本发明涉及一种植物抗病性
技术领域：
，具体涉及本一种采用玉米干种子快速检测粒腐病抗性的方法。
背景技术：
：玉米粒腐病是玉米生长后期的重要病害之一，是一种世界性病害。它具有蔓延快，危害严重，造成玉米减产、降低玉米品质的特点。它是由多种真菌侵染引起的病害，由禾谷镰刀菌、串株镰刀菌、层出镰刀菌、青霉菌、曲霉菌、枝孢菌、单瑞孢菌等近20多种霉菌单一或复合浸染引起的病害。粒腐病危害玉米果穗和籽粒，造成大片或整个果穗腐烂，病粒皱缩、无光泽、不饱满，造成减产，影响带菌种子发芽率和幼苗成活率。而黄曲霉、镰刀菌霉菌在生长过程中会产生毒素，由它所引起的粒腐病籽粒在制成产品或直接供人食用时，会造成头晕目眩、恶心、呕吐。染病籽粒作为饲料时，常引起猪的呕吐，严重的会造成家畜家禽死亡。对玉米粒腐病的防治方法有：种植抗病品种、农业防治和化学防治，其中，种植抗病品种是最直接有效的防治方法。因此，快速高效检测出玉米粒腐病的抗性，具有重要的应用价值。目前，我国常用的粒腐病抗性检测方法为：采用感病果穗上分离出的致病优势菌禾谷镰刀菌或次优势菌病串珠镰刀菌，接种在活体玉米植株果穗上，人工接种引发病害发生。该检测方法的致病菌单一，研究具有季节性，周期较长，耗费较大场地和人力。技术实现要素：鉴于上述内容，本发明提供一种采用玉米干种子快速检测粒腐病抗性的方法，以干种子为接种对象，以多种病菌作为接种致病菌，高效引发籽粒发病大方法。该方法接种用致病菌种类多，接种材料随取随用，没有季节限制，有效提高发病效果，缩短了病害抗性鉴定时间，整套技术操作简单、易学易懂，室内就能完成，占用场地少，花费人力，具有实际应用价值。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案，包括以下步骤：(1)玉米粒接种前准备：选择干净、健康的玉米易感品种干种子，清洗干净，干种子用醋酸青鲜素溶液浸泡，干种子基部尖端去掉，露出种脐，于4℃～8℃冰箱存放，待接种用；(2)制备粒腐病孢子悬浮液：从田间选取粒腐病严重的玉米果穗，用无菌水浸泡10min；反复用蒸馏水洗脱3次，每次洗脱蒸馏水用量50ml，浸泡液和洗脱液混合后，以6500～7000rap/min转速离心20min，去除离心管内上清液，保留底部沉淀，重复离心3次，直至洗脱液全部被离心；最后收集离心管底部沉淀，静置，用无菌水配成孢子悬浮液；(3)接种玉米粒：将玉米粒基部朝下，竖直放置于内含孢子悬浮液和玉米芯的滤纸培养皿中，种脐与孢子悬浮液相触；(4)发病培养：将步骤(3)中的滤纸培养皿放置于人工培养箱中培养，人工气候培养箱温度为25℃～28℃，湿度为75％～95％。进一步的，所述步骤(1)醋酸青鲜素溶液，醋酸浓度为2mol/l～8mol/l，青鲜素浓度为10mg/l～25mg/l，浸泡种子的温度和时间分别为25℃～28℃、6～16h。进一步的，所述步骤(2)配置的孢子悬浮液中真菌活菌数浓度为：5×104～8×104个/ml。进一步的，所述步骤(3)内含孢子悬浮液和玉米芯的滤纸培养皿制备方法为：将无菌滤纸放置在培养皿中，再倒入孢子悬浮液，孢子悬浮液以淹没滤纸为准，再将玉米芯均匀洒在滤纸上。进一步的，所述步骤(3)内含孢子悬浮液和玉米芯的培养皿，孢子悬浮液和玉米芯的比例为：2ml：2.5g。进一步的，所述步骤(4)滤纸培养皿在人工气候培养箱中培养时间为10～15d。利用上述方法接种结果，导致籽粒出现腐烂或出现的白色、粉红色、蓝绿色、黑灰色或暗褐色、黄褐色霉层或交织粘连菌丝，感染玉米粒腐病病粒率达90％以上。本发明与现有技术相比具有如下的优点：1、粒腐病的侵染与籽粒种皮厚度、籽粒内部水分有一定关系。随着玉米籽粒逐渐完成蜡熟期，进入完熟期，种皮及种子内部水分逐渐变少，种皮变厚，籽粒变硬，种子很少感染粒腐病。此外，种子及时收获并正常晒干，会降低感染粒腐病发生概率。本发明以干种子为接种材料，采用醋酸青鲜素溶液浸泡，一方面，醋酸促进种子吸水膨胀，种皮变软，增加种子内部含水量，为病原菌侵染提供适宜湿度。另一方面，青鲜素是一种选择性除草剂或暂时性植物生长抑制剂，具有抑制植物组织生长与分裂的功能，常用于延长农产品贮藏期，它能抑制或延长玉米种子胎萌，延长种子休眠，使种子处于不发芽状态。采用醋酸青鲜素溶液浸泡处理，人工模拟出新鲜玉米籽粒模型，用于接种，解决了活体植株带来的季节性的问题，缩短了周期，效率更高。2、病菌主要从伤口侵入，当玉米产生生长裂伤或被玉米穗虫、玉米螟及其他害虫为害造成时，伤口易发病。本方法中摘除干种子基部尖端，目的是在基部制造轻微伤口，有利于孢子侵染种子，利于孢子在种子内部成活、繁殖。3、籽粒接种方法为玉米基部放置于含孢子悬浮液和玉米芯的滤纸培养皿，利于致病菌快速生长。滤纸具有吸水保湿的作用，为病菌提供了适宜的湿度，利于病菌繁殖生长，同时有助于玉米伤口部分接触到致病菌。玉米芯中，粗蛋白含量达2％，纤维素含量为35.64％，半纤维含量为31.42％，全碳含量为48.75％，可溶性碳水化合物为58.4％，全氮含量为0.38％。它不仅有保湿作用，而且还能为致病菌的生长和繁殖提供营养物质。4、用此方法所得人工接种发病症状与田间症状一致，重现性好。本发明接种和培养发病方法模拟了自然环境下的人工发病，致病菌在籽粒上的发病症状与田间人工接种发病一致。【具体实施方式】以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例1：一种采用玉米干种子快速检测粒腐病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)玉米粒接种前准备：选择干净、健康的玉米易感品种cml171干种子，清洗干净，干种子用醋酸青鲜素溶液于25℃下浸泡6h，干种子基部尖端去掉，露出种脐，于4℃冰箱存放，待接种用；其中，醋酸青鲜素溶液的配制方法为：将1ml热的三乙醇胺加入到10mg青鲜素中，搅拌溶解，加入114.3ml醋酸溶液，用蒸馏水定容至1l，配成2mol/l醋酸浓度10mg/l青鲜素浓度的溶液。(2)制备粒腐病孢子悬浮液：从田间选取粒腐病严重的玉米果穗10个，用无菌水浸泡10min；反复用蒸馏水洗脱3次，每次洗脱蒸馏水用量50ml，将浸泡液和洗脱液混合后，以6500rap/min转速离心20min，去除离心管内上清液，保留底部沉淀，重复离心3次，直至洗脱液全部被离心；最后收集离心管底部沉淀，静置，用无菌水配成5×104个/ml浓度的孢子悬浮液；(3)接种玉米粒：选规格为30mm的培养皿，将无菌滤纸放置在培养皿中，再倒入1ml孢子悬浮液，孢子悬浮液以淹没滤纸为准，再将1.25g玉米芯均匀撒在滤纸上，将玉米粒基部朝下，竖直放置于内含孢子悬浮液和玉米芯的滤纸培养皿，种脐与孢子悬浮液相触；(4)发病培养：将步骤(3)中的培养皿放置于人工培养箱中培养10d，人工气候培养箱温度为25℃，湿度为75％。实施例2：一种采用玉米干种子快速检测粒腐病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)玉米粒接种前准备：选择干净、健康的玉米易感品种cml171干种子，清洗干净，干种子用醋酸青鲜素溶液于26.5℃下浸泡11h，干种子基部尖端去掉，露出种脐，于6℃冰箱存放，待接种用；其中，醋酸青鲜素溶液的配制方法为：将1ml热的三乙醇胺加入到17.5mg青鲜素中，搅拌溶解，加入285.8ml醋酸溶液，用蒸馏水定容至1l，配成8mol/l醋酸浓度17.5mg/l青鲜素浓度的溶液。(2)从田间选取粒腐病严重的玉米果穗10个，用无菌水浸泡10min；反复用蒸馏水洗脱3次，每次洗脱蒸馏水用量50ml，将浸泡液和洗脱液混合后，以6750rap/min转速离心20min，去除离心管内上清液，保留底部沉淀，重复离心3次，直至洗脱液全部被离心；最后收集离心管底部沉淀，静置，用无菌水配成6.5×104个/ml浓度的孢子悬浮液；(3)接种玉米粒：选规格为60mm的培养皿，将无菌滤纸放置在培养皿中，再倒入2ml孢子悬浮液，孢子悬浮液刚好淹没滤纸，再将2.5g玉米芯均匀撒在滤纸上，将玉米粒基部朝下，竖直放置于内含孢子悬浮液和玉米芯的滤纸培养皿，种脐与孢子悬浮液相触；(4)发病培养：将步骤(3)中的培养皿放置于人工培养箱中培养12.5d，人工气候培养箱温度为26.5℃，湿度为85％％。实施例3：一种采用玉米干种子快速检测粒腐病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)玉米粒接种前准备：选择干净、健康的玉米易感品种cml171干种子，清洗干净，干种子用醋酸青鲜素溶液于28℃下浸泡16h，干种子基部尖端去掉，露出种脐，于8℃冰箱存放，待接种用；其中，醋酸青鲜素溶液的配制方法为：将1ml热的三乙醇胺加入到25mg青鲜素中，搅拌溶解，加入457.2ml醋酸溶液，用蒸馏水定容至1l，配成8mol/l醋酸浓度25mg/l青鲜素浓度的溶液。(2)从田间选取粒腐病严重的玉米果穗10个，用无菌水浸泡10min；反复用蒸馏水洗脱3次，每次洗脱蒸馏水用量50ml，将浸泡液和洗脱液混合后，以7000rap/min转速离心20min，去除离心管内上清液，保留底部沉淀，重复离心3次，直至洗脱液全部被离心；最后收集离心管底部沉淀，静置，用无菌水配成8×104个/ml浓度的孢子悬浮液；(3)接种玉米粒：选规格为100mm的培养皿，将无菌滤纸放置在培养皿中，再倒入5ml孢子悬浮液，孢子悬浮液刚好淹没滤纸，再将6.25g玉米芯均匀撒在滤纸上，将玉米粒基部朝下，竖直放置于内含孢子悬浮液和玉米芯的滤纸培养皿，种脐与孢子悬浮液相触；(4)发病培养：将步骤(3)中的培养皿放置于人工培养箱中培养15d，人工气候培养箱温度为28℃，湿度为90％。对照组1：其他步骤与实施例1完全相同，但是步骤(1)干种子用清水浸泡处理。对照组2其他步骤与实例1完全相同，但是步骤(1)干种子用10mg/l青鲜素溶液25℃下浸泡6h。对照组3：其他步骤与实例1完全相同，但是步骤(1)干种子用2mol/l醋酸溶液25℃下浸泡6h。对照组4：其他步骤与实例1完全相同，但是步骤(1)不摘除干种子基部尖端。对照组5：其他步骤与实例1完全相同，但是步骤(3)培养皿中不加滤纸。对照组6：其他步骤与实例1完全相同，但是步骤(3)培养皿中不加玉米芯。对照组7：其他步骤与实例1步骤(2)相同，采用国内常用的人工接种易感品种cml171活体植株，自然条件下培养。其中，自然条件下的温度为25℃，湿度为76％。上述接种具体方法：玉米植株吐丝后15d用，用连续注射器上按上10cm长的针头，在穗中部刺透苞叶，刺伤1个籽粒，但不刺伤穗轴，然后注入2ml的5×105个/ml孢子悬浮液，只接种一次。上述实施例和对照度，分别处理20粒干种子，每个培养皿中接种1粒籽粒，重复3次，15d后观察统计试验结果。测试试验：试验调查实施例和对照组的籽粒发病情况，统计籽粒内部平均腐烂面积率以及籽粒表面菌落面积率发病率，具体见表1。表1组别内部平均腐烂面积率(％)籽粒表面平均长菌面积率(％)实施例192.1100.0实施例293.5100.0实施例395.6100.0对照组100对照组2067.2对照组3070.9对照组4085.3对照组5070.3对照组6056.8对照组791.2100.0由上表可以，使用本发明的醋酸青鲜素溶液浸泡种子，两种化合物协同作用下，促进干种子吸胀，种皮变软，延缓种子萌发，利于接种发病，于内含孢子悬浮液和玉米芯的滤纸培养皿中接种病菌，操作简单，不受季节限制，极大程度地缩短了接种和发病时间，且用此方法所得接种发病症状与田间症状一致，是一种快速有效检测玉米粒腐病抗病性的方法。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12