基因标志物在帕金森诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及基因标志物在帕金森诊断中的应用，具体地涉及基因标志物loc105374334。

背景技术：

帕金森病(parkinson'sdisease,pd)是最常见的慢性神经退行性运动障碍疾病之一，其发病率仅次于阿尔茨海默病。随着人口老龄化的加重及平均寿命的延长，pd患者的数量逐渐增加，这无疑将给家庭和社会带来沉重的负担。然而，pd的发病机制目前仍不明确。现有的药物、外科手术治疗虽可缓解症状，但并不能减缓甚至是阻止pd的进展，因此深入了解pd分子学发病机制不但有助于开拓新的治疗靶标，还有望发现早期诊断的敏感指标，对实现pd的早期发现、诊断、治疗均具有重要意义。

长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的rna，是近年来转录和表观遗传调控网络的另一重要发现。它虽然保守性较低，但其表达具有高度的组织、时空甚至是疾病特异性。目前根据lncrna与邻近蛋白编码基因的位置关系，将其分为5种类型：大基因间非编码rna(lincrna)、内含子非编码rna、反义非编码rna、假基因非编码rna以及增强子非编码rna，如此丰富的rna类型奠定了lncrna能以不同的调控模式调控一系列分子细胞功能的重要基础。随着对长链非编码rna的研究逐渐深入，人们发现1ncrna不仅是细胞生理功能、正常大脑发育、免疫炎症反应等的重要调控因子，也是各种疾病如癌症、神经退行性病变等发生发展的重要影响因素。目前，已有多项研究证实lncrna的异常表达与帕金森病的调控密切相关。例如，cn201810167670.0、cn201810168896.2利用测序，筛选出与帕金森相关的基因。lncrna能通过多种不同的机制(如介导下游信号、募集染色质重塑复合物等)在表观遗传、转录、转录后以及翻译各个水平全面调控基因表达。随着研究逐渐深入，越来越多的研究表明，lncrna调控网络的平衡是机体维持正常生理功能的重要保障。研究与帕金森相关的生物指标，有可能在将来为帕金森的风险提前预估提供一个新的生物指标，从而为帕金森的诊断和检测以及筛选出易感个体实现早期预防治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与帕金森相关的基因标志物及其应用，通过检测标志物的水平，可以在帕金森的早期进行预警，进行疾病的早期干预以及治疗，提高患者的生活质量，加强防护。

本发明提供了检测loc105374334的试剂在制备诊断帕金森的产品中的应用。

进一步，所述试剂包括：通过反转录pcr、实时定量pcr、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测样本中loc105374334基因表达水平的试剂。

进一步，所述用实时定量pcr检测loc105374334基因表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增loc105374334基因的引物。

进一步，所述特异性扩增loc105374334基因的引物序列如seqidno.1～2所示。

进一步，所述样本选自人外周血。

本发明提供了一种体外检测loc105374334表达水平的产品，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。

进一步，所述所述芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于loc105374334的部分或全部序列。

进一步，所述试剂盒包括特异性检测loc105374334的探针、基因芯片或引物。

进一步，检测loc105374334的引物序列如seqidno.1～2所示。

进一步，所述试剂盒还包括包含sybrgreen聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述sybrgreen聚合酶链式反应体系包含：pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。

进一步，所述检测试剂盒还包括使用说明书或标签。

本发明提供了loc105374334在构建诊断帕金森的计算模型中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了loc105374334的表达水平与帕金森相关，对于揭示帕金森的发病机理具有重要的意义。

本发明提供了一种诊断产品，通过检测血液中loc105374334的表达水平，实现帕金森的早期诊断，从而提高帕金森患者的生活质量。

附图说明

图1是利用qpcr检测loc105374334在帕金森患者中的表达情况图。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测帕金森患者、正常人血液中基因的表达水平，发现其中具有明显具有差异表达的基因，探讨其与帕金森的发生之间的关系，从而为帕金森的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了loc105374334在帕金森患者和正常人呈现显著性差异表达，为帕金森的诊断以及揭示帕金森的发病机理提供了新途径。

本发明中术语“基因标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“基因标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

loc105374334

转录loc105374334的基因位于2号染色体短臂2区3带上，本发明的loc105374334包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的转录loc105374334基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库genebank中loc105374334基因(xr_939853.2)所示。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的loc105374334使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将rna逆转录成dna。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板dna进行测序。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。其中，pcr需要在扩增前将rna逆转录成dna(rt-pcr)，tma和nasba直接扩增rna。

通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；tma的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝；lcr的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为nasba的基于核酸序列的扩增；使用rna复制酶(通常称为qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。dnaish可用于确定染色体的结构。rnaish用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mrna和其他转录本(例如，ncrna)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。

试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测loc105374334的表达水平。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的rna特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、rna分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。

在本发明中，参照样本是自表观健康个体的参照群提供的、用于体外评估目的的生物样本。如本发明所使用的，“参照水平”指在表观健康个体的参照群中建立的值。

本领域技术人员知道，在进行测量结果与参照浓度比较时，参照浓度可以使用阴性参照样本、阳性参照样本、或包括一种或超过一种这些类型对照的混合参照样本来测定。阴性参照样本优选会包括来自非帕金森的患者或其他。阳性参照样本优选会包括来自有诊断帕金森的受试者的样本。

表述“将测定得到的浓度与参照浓度比较”仅仅用于进一步例示对熟练技术人员显而易见的内容。在对照样本中建立参照浓度。对照样本可以是内部或外部对照样本。在一个实施方案中，使用内部对照样本，即在测试样本中以及在自同一受试者采集的一份或多份其它样本中评估标志物水平以确定所述标志物的水平是否存在任何变化。在另一个实施方案中，使用外部对照样本。对于外部对照样本，将自个体衍生的样本中标志物的存在或量与其在已知患有给定状况或已知有给定状况风险的个体或已知没有给定状况的个体(即“正常个体”)中的存在或量比较。例如，可以将患者样本中的标志物水平与已知与特定帕金森过程相关的水平比较。通常，直接或间接地将样本的标志物水平与诊断关联起来，而且例如使用标志物水平来确定个体是否有帕金森风险。或者，例如，可以将样本的标志物水平同已知与帕金森患者中对治疗的响应、帕金森的诊断、选择针对帕金森的适宜药物的指导、判断疾病进展风险、或跟踪帕金森患者相关的标志物水平比较。根据目的诊断用途，选择适宜的对照样本并在它们中为标志物建立对照或参照值。本领域技术人员知道，在一个实施方案中，自年龄匹配的且没有混淆疾病的参照群体获得此类对照样本。正如本领域技术人员清楚，在对照样本中建立的绝对标志物值会依赖于所使用的测定法。优选使用来自名表征较好的个体(来自适宜参照群体)的样本来建立对照(参照)值。健康个体代表用于建立对照值的一种优选参照群体。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选的，在数学上组合loc105374334和一种或多种其他标志物的测定水平，并将组合值与实际的诊断问题关联起来，可以通过任何适宜的现有技术生物信息学方法将标志物值与loc105374334的测定组合。

优选的，在标志物组合中应用的方法是一种对数函数。优选的，应用此方法的结果是单一值。根据实际的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于帕金森的风险或有助于评估帕金森患者(包括帕金森患者)的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有帕金森风险的个体、帕金森患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性dna重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。

术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如dna聚合酶并在合适温度和ph下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与帕金森相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集35例正常人和帕金森患者的血液样本，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。每组各取5例样本进行lncrna表达谱的检测分析，进行差异表达lncrna的筛选，并在各组全部35例样本中进行验证实验。

2、rna样品的制备及质量分析

使用invitrogen公司的reagent提取总rna，具体步骤详见说明书。利用nanodrop2000对所提取的rna浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

3、构建cdna文库

利用illumina的truseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建。

使用试剂盒去除核糖体rrna，向反应体系中加入fragmentationbuffer将rna打断成短片段，以mrna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cdna链，然后加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成第二条cdna链，在经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱之后做末端修复、加碱基a，连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，加ung酶消化cdna二链，最后进行pcr扩增，最后用琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，使用建好的文库上机测序。

4、上机测序

使用illuminahiseqx-ten/miseq测序平台，进行2*150bp测序，具体操作按说明书进行。

5、高通量转录组测序数据分析

用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；使用tophat将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，参考基因组版本是grch38.p7，使用cuffquant定量lncrna的表达量并标准化输出；在r环境下用deseq2包比较对照组跟疾病组lncrna的表达差异，筛选标准是p<0.05。

6、结果

rna-seq结果显示，loc105374334基因在帕金森患者血液中的表达量显著低于正常人的表达量。

实施例2qpcr测序验证loc105374334基因的差异表达

1、对loc105374334基因进行大样本qpcr验证。

2、rna提取

使用invitrogen公司的reagent提取总rna，具体步骤详见说明书。

3、逆转录

采用tiangen的fastqμantcdna第一链合成试剂盒进行反转录，具体操作详见说明书。

4、qpcr检测

4.1引物设计

根据编码loc105374334的基因和gapdh基因的序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

loc105374334：

正向引物为5’-ataggtctcgtattgtaat-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-ttaatccactggttatca-3’(seqidno.2)。

gapdh：

正向引物为5’-ctctggtaaagtggatattgt-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。

4.2qpcr扩增检验

采用tiangen公司的superrealpremixplus(sybrgreen)进行扩增，在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量；实验操作按详见说明书。

5、结果

结果如图1所示，与正常人血液相比，loc105374334在帕金森患者血液中的表达下调，差异具有统计学意义p<0.001，提示loc105374334可作为检测靶标应用于帕金森的诊断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>潘伟

<120>基因标志物在帕金森诊断中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ataggtctcgtattgtaat19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttaatccactggttatca18

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctctggtaaagtggatattgt21

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggtggaatcatattggaaca20