卷叶病毒plrv的反转录环介导等温扩增rt-lamp检测试剂。

本发明提供用于检测马铃薯卷叶病毒plrv的反转录环介导等温扩增rt-lamp引物组，所述引物组由以下引物组成：

上游内引物fip：catcggatacgtcgtcagacgg-agggacgaaaccccgatac；

下游内引物bip：actgagtcgctgcgattggag-tgggccagtctgtaccat；

上游外引物f3：ggaaggaaaaccggttggaa；

下游外引物b3：gttcaggtgggtgccttg；

plrv-lf：caggttgtctttcctgcgttt；

plrv-lb：agtacctacgatgctacagtcg。

本发明提供一种马铃薯卷叶病毒plrv的反转录环介导等温扩增rt-lamp检测试剂，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。

作为优选，所述试剂还包括如下组分：10×bstbuffer、浓度为100mmol·l^-1的mg²⁺、dntps、浓度为2u·μl^-1的ung、浓度为8u·μl^-1的bst3.0dna聚合酶、引物混合液、终浓度为2ng·μl^-1的rna样品、sybrgreeni、depch2o。

作为优选，所述dntps中datp、dgtp、dctp的浓度为10mmol·l^-1，dutp的浓度为30mmol·l^-1。

作为优选，所述引物混合液中，f3和b3的浓度为2μmol·l^-1，fip和bip的浓度为8μmol·l^-1，lf和lb的浓度为6μmol·l^-1。

作为优选，所述试剂还包括阴性对照和阳性对照。

本发明提供一种马铃薯卷叶病毒plrv的反转录环介导等温扩增rt-lamp检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的反转录环介导等温扩增rt-lamp检测试剂。

本发明提供上述的检测试剂或检测试剂盒在如下任一中的应用：

(1)检测或辅助检测马铃薯卷叶病毒plrv；

(2)制备用于检测或辅助检测马铃薯卷叶病毒plrv的产品；

(3)检测或辅助检测待测植物样品是否感染马铃薯卷叶病毒plrv；

(4)制备用于检测或辅助检测待测植物样品是否为感染马铃薯卷叶病毒plrv的产品；

(5)检测待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒plrv；

(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒plrv的产品。

本发明提供一种检测或辅助检测待测植物样品是否感染马铃薯卷叶病毒plrv的方法，包括以下步骤：

(1)从待测植物样品中提取基因组rna作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行反转录环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述反转录环介导等温扩增的反应条件为：60℃反应50min；

(2)按照下述任一方法确定待测植物样品是否感染马铃薯卷叶病毒plrv：

a、反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现典型的阶梯状条带即为阳性；

b、加入1μl1000×sybrgreenⅰ，振荡混匀，直接目视观察结果，阳性产物颜色变为绿色，阴性产物颜色为褐色；

c、加入1μl50×sybrgreenⅰ，振荡混匀，紫外线下观察结果，阳性样品发出强荧光，阴性样品不发出强荧光。

本发明提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒plrv的方法，包括以下步骤：

(1)从待测病毒中提取基因组rna作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行反转录环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述反转录环介导等温扩增的反应条件为：60℃反应50min；

(2)按照下述任一方法确定待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒plrv：

a、反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现典型的阶梯状条带即为阳性；

b、加入1μl1000×sybrgreenⅰ，振荡混匀，直接目视观察结果，阳性产物颜色变为绿色，阴性产物颜色为褐色；

c、加入1μl50×sybrgreenⅰ，振荡混匀，紫外线下观察结果，阳性样品发出强荧光，阴性样品不发出强荧光。

本发明提供了一组新的马铃薯卷叶病毒(plrv)的rt-lamp检测的特异性引物，在此基础上建立了检测马铃薯卷叶病毒(plrv)的rt-lamp反应体系。本发明的rt-lamp检测体系，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测马铃薯卷叶病毒(plrv)，其成本低、准确且快速，在实际检测中展示出良好的应用前景，能很好满足目前对该病毒诊断和检测的迫切需要，用于基层单位、田间和进出口等的现场检测，易于大范围推广应用。

由于lamp反应在恒温条件下进行，因此可用简单设备如水浴锅或者保温杯控制温度，而不需要pcr仪等昂贵仪器，并且反应结果可通过肉眼观察扩增产物颜色变化，就能鉴定扩增与否，不需要繁琐的电泳和紫外观察。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为rt-lamp检测体系建立。

图2为rt-lamp特异性检测。

图3为rt-lamp和rt-pcr检测plrv灵敏度对比试验。

图4为田间样品plrv的elisa检测结果。

图5为田间样品plrv的rt-pcr和rt-lamp检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1材料与方法

实验于2017年1月至2018年10月在甘肃省农业科学院马铃薯研究所完成。

1.1材料

1.1.1生物材料

本实验所用马铃薯卷叶病毒plrv阴、阳性对照是甘肃省马铃薯脱毒种薯(种苗)病毒检测及安全评价工程技术研究中心试验室保存的离体组培苗，田间马铃薯样本为采自甘肃省马铃薯主产区的表观健康和具有花叶、卷叶症状的植株叶片。

1.1.2主要试剂

rna植物多糖多酚提取试剂盒(rnapreppureplantkit，q5613)购自天根公司，rnasinribonucleaseinhibitor、m-mlvreversetranscriptase、rtaqdnapolymerase、ung(rnaseinhibitor)、mgso4、dntpmix等购自takara公司，bst3.0dnapolymerase购自newenglandbiolabs公司，betaine、sybrgreeni等购自索莱宝公司，depc购自vetec公司，genefindertm购自至善生物公司，硝基四氮唑蓝(nbt)、琼脂糖等购自promega公司，das-elisa试剂盒购自bio-rad公司。

1.1.3主要仪器

vortex-genie2/2t漩涡混匀仪(美国si)、icen-24台式高速离心机(杭州奥盛公司)、君意-jy600c电泳仪(北京君意公司)、tanon-3500r琼脂凝胶成像系统(上海天能公司)、nanodrop2000spectrophotometer(thermofisherscientific)、bio-radt100^tmthermalcycler(bio-rad)、智能控温电热水壶whj1512d(美的midea)、数显水浴恒温器sha-c型(常州蒙特)、笔式紫外灯11sc-1(spectronics公司)。

1.2实验方法

1.2.1病毒rna提取

使用天根公司的植物多糖多酚提取试剂盒(rnapreppureplantkit，q5613)，根据试剂盒提供的步骤进行。抽提的病毒rna总核酸测定浓度检测后-80℃下保存备用。

1.2.2引物设计和合成

已有研究表明，世界上已报道马铃薯卷叶病毒plrv全基因序列之间高度同源，证明plrv基因较其它种类病毒存在序列的保守性；plrvcp基因同样具有高度的同源性及核酸一致率。根据genbank公布的plrvcp基因序列，选择保守区域orf3为靶标基因，利用primerexplorer4.0软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0)在其6个位点设计了8组rt-lamp引物。另外，引用ju、ahmadi等和乔楠等采用的3组引物。经多次试验，筛选出扩增效率最高的新设计的pb组引物(表1)。rt-pcr引用标准sn/t2627-2010中的引物序列(表2)。所有引物均由上海生工生物公司合成。

表1rt-lamp检测plrv的引物

表2plrvrt-pcr引物

1.2.3rt-lamp检测体系建立

根据已报道的rt-lamp反应条件确立初步反应体系，然后采取单因素变化试验，对rt-lamp反应中多个因素包括反应温度及mg²⁺、betaine、bst3.0dna聚合酶、dntps、ung、sybrgreeni、引物浓度等进行了一系列的优化试验，分别是以获得以下性能的检测结果为优化目标：阳性对照表现典型的阶梯状条带或加入1000×sybrgreeni后，阳性对照反应液颜色变为绿色，最终确定反应体系(25μl)：2.5μl10×bstbuffer、0.5μlmg²⁺(100mmol·l^-1)、1μldntps(datp、dgtp、dctp分别为10mmol·l^-1，dutp30mmol·l^-1)、1μlung(rnaseinhibitor，2u·μl^-1)、2μlbst3.0dna聚合酶(8u·μl^-1)、2.5μlprimermix(f3和b3为2μmol·l^-1，fip和bip为8μmol·l^-1，lf和lb为6μmol·l^-1)、1μlrna样品(终浓度为2ng·μl^-1)、1μlsybrgreeni(20×pcr级)、13.5μldepch2o。

除了rna样品外，各组分括号中的浓度表示是各组分母液的浓度。

反应条件：60℃反应50min。

对优化的rt-lamp反应体系，采用rt-pcr检测方法进行平行比对验证，rt-pcr检测按标准sn/t2627-2010的改进方法进行。

结果判读：rt-pcr扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分析，出现336bp扩增条带即为阳性。rt-lamp扩增产物(1)反应结束后，取产物5μl用2％琼脂糖凝胶电泳分析，出现典型的阶梯状条带即为阳性；(2)加入1μl1000×sybrgreenⅰ，振荡混匀，直接目视观察结果，阳性产物颜色变为绿色，阴性产物颜色为褐色，或者加入1μl50×sybrgreenⅰ，振荡混匀，紫外线下观察结果，阳性样品发出强荧光，阴性样品不发出强荧光。

1.2.4特异性验证

马铃薯卷叶病毒plrv、马铃薯x病毒pvx、马铃薯y病毒pvy、马铃薯s病毒pvs、马铃薯m病毒pvm和马铃薯a病毒pva等6种主要病毒，是国家马铃薯种薯标准规定必须检测剔除的6种病毒。利用优化的rt-lamp反应体系，对复合感染上述马铃薯6种主要病毒的阳性样品进行检测，采用rt-pcr检测方法进行平行比对验证。rt-lamp和rt-pcr检测方法同1.2.3。

1.2.5rt-pcr和rt-lamp灵敏度试验

为了确定本发明rt-lamp检测方法的灵敏度，以阳性植株总rna为模板，用无rna酶的水10倍梯度稀释10⁰-10⁸倍，采用rt-lamp和rt-pcr方法进行灵敏度比对试验。rt-lamp和rt-pcr检测方法同1.2.3。

1.2.6田间大样本样品检测验证

为检验本发明方法在生产中应用的可行性，田间采集表观健康和具有花叶、卷叶症状的疑似病毒病的植株样本90个，应用elisa、rt-pcr和rt-lamp方法分别进行检测。每种方法设置阳性对照和阴性对照。elisa检测按行业标准ny/t1212-2006的方法进行，rt-pcr和rt-lamp检测方法同1.2.3。

2结果

2.1rt-lamp体系的建立

应用本发明方法建立的rt-lamp反应体系扩增plrv，能产生lamp产物特殊的阶梯状条带，而空白对照和阴性对照不产生条带，rt-lamp检测结果与rt-pcr一致(图1a和b)。rt-lamp反应产物中加入高浓度(1000×)sybrgreeni后，阳性产物颜色变为绿色，阴性产物颜色为褐色，加入低浓度(50×)sybrgreeni后，紫外线下(笔式紫外灯)阳性样品发出强荧光，而阴性对照没有(图1c和d)。因此，rt-lamp检测可通过肉眼观察直接判断结果，较普通rt-pcr简单容易。

图1为rt-lamp检测体系建立；其中，a图：rt-lamp检测plrv；b图：rt-pcr检测plrv；c图：rt-lamp扩增产物高浓度sybrgreeni显色；d图：rt-lamp扩增产物低浓度sybrgreeni紫外显色。m：dna分子标尺；1：空白对照；2：阴性对照；3：阳性样品。

2.2特异性检测试验

plrv阳性对照和已知感染plrv的复合感染样品经rt-lamp检测均出现了典型的阶梯状条带，均显示阳性，阴性对照和未感染plrv但复合感染其他种类病毒的样品均显示阴性，表明本发明方法与其他5种马铃薯主要病毒(马铃薯x病毒pvx、马铃薯y病毒pvy、马铃薯s病毒pvs、马铃薯a病毒pva和马铃薯m病毒pvm)不发生交叉反应，只特异性扩增plrv，且rt-lamp检测结果与rt-pcr一致(图2a和b)。可视化判读，plrv阳性样本反应液颜色变为绿色，显示为阳性，而阴性和非plrv样本反应液的颜色为褐色，显示为阴性(图2)。可见，建立的rt-lamp检测可通过肉眼观察直接判断结果，与普通rt-pcr判读结果比较，简单快捷。

本实施例表明，利用筛选的rt-lamp引物和建立的rt-lamp体系对plrv检测具有特异性。

图2为rt-lamp特异性检测；其中，a图：rt-lamp检测plrv；b图：rt-pcr检测plrv；c图：rt-lamp扩增产物高浓度sybrgreeni显色；d图：rt-lamp扩增产物低浓度sybrgreeni紫外显色。m：dna分子标尺；1：阴性对照；2：阳性对照；3：plrv+pvs+pvm；4：plrv+pvx；5：plrv+pvy；6：plrv+pva；7：pvs+pvm；8：pvy+pva。

2.3灵敏度检测试验

灵敏度试验显示rt-lamp可检测到10⁰-10⁴倍的plrv总rna稀释液模板，而普通rt-pcr只能检测到10⁰-10²倍的plrv总rna稀释液模板，表明rt-lamp灵敏度是rt-pcr的10²倍(图3)。经计算rt-lamp技术可检测rna浓度最小为5×10^-3ng·μl^-1。rt-lamp产物中添加sybrgreenⅰ染料后，阴性样品为褐色，阳性样品呈绿色，随plrv总rna稀释浓度倍数的增加颜色变得不易区分，但在紫外线下，是否扩增很容易辨别(图3c和d)。

图3为rt-lamp和rt-pcr检测plrv灵敏度对比试验；其中，a图：rt-lamp检测plrv；b图：rt-pcr检测plrv；c图：rt-lamp扩增产物高浓度sybrgreeni显色；d图：rt-lamp扩增产物低浓度sybrgreeni紫外显色。m：dna分子标尺；1：阴性对照；2-10：阳性样品稀释10⁰-10⁸倍。

2.4田间大样本样品检测验证

为检验本发明在生产中应用的可行性，田间采集表观健康和具有花叶、卷叶症状的疑似病毒病的植株样本90个，应用elisa、rt-pcr和rt-lamp三种检测方法进行检测。结果表明，elisa检测出30个阳性样品(图4)，rt-lamp和rt-pcr均检测出28个阳性样品(全部包含在elisa检出30个阳性样品中)(图5a和b，结果未全部显示)。采用上述三种检测方法对elisa多检出的2个阳性样品进行复检，结果是三种检测方法一致判定为阴性，可见，rt-lamp和rt-pcr二者检测方法结果一致，符合率为100％，而elisa检测存在个别的假阳性判定。样品2、10、11、和17在rt-pcr检测中电泳条带比较弱，而在rt-lamp检测中电泳条带明显，说明rt-lamp方法较rt-pcr具有较高的灵敏度。另外，可视化颜色变化结果与电泳检测结果对应一致(图5c)。因此，建立的rt-lamp方法可应用于田间样品快速、准确地检测与诊断。

图4为田间样品plrv的elisa检测结果；其中，c12、d12：阳性对照，e12、f12：阴性对照，g12、h12：空白对照；其它孔：检测样品。

图5为田间样品plrv的rt-pcr和rt-lamp检测结果；其中，a图：rt-lamp检测plrv；b图：rt-pcr检测plrv；c图：rt-lamp扩增产物高浓度sybrgreeni显色；m：dna分子标尺；1：空白对照；2：阴性对照；3：阳性对照；4-29：部分田间样品(1-26)。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。