一种香蕉枯萎菌milRNA的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及香蕉枯萎菌milrna。

背景技术：

1、植物内源mirna在转录后以基因沉默的方式负调控靶标基因的表达，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用

真核生物的小rna主要分为micrornas(mirnas)、sirnas和pirnas。mirna和sirna长度约为20～25nt，均由类似rnaseiii的核酸内切酶dicer(或dicer类似蛋白)加工产生，它们的形成既有联系又有区别。sirna途径是由是外源入侵，如病毒，转座子以及转基因等产生变体dsrna引发的；而mirna途径由内源性hprna诱导。sirna和mirna都由dcls(或dicer类似蛋白)剪切形成，其中与mrna互补的链结合rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,risc)，以ptgs的方式作用序列同源的mrna，通过mrna剪切、翻译抑制或者甲基化等方式调控基因的表达。pirna依赖piwi蛋白加工成熟，仅存在动物细胞。

植物内源mirna是由ⅲ型rnase核酸酶dicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生一类21-24nt长度的小分子非编码rna，通过转录后水平以mrna剪切或翻译抑制的方式沉默序列同源的mrna靶标基因。mirna基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。已经有大量的报道证实植物内源mirnas参与植物对病原菌的pti和eti免疫，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用。

2、真菌中存在与植物mirna在结构、长度、作用方式上类似的小rnas(microrna-likernas，milrnas)。

milrnas最早在粗糙脉孢霉(neurosporacrassa)中发现的，与植物microrna在结构、小rna长度以及作用方式上非常相似，因为与植物的mirna类似而命名microrna-likes(milrnas)。粗糙脉孢霉的milrnas通过dicers，qde-2，核酸外切酶活性的qip效应蛋白以及具有iii型rnase功能域的线粒体核糖体大亚基mrpl3蛋白(mitochondrialribosomalproteinlargesubunit,mrpl3)的不同组合，产生有四种不同的生物形成途径。虽然四种途径中从基因间隔区转录的rna前体序列长度各异，但都具有发卡结构，形成的milrnas具有5'末端u的偏好性，能够特异与argonaute(ago)蛋白结合；此外，实验证明milr-1可以通过基因沉默的方式作用调靶标序列(ncu07311)mrna，主要通过抑制mrna翻译的方式进行，与植物microrna通过mrna剪切和抑制转录的方式不一致(leeetal.,2010)。milr-1是构巢曲霉中丰度最高的mirna-likernas，xueetal.(2012)以milr-1为研究对象构建了依赖ago的milr-1离体生物形成的生物化学研究框架，研究表明milr-1的加工成熟过程可以分为5个步骤，与植物microrna的生物合成途径不一样的是，除了qde-2，dicer等核心蛋白组分外，还需要qip以及rna外来复合体(exosome)的共同参与，加工成为成熟的小rna(xueetal.,2012)。

随后，植物病原真菌的小rna相关研究进展迅速，在稻瘟病(magnaportheoryzae)(nunesetal.,2011)油菜核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)(zhouetal.,2012)葡萄灰霉菌(botrytiscinerea)(weibergetal.,2013；wangetal.,2017a)疫霉(phytophthora)(fahlgrenetal.,2013)尖孢镰刀菌番茄专化型(fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)(chenetal.,2014)黄曲霉(aspergillusflavus)(baietal.,2015)小麦条锈(pucciniastriiformisf.sp.tritici)(muethetal.,2015；wangetal.,2017b)中陆续都发现存在milrnas。随着技术的进步，深度测序可以预测到低丰度milrna及其骨架序列的存在，但是由于病原真菌中大部分的milrnas表达本底水平太低，常规的同位素³²p-atp标记的mirna探针无法检测到低丰度的milrnas，因此，无法对低丰度的milrnas及其发夹序列进行验证。

3、植物病原真菌与寄主之间存在跨界小rna基因沉默，抑制寄主的免疫反应促进病原菌的侵染。

病原真菌利用小rna作为效应因子(effector)进入植物细胞内部抑制植物免疫防卫反应。灰霉菌引发的灰霉病可以侵染200多种植物。weibergetal.(2013)的研究显示灰霉菌能够输送bc-srnas进入寄主细胞通过与ago1特异性结合抑制ago1功能，沉默寄主的免疫相关基因促进病原菌侵染。拟南芥的δago1缺失突变体由于丧失了ago1功能，减少了对灰霉菌的敏感性；相反，灰霉菌的δdcl1dcl2双突变体由于无法加工产生bc-srnas而完全丧失了侵染性。因此，真菌病原物通过转移具有致病力的小rna效应因子进入寄主细胞通过抑制寄主的防卫反应促进病原菌的侵染，该发现阐释了这种自然发生的跨界rnai沉默现象作为病原真菌的一种更加高级的致病机制(weibergetal.,2013)。此外，在葡萄灰霉菌(botrytiscinerea)中还发现一个低丰度表达的bc-sir37，仅侵染时上调表达，而bc-sir37的3个确定的作用靶标都是寄主免疫相关的(wangetal.,2017)。bc-dcl1和dcl2是产生bc-srnas的主要组分，沉默dcls可以显著减少病原菌的致病力。病原菌存在环境rnai可以吸收外部的rna，在水果、蔬菜以及鲜花的表面施用靶向dcls的dsrna和srna可以通过调控bc-srnas表达从而明显减轻灰霉病的症状(wangetal.,2016；wangetal.,2017a)。

小rna是病原真菌一类重要的致病因子。小麦条锈病编码的pst-milr1仅仅在侵染时诱导表达，在pst中通过bsmv基因沉默抑制pst-milr1的表达明显减弱了条锈病的致病性，同时，在小麦中敲除其靶标小麦病程相关基因pr2(sm638)则增强了小麦对无毒菌株的感病性，正反实验证实pst-milr1以跨界基因沉默方式靶向寄主免疫相关基因pr2(sm638)从而抑制寄主的免疫反应促进病原菌侵染(wangetal.,2017b)。

4、香蕉枯萎菌的研究

香蕉枯萎病(fusariumoxysporumf.sp.cubense,foc)是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害，其病菌腐生能力很强,在土壤中可长期存活，属于典型的潜伏型侵染。早期外部症状表现不明显，中后期才表现症状，因此，给香蕉产业和香蕉种植者造成巨大的经济损失。世界植蕉区已发现其有4个生理小种(还可能存在其它小种)，其中生理小种1号侵染粉蕉(abb组)、龙牙蕉(aab组)类及部分aaa组品种；生理小种2号只侵染杂交三倍体棱香蕉(abb)，对香蕉栽培品种的危害较小；生理小种3号侵染野生的羯尾蕉属，对香蕉栽培品种不造成危害，在许多地区均有报道；生理小种4号侵染香牙蕉、龙牙蕉、大蕉，其寄主范围大于生理小种1号。4号生理小种又分为亚热带4号(subtropicalrace4,sr4)和热带4号小种(tropicalrace4,tr4)，在我国主要是1号和4号生理小种，其中热带4号小种危害最严重。

目前，香蕉没有有效的抗性种质资源，生产上没有有效的化学防治方法，因此，培育抗性品系是解决香蕉枯萎病的根本途径之一。小rna在介导病原物-寄主相互作用过程中发挥着重要的作用，具有提升植物抗病害能力的巨大潜力。香蕉枯萎菌是否编码小rna，是否利用小rna促进侵染等相关研究目前均没有文献报道，为此，我们开展了香蕉枯萎菌内源小rna鉴定及检测验证工作。

技术实现要素：

针对以上现有技术的不足之处，本发明提供了一种香蕉枯萎菌milrna。

本发明采取的技术方案如下：

一种香蕉枯萎菌milrna，所述香蕉枯萎菌milrna的基因序列如seqidno:1所示。

本发明还涉及一种载体，所述载体含有权利要求1所述的milrna。

本发明还涉及一种感受态细胞，所述感受态细胞含有如权利要求1所述的milrna或含有权利要求2所述的载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

通过深度测序获得了香蕉枯萎菌milrna，为后续进一步开发、利用小rna在香蕉枯萎菌中的作用机制提供前期工作铺垫。

附图说明

图1：小rna测序结果统计图；

图中，(a)四个小rna文库中小rna的长度统计结果；(b)四个小rna数据库小rna序列的venn图；(c)获得的小rna5末端碱基偏好性分析结果；(d)四个小rna数据库中正链、负链来源的小rna统计；

图2：高丰度milrnas的同位素³²p-atp标记的反向互补dna探针杂交结果；

图中，-：孢子；+：菌丝；m：混合样品，*：表示milrna的伴随链小rna；

图3：农杆菌浸润本生烟体外瞬时表达分析验证低丰度milrnas结果；

图中，(a)香蕉枯萎菌foc中含有21nt、5'-u结构特征候选milrnas本生烟农杆菌浸润后，对应的³²p-atp标记的dna探针杂交检测结果；(b)香蕉枯萎菌foc中其他不同长度、不同5'末端碱基的milrna本生烟农杆菌浸润后，对应的³²p-atp标记的dna探针杂交检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例中涉及到的主要试剂：

trizol(trnzolreagent,tiangen,cat#dp405-02)

peg8000沉淀缓冲液：20％(w/v)peg8000，1mnacl。

edc交联缓冲液(12ml)：122.5μl12.5m1-甲基咪唑(ph8.0)，0.373g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)。

mirnanorthernblotting杂交缓冲液：5×ssc，20mmnahpo4(ph7.2)，7％sds，3×denhardt`s溶液。

17％dpage：尿素12.6g，水1.25ml，10×tbe1.5ml，acr/bis(30％)17ml，在微波炉或者热水中溶解尿素，待冷却后加入240μl10％ap，混匀后再加入10μltemed。

washingbuffer：2×ssc，0.1％sds。

1mmes(ph5.6，10ml)：称取2.132gmes溶于无菌水中，用koh调ph至5.6，定容至10ml，过滤除菌，分装到离心管中，-20℃保存。

100mmas(10ml)：称取0.1962gas溶于dmso，定容至10ml，分装到1.5ml离心管中，-20℃保存。

实施例1：小rna测序及生物信息学分析

分别构建foc1，foc4的菌丝和孢子的小rna文库，送北京华大基因测序，测序获得的数据如图1和表1所示。

表1小rna测序数据一览表

经过生物信息学分析，鉴定得88个具有完整发夹(stem-loopstructure)并且两端均产生小rna的milrnas，(见表2，表2给出了其中一个milrna，命名为milrna8，以及milrna8的伴随链小rna)。

表2foc测序获得的mirna-likes(milrnas)一览表

实施例2：高丰度milrnas的杂交检测

1、小rna的提取：

1.1样品的获取

菌株pda接种后28℃培养5-7天，用打孔器在pda平板的边缘打菌饼(直径0.5cm)，挑取5-6块菌饼接入装有100mlpdb培养液的250ml三角瓶中，于28℃、180rpm震荡培养5-7d后用三层滤纸过滤，分别获得孢子和菌丝进行后续的小rna提取。

1.2、trizol抽提

液氮保护下，将步骤1.1获得的样品研磨成粉后转入离心管，加入等体积的trizol试剂，充分涡旋后室温放置5-10min。加入1/5体积的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋后冰上静置3-5min，待自动分层后离心，12000g、4℃条件下离心10min。

1.3、分级沉淀高分子量rna

离心后，上清转入新的离心管，然后加入等体积的65℃孵育的peg8000沉淀缓冲液，颠倒混匀后室温静置直至冷却到室温，然后冰浴30-45min后离心10min沉淀高分子量rna。

1.4、沉淀小rna

离心后的上清液加入1/10体积的3mnaac(ph5.2)和等体积的预冷的异丙醇，-20℃沉淀1-2hr，12000g、4℃离心20min，沉淀用80％的乙醇洗涤1-2次，depc水溶解后放入-80℃备用。

2、小rna的杂交检测：

2.1、17％dpage分离

将步骤1提取的小rna溶入等体积的milrnasloadingbuffer(abi,cat.am8547)，100℃变性5min后，立即冰浴5min使rna样品完全变性。变性后的milrnas样品在17％dpage上样，0.5×tbe电泳缓冲液，300v电泳3-6h即可。

2.2、转膜及交联

将含有rna的凝胶切下，先在1×tbe转膜缓冲液中浸润30s，同时准备好nx中性电荷的尼龙膜(ge)和转膜滤纸，按照说明进行转膜。从上到下的顺序依次是：滤纸-凝胶-nx尼龙膜-滤纸。赶走气泡后用gete77pwr半干转膜仪进行转膜，用400ma转膜1h即可。转完膜后将膜放在edc交联缓冲液浸润的滤纸上，转膜时接触rna的一面朝上，避免交联缓冲液浸到rna上，60℃烘烤2h后，清水冲洗膜上残留的edc交联缓冲液，-20℃保存备用。

2.3、小rna杂交

mirna杂交采用mirnanorthernblotting杂交缓冲液，或者是公司的hybridizationbuffer(cat#am8663)杂交缓冲液。将交联后的膜放入杂交管，接触rna的一面朝内接触杂交缓冲液，加入采用³²p-atp标记的与小rna序列反向互补的dna探针40-42℃先预杂交1hr，然后37℃杂交过夜。

2.4曝光及信号检测

杂交结束后倒掉带有同位素的杂交液，用washingbuffer洗膜2次，每次15-20min。洗完后用monitor检测信号，阳性区域的信号应比膜边缘地方的信号强，并且将信号控制在5μci以内，如果信号过强，继续洗膜。洗完膜后将膜加载保鲜膜或者拉伸膜上，放在磷屏中曝光30min-3h左右，放入typoon扫描保存图片。结果见图2。

实施例3：低丰度milrnas的本生烟体外农杆菌介导的基因瞬时表达

1、本生烟的准备

本生烟种子保存在中国热带农业科学院环境与植物保护研究所实验室中，本生烟(n.benthamiana)于23-25℃，14h光照/10h黑暗(大约75μmol/m2.s)的光周期进行生长，6-8片叶时进行农杆菌浸润。浸润48-72hr后，用剪刀剪除没有被农杆菌菌液浸润的区域，采取后立即冻入液氮，-80℃保存直到使用。

2、候选milrna表达载体构建

根据生物信息学的预测，在foc的基因组dna中设计引物扩增含有候选milrna骨架的dna序列，连接到t-vector上测序后与参考基因组序列进行对比，确定扩增的序列不含有编码区和外显子区域，然后通过xbai-kpni或者xbai-saci连接到表达载体psuper1300(pcambia1300的改良载体)上，酶切验证或者pcr验证序列的正确性。详细信息见表3。

3、农杆菌浸润本生烟

(1)将构建好的克隆用电击转化的方法导入农杆菌感受态细胞，涂布于附加相应抗生素的lb固体平板上，28℃暗培养两天。

(2)待lb平板上长出菌落后挑取单菌落，接种到2ml附加相应抗生素的lb液体培养基中，28℃、250rpm振荡培养24hr。

(3)将2ml菌液接种到20ml附加相应抗生素的lb液体培养基中，加入200μl1mmes(ph5.6)和8μl100mmas，28℃、250rpm振荡培养12hr。

(4)将菌液于4000rpm，离心15min，用10mmmgcl2悬浮菌体沉淀，调节od600＝1.0。

(5)加入100mmas，所加体积与用mgcl2悬浮后的菌液体积关系为：vas(μl)＝vmgcl2(ml)×2，振荡混匀，室温静置不少于3hr。

(6)植物材料的准备：注射前一天应将植物置于弱光下，并浇足水，使植物更适于注射。

(7)注射时用白色枪头在叶片上扎数个小孔(注意不要将叶片撕裂)，然后用去掉针头的一次性2ml注射器吸取菌液，一个手食指抵住叶背小孔处，另一只手用注射器抵住叶面小孔，轻推注射器活塞使菌液沿小孔注入叶片。

(8)注射后将植物置于弱光条件下培养一天，然后放于光下正常培养，2-3天后取样。

4、小rna的检测。

发明人针对milrna8进行了本生烟农杆菌浸润体外验证分析(结果见图3-b)，所采用的dna序列是从foc基因组dna上扩增而来，具体的序列信息见表2和表3，结果显示，可以加工成为成熟的milrna。

表3候选milrna瞬时表达所用的序列一览表

注：单下划线表示的序列是正向引物序列，波浪线表示的是反向引物序列，双下划线表示的是预测的milrna的骨架(precursor)序列。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120>一种香蕉枯萎菌milrna

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna/rna

<213>香蕉枯萎菌(fusariumoxysporum)

<400>1

gctgtgttgcggtggtaggt20

<210>2

<211>21

<212>dna/rna

<213>香蕉枯萎菌(fusariumoxysporum)

<400>2

ctaccgcatgcacctcggcag21

<210>3

<211>667

<212>dna/rna

<213>香蕉枯萎菌(fusariumoxysporum)

<400>3

ccaggagagtatcgggaaaacgaagagagggttggtgagacgaattaatggatcaacatc60

atctaatgaccacatcgagggatgccacgaaacgggcgcatagttatatttcccactttt120

tctttttgagatcacggaggcagcaggatgggagatggatggtaatggagttcaactggg180

agtggttggacctcactgtcgcttttgtatcaaacatgccggcgttccgagggagtccga240

actatacggactaatatctgctgtgttgcggtggtaggttgccgagtcggacaacataca300

gccatacaatcacatgcgtgtacgaatcgtgcacacatgcatatggttggcttgtcgtgt360

caacattgggagccaagagagcttcattcaaatgaggcagtcgaaatgtctttcgacgaa420

ctcgtcaagccattttggaaaagggggttcctcacttatatgtgcaacactctcgctggc480

ctcaaatcaacctaccgcatgcacctcggcagtacaccatctccctcgggccatgtattc540

aagcacctatatcttcttgtacaatcacgcttgccactatctatttcgaacacacttaat600

aatactaccaccttgacgctcgctacctctaccccccgacccgcgtgctattcacactcc660

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