本发明属于生物制醇
技术领域：
，特别涉及一种赤藓糖醇的制备方法。
背景技术：
：赤藓糖醇（1，2，3，4-丁四醇）是四碳糖醇具有蔗糖甜度约75%的甜味物质。它存在于酱油、酱类、葡萄酒、干酪等发酵食品；同时，也存在于人和动物的组织及体液中。赤藓糖醇具有低能量值、高耐受量、无副作用、糖尿病人可食用、非致龋齿性等优越特性，极其适合应用于功能性食品中。赤藓糖醇的制备方法分为化学合成法和微生物发酵法。化学合成法主要是用酸碱处理经高碘酸氧化过的淀粉或纤维素，高温高压下加氢还原获得，但产物中副产物较多，收率低，产物较难分离，难以实现工业化。相对于化学合成法制备赤藓糖醇，微生物发酵法生产过程温和易控制、环境污染少、产品安全，更具有生产优势。在微生物发酵法制备利用赤藓糖醇的工业化生产中，大部分是以淀粉或葡萄糖为原料，由酵母经发酵而成的。在公开号为cn101302551a的中国专利中公开了一种赤藓糖醇生产方法技术，以葡萄糖为原料，用解脂假丝酵母代替耐高渗酵母为发酵菌株发酵生产赤藓糖醇，虽然发酵周期缩短了，但是本发明中是经摇床培养及一级、二级种子扩大培养，其一级种子接种大，种子瓶一般需合并200个摇瓶，操作时间长，耗时耗力且染菌几率高。在公开号为cn103290068a的中国专利中介绍了一株耐高渗出芽短梗霉生产赤藓糖醇的方法技术，采用以木糖或木糖母液为主要碳源的发酵培养基发酵生产赤藓糖醇，但转化率很低，只有25%～42%。另一方面，在制备木糖醇的过程中会产生大量的木糖母液，每结晶分离1吨的木糖醇会产生0.8吨～1吨的木糖母液。木糖母液糖浓度在50％～60％，其中葡萄糖含12％～18％左右，木糖含40％～50％左右，阿拉伯糖含17％～23％，半乳糖含0～6％。因为杂糖含量高，木糖纯度低，难以将母液中的木糖结晶提纯。目前木糖母液一般以低价出售给焦糖色素厂，生产焦糖色素，母液中各种单糖尤其是木糖的价值没有得到充分利用，大大减少了生产效益。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于，提供一种赤藓糖醇的制备方法，以木糖母液为碳源，出芽短梗霉和毕赤酵母为菌种，直接通过发酵罐发酵方法制备赤藓糖醇。本发明是这样实现的，提供一种赤藓糖醇的制备方法，包括如下步骤：选取木糖母液作为碳源；以出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)cgmcc3.00837为出发菌株，将菌株进行斜面培养，然后再进行一级种子培养和二级种子培养，最后获得出芽短梗霉种子液；将毕赤酵母通过斜面培养方式得到的斜面菌种进行一级种子培养和二级种子培养后，获得毕赤酵母种子液；将已制备的出芽短梗霉种子液和毕赤酵母种子液分别接入装有混菌发酵培养基的发酵罐中进行混菌发酵培养，混菌发酵后即得到赤藓糖醇。进一步地，将出芽短梗霉菌株进行斜面培养时的斜面培养基成分包括：木糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l。进一步地，将斜面培养得到的出芽短梗霉斜面菌株进行一级种子培养和二级种子培养的步骤是：从活化斜面上挑取一环出芽短梗霉菌体接种至装有50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中培养，28℃~32℃、150r/min~250r/min的摇床培养8h~16h，得一级种子液；再将该一级种子液以8%~12%的接种量，接入二级种子培养基中，28℃~32℃、150r/min~250r/min的摇床培养10h~20h，得到二级种子液；其中，出芽短梗霉的一级、二级种子培养基组成分包括：木糖15g/l~30g/l，蛋白胨15g/l~25g/l，酵母浸粉10g/l~20g/l。进一步地，所述毕赤酵母进行斜面培养的斜面培养基成分包括：木糖母液200ml~300ml，酵母浸粉10g~30g，蛋白胨10g~30g，琼脂20g~40g，ph6.0~7.0。进一步地，将毕赤酵母的斜面菌种进行一级种子培养和二级种子培养的步骤是：将毕赤酵母的斜面菌种接入装有一级种子培养基的一级种子罐，接种量1%~2%，15h~25h后接入装有二级种子培养基的二级种子罐，接种量为8%~12%；其中，毕赤酵母的一级、二级种子培养基成分包括：木糖母液20g/l~35g/l，蛋白胨20g/l~35g/l，酵母浸粉10g/l~15g/l。进一步地，将出芽短梗霉种子液和毕赤酵母种子液分别接入发酵罐中进行混菌发酵培养的培养条件是：接种量10%~15%，发酵培养基装量50%~70%，在溶氧为60%~75%、温度28℃~32℃、ph值6.5~8的条件下培养95h~110h；其中，混菌发酵培养基组成分包括：木糖母液60g/l~100g/l、酵母浸粉5g/l~10g/l、蛋白胨5g/l~10g/l、琼脂30g/l~60g/l、柠檬酸2g/l~10g/l。进一步地，所述木糖母液为糖浓度50％～60％的木糖母液。与现有技术相比，本发明的赤藓糖醇的制备方法，通过以木糖母液为碳源，出芽短梗霉和毕赤酵母为发酵菌株混菌发酵制备赤藓糖醇，并通过发酵培养基和发酵条件优化，有效提高了以木糖母液为碳源时的赤藓糖醇产量。应用本发明可将木糖母液中的木糖和葡萄糖同时有效转化为赤藓糖醇，产量可达35g/l~42g/l，转化率达到40%以上。本发明为木糖母液的有效利用开辟了一条新途径，也为赤藓糖醇生产开发提供了新原料，可有效提高木糖母液生物转化过程的原料利用率。具体实施方式为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明赤藓糖醇的制备方法的较佳实施例，包括选取糖浓度为50％～60％的木糖母液；以出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)cgmcc3.00837为出发菌株，将菌株进行斜面培养，然后再进行一级种子培养和二级种子培养，最后获得出芽短梗霉种子液；将毕赤酵母通过斜面培养方式得到的斜面菌种全部接入含发酵培养基的发酵罐中培养，然后再进行一级种子培养和二级种子培养，最后获得毕赤酵母种子液；将已制备的出芽短梗霉种子液和毕赤酵母种子液分别接入装有混菌发酵培养基的发酵罐中进行混菌发酵培养，混菌发酵后即得到赤藓糖醇。具体地，所述赤藓糖醇的制备方法包括如下步骤：（1）、准备木糖母液：选取糖浓度为50％～60％的木糖母液作为碳源；其中在木糖母液中，葡萄糖含12～18％左右，木糖含40～50％左右，阿拉伯糖含17～23％，半乳糖含0～6％。（2）、出芽短梗霉种子液培养：以出芽短梗霉为出发菌株，将菌株进行斜面培养，然后从活化斜面上挑取一环菌体接种至装有50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中培养，28℃~30℃、150r/min~250r/min的摇床培养8h~16h，得一级种子液；再将该一级种子液以8%~12%的接种量，接入二级种子培养基中，28℃~32℃、150r/min~250r/min的摇床培养10h~20h，得到二级种子液；其中，出芽短梗霉的斜面培养基和一级、二级种子培养基组成分包括：木糖15g/l~30g/l，蛋白胨15g/l~25g/l，酵母浸粉10g/l~20g/l。（3）、毕赤酵母种子液培养：将毕赤酵母通过斜面培养方式得到的斜面菌种全部接入装有一级种子培养基的一级种子罐，接种量1%~2%，15h~25h后接入装有二级种子培养基的二级种子罐，接种量为8%~12%，培养获得毕赤酵母种子液；其中，毕赤酵母的斜面培养基成分包括：木糖母液200ml~300ml，酵母浸粉10g~30g，蛋白胨10g~30g，琼脂20g~40g，ph6.0~7.0；毕赤酵母的一级、二级种子培养基成分包括：木糖母液20g/l~35g/l，蛋白胨20g/l~35g/l，酵母浸粉10g/l~15g/l。（4）、发酵培养：将步骤（2）制备的出芽短梗霉种子液和步骤（3）制备的毕赤酵母种子液分别接入装有发酵培养基的发酵罐中进行混菌发酵培养，发酵后即得到赤藓糖醇；发酵罐培养条件为：接种量10%~15%，发酵培养基装量50%~70%，在溶氧为60%~75%、温度28℃~32℃、ph值6.5~8的条件下培养95h~110h；其中，发酵培养基组成分包括：木糖母液60g/l~100g/l、酵母浸粉5g/l~10g/l、蛋白胨5g/l~10g/l、琼脂30g/l~60g/l、柠檬酸2g/l~10g/l。下面通过具体实施例来进一步说明本发明的方法。实施例1本发明的第一种赤藓糖醇的制备方法，包括如下步骤：（11）、准备木糖母液：选取糖浓度为55％的木糖母液。（12）、出芽短梗霉种子液培养：以出芽短梗霉为出发菌株，将菌株进行斜面培养，然后从活化斜面上挑取一环菌体接种至装有50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中培养，30℃、180r/min的摇床培养12h，得一级种子液；再将该一级种子液以10%的接种量，接入二级种子培养基中，30℃、180r/min的摇床培养14h，得到二级种子液；其中，出芽短梗霉的斜面培养基和一级、二级种子培养基组成分包括：木糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l。（13）、毕赤酵母种子液培养：将毕赤酵母通过斜面培养方式得到的斜面菌种全部接入装有一级种子培养基的一级种子罐，接种量1%，20h后接入装有二级种子培养基的二级种子罐，接种量为10%，培养获得毕赤酵母种子液；其中，毕赤酵母的斜面培养基成分包括：木糖母液250ml，酵母浸粉20g，蛋白胨20g，琼脂30g，ph6.5；毕赤酵母的一级、二级种子培养基成分包括：木糖母液30g/l，蛋白胨28g/l，酵母浸粉13g/l。（14）、发酵培养：将步骤（12）制备的出芽短梗霉种子液和步骤（13）制备的毕赤酵母种子液分别接入装有发酵培养基的发酵罐中进行混菌发酵培养，发酵后即得到赤藓糖醇；发酵罐培养条件为：接种量12%，发酵培养基装量58%，在溶氧为65%、温度30℃、ph值7.0的条件下培养100h；其中，发酵培养基组成分包括：木糖母液80g/l、酵母浸粉7g/l、蛋白胨7g/l、琼脂45g/l、柠檬酸5g/l。发酵100h后测得赤藓糖醇浓度42g/l。实施例2本发明的第二种赤藓糖醇的制备方法，包括如下步骤：（21）、准备木糖母液：选取糖浓度为50％的木糖母液。（22）、出芽短梗霉种子液培养：以出芽短梗霉为出发菌株，将菌株进行斜面培养，然后从活化斜面上挑取一环菌体接种至装有50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中培养，28℃、150r/min的摇床培养8h，得一级种子液；再将该一级种子液以8%的接种量，接入二级种子培养基中，28℃、150r/min的摇床培养10h，得到二级种子液；其中，出芽短梗霉的斜面培养基和一级、二级种子培养基组成分包括：木糖15g/l，蛋白胨15g/l，酵母浸粉15g/l。（23）、毕赤酵母种子液培养：将毕赤酵母通过斜面培养方式得到的斜面菌种全部接入装有一级种子培养基的一级种子罐，接种量2%，25h后接入装有二级种子培养基的二级种子罐，接种量为12%，培养获得毕赤酵母种子液；其中，毕赤酵母的斜面培养基成分包括：木糖母液300ml，酵母浸粉30g，蛋白胨30g，琼脂40g，ph7.0；毕赤酵母的一级、二级种子培养基成分包括：木糖母液35g/l，蛋白胨35g/l，酵母浸粉15g/l。（24）、发酵培养：将步骤（22）制备的出芽短梗霉种子液和步骤（23）制备的毕赤酵母种子液分别接入装有发酵培养基的发酵罐中进行混菌发酵培养，发酵后即得到赤藓糖醇；发酵罐培养条件为：接种量10%，发酵培养基装量50%，在溶氧为60%、温度28℃、ph值6.5的条件下培养95h；其中，发酵培养基组成分包括：木糖母液100g/l、酵母浸粉10g/l、蛋白胨10g/l、琼脂60g/l、柠檬酸10g/l。发酵95h后测得赤藓糖醇浓度35g/l。实施例3本发明的第三种赤藓糖醇的制备方法，包括如下步骤：（31）、准备木糖母液：选取糖浓度为60％的木糖母液。（32）、出芽短梗霉种子液培养：以出芽短梗霉为出发菌株，将菌株进行斜面培养，然后从活化斜面上挑取一环菌体接种至装有50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中培养，29℃、250r/min的摇床培养16h，得一级种子液；再将该一级种子液以12%的接种量，接入二级种子培养基中，32℃、250r/min的摇床培养20h，得到二级种子液；其中，出芽短梗霉的斜面培养基和一级、二级种子培养基组成分包括：木糖30g/l，蛋白胨25g/l，酵母浸粉20g/l。（33）、毕赤酵母种子液培养：将毕赤酵母通过斜面培养方式得到的斜面菌种全部接入装有一级种子培养基的一级种子罐，接种量1.5%，15h后接入装有二级种子培养基的二级种子罐，接种量为8%，培养获得毕赤酵母种子液；其中，毕赤酵母的斜面培养基成分包括：木糖母液200ml，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，琼脂20g，ph6.0；毕赤酵母的一级、二级种子培养基成分包括：木糖母液20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l。（34）、发酵培养：将步骤（32）制备的出芽短梗霉种子液和步骤（33）制备的毕赤酵母种子液分别接入装有发酵培养基的发酵罐中进行混菌发酵培养，发酵后即得到赤藓糖醇；发酵罐培养条件为：接种量15%，发酵培养基装量70%，在溶氧为75%、温度32℃、ph值8的条件下培养110h；其中，发酵培养基组成分包括：木糖母液100g/l、酵母浸粉10g/l、蛋白胨10g/l、琼脂60g/l、柠檬酸10g/l。发酵110h后测得赤藓糖醇浓度38g/l。对比例1该对比例采用现有普通方式进行毕赤酵母种子液培养，与实施例1的方法不同，其他步骤和方法与实施例1一致。对比例1具体包括如下步骤：（1）、准备木糖母液：选取糖浓度为55％的木糖母液。（2）、出芽短梗霉种子液培养：以出芽短梗霉为出发菌株，将菌株进行斜面培养，然后从活化斜面上挑取一环菌体接种至装有50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中培养，30℃、180r/min的摇床培养12h，得一级种子液；再将该一级种子液以10%的接种量，接入二级种子培养基中，30℃、180r/min的摇床培养14h，得到二级种子液；其中，出芽短梗霉的斜面培养基和一级、二级种子培养基组成分包括：木糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l。（3）、毕赤酵母种子液培养：将毕赤酵母通过斜面培养方式得到的斜面菌种全部接入200个1000ml摇瓶中，每个摇瓶装液量为100ml，接入5ml菌液，30℃，180r/min培养24h后全部合并到一个种子瓶中，在将该种子瓶内的菌液全部接入一级种子罐，接种量为1%，20h后接入二级种子罐，接种量为10%。（4）、发酵培养：将步骤（2）制备的出芽短梗霉种子液和步骤（3）制备的毕赤酵母种子液分别接入装有发酵培养基的发酵罐中进行混菌发酵培养，接种量6%，发酵100h后测得赤藓糖醇浓度38g/l。发酵培养基装量58%，在溶氧为65%、温度30℃、ph值7.0的条件下培养；其中，发酵培养基组成分包括：木糖母液80g/l、酵母浸粉7g/l、蛋白胨7g/l、琼脂45g/l、柠檬酸5g/l。将上述两个实施例的实验数据制成下表：毕赤酵母种子液培养基扩培时间赤藓糖醇产量实施例115h42g/l对比例124h38g/l由上表可以看出，毕赤酵母种子液采用实施例1的接种方法，扩培时间为15h，赤藓糖醇产量达到42g/l；相比对比例1中的接种方法，实施例1的方法不仅节省了时间，而且赤藓糖醇的产量也高。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12