本发明涉及一种基于短串联重复计算混合样本嵌合比例的方法及系统。
背景技术：
在利用二代测序技术(ngs)进行胎儿染色体异常的检测案例中，胎儿样本中混有母源的样本时有发生，特别是流产组织样本极易受到母源的污染。这种情况下，信息分析人员很难判定个该样本的真实情况是染色体嵌合还是有母源污染，且样本浓度比例较复杂等问题，使检验结果的分析常存在不确定性。因此迫切需要一种能够鉴别污染、计算嵌合比例的系统以及方法来作为辅助手段，以协助ngs做出正确的判断。
此外，在对流产组织进行检测时往往需要判断该流产组织是否混有母源污染，如果判断该流产组织混有母源污染则会影响对流产组织的结果评估的可靠性。
str(短串联重复(shorttandemrepeats))作为一种成熟的一代测序技术在亲子鉴定领域得到广泛应用，str片段分析的基本原理是同一个体的str基因型一半来自父亲，一半来自母亲。即在每一处str，子代的一个等位基因型遗传自父亲，另一个等位基因型遗传自母亲。除同卵双生外，每个人或生物包含的dna序列是不同的，独一无二的。基于str的检测原理是利用荧光标记的引物在pcr扩增str基因座时，使pcr产物的一条链带上荧光标记。这种带有荧光分子的dna片段在凝胶中从阴极端的激光扫描仪的扫描窗口，荧光染料受到激发，发出一定波长的光，按荧光强度记录下来，每一个带荧光染料的dna片段电泳轨迹按各自通过激光扫描窗口的实际时间记录下来，以荧光吸收峰来表示每一个片段。峰值越高，表示该片段量越多；峰越早出现，片段越小。因此可以利用该原理根据不同大小片段的峰值高低和不同位点峰数量来判定样本是否为混合样本。
同时，可以利用amelogenin基因的峰值高低或峰面积比值确定样本混合或嵌合比例。
参考文献
非专利文献
gillp,sparker,pinchinr,etal.interpretingsipmlestrmixturesusingallelepeakareas.forensicscienceinternational,1998,91:41
prinzm,bollk,baum,etal.multiplexingofychromosomespecificstrsandperformanceforminxedsamples.forensicsicienceinte,trnational,1997,85:209
郑秀芬，纪贵金，刘超等，二组分混合dna样本str图谱解释，中国法医学杂志，2000,15,4,：203-207
技术实现要素：
混合样本嵌合比例计算问题在ngs以及在判断流产组织是否受到母源污染的过程中是经常出现的问题，由于技术偏好性问题不仅耗时长，而且很难分辨出样本的真实来源与所占比例。
利用本发明的基于amelogenin基因的分析系统可以简便快速的得到样本的混合情况。利用本发明可以解决以下问题：确定混合样本中的各组分的大体比例；根据标准品等位基因的峰面积比来制作标准曲线，然后拟合出回归方程，将待测样本等位基因的峰面积比代入该回归方程，即可得到组分的比例。
如上所述，本发明涉及如下内容：
1.一种基于短串联重复计算混合样本嵌合比例的方法，其包括：
基于短串联重复来判断待测样品是否存在样本嵌合；以及
在判断存在样本嵌合后，基于amelogenin基因来计算待测样品的嵌合比例。
2.根据项1所述的方法，其中，基于短串联重复来判断待测样品是否存在样本嵌合的步骤包括：
利用用于扩增所述短串联重复的带荧光的引物进行所述待测样品的pcr扩增，基于pcr扩增的结果来判断是否存在嵌合。
3.根据项1或2所述的方法，其中，基于短串联重复来计算待测样品的嵌合比例的步骤包括：
利用用于扩增所述amelogenin基因的带荧光的引物进行所述待测样品的pcr扩增，从而获取针对所述待测样品的给定数据来计算所述待测样品的嵌合比例。
4.根据项2或3所述的方法，其中，基于pcr扩增的结果来判断是否存在嵌合具体为：若同一基因座出现等位基因的数目为3个以上，则待测样品是两个以上个体的混合样本。
5.根据项2或3所述的方法，其中，基于pcr扩增的结果来判断是否存在嵌合包括：
若同一基因座出现等位基因的数目为3、4，则待测样品是2个个体的混合样品；
若同一基因座出现等位基因的数目为5、6，则待测样品是3个个体的混合样品；
若同一基因座出现等位基因的数目大于6，则待测样品是3个或3个以上个体的混合样品。
通常一个样本同一基因座出现等位基因的数目为1或2。
6.根据项3或4所述的方法，其中，所述给定数据为来自所述待测样品的通过pcr扩增得到的条带并通过毛细管电泳荧光定量法获得的电泳条带的峰面积之比。
7.根据项1～6中任一项所述的方法，其还包括：
dna提取及浓度控制，从待测样品获得来自待测样品的dna，控制使提取的dna的浓度在2ng/μl以上。
8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，
所述短串联重复序列位点选自以下任意三个或三个以上：d21s11，d13s317，d8s1179，d18s51，d5s818，vwa，pentae，d7s820，tpox，d3s1358，d16s539，fga，th01，csfipo和pentad。
9.根据项1～7中任一项所述的方法，其还包括：制作标准曲线，制作一系列按照给定混合比例混合的标准品混合样品，利用用于扩增amelogenin基因的带荧光的引物进行标准品混合样品的pcr扩增，并获取针对制备的标准品混合样品的给定数据来制作标准曲线；
计算结果，利用标准曲线以及所述待测样品的给定数据来计算所述待测样品的嵌合比例。
10.根据项8所述的方法，其中，所述标准品混合样品是利用来自男性和女性的基因组dna样品按照给定的比例进行混合来制作的。
11.一种计算混合样本嵌合比例的系统，其包括：
基于短串联重复来判断待测样品是否存在样本嵌合的模块，以及
基于amelogenin基因来计算待测样品的嵌合比例的模块。
12.根据项11所述的系统，其中，基于amelogenin基因来计算待测样品的嵌合比例的模块包括：利用用于扩增该amelogenin基因的带荧光的引物进行所述待测样品的pcr扩增，从而获取针对所述待测样品的给定数据来计算所述待测样品的嵌合比例。
13.根据项12所述的系统，其中，所述给定数据为来自所述待测样品的通过pcr扩增得到的条带并通过毛细管电泳荧光定量法获得的电泳条带的峰面积之比。
14.根据项11～13中任一项所述的系统，其还包括：
dna提取及浓度控制模块，从待测样品获得来自待测样品的dna，控制使提取的dna的浓度在2ng/μl以上。
15.根据项11～14中任一项所述的系统，其还包括：
标准曲线制作模块，制作一系列按照给定混合比例混合的标准品混合样品，利用用于扩增该amelogenin基因的带荧光的引物进行标准品混合样品的pcr扩增，并获取针对准备的标准品混合样品的给定数据来制作标准曲线；
结果计算模块，利用标准曲线以及所述待测样品的给定数据来计算所述待测样品的嵌合比例。
16.根据项15所述的系统，其中，所述标准品混合样品是利用来自男性和女性的基因组dna样品按照给定的比例进行混合来制作的。
发明的效果
利用str计算嵌合比例的方法和系统有以下几点好处：该方法和系统耗时短，在24h内可以出具嵌合比例的结果。该技术通过测定等位基因的对应的峰面积，发现峰面积比与混合样本组分比例有密切的关系，不同比例混合的样本会出现峰面积的不平衡，计算混合样本等位基因峰面积比值，发现峰面积的比值近似样本混合比例，因此可以由峰面积比推测样本的混合比例。
具体实施方式
本发明的实验步骤如下。
第一步：从待测样品获得来自待测样品的dna。
第二步：控制提取的dna的浓度，使得提取的dna的浓度在2ng/μl以上。
第三步：标准品混合样本的制作步骤。
第四步：pcr扩增步骤。
第五步：结果计算步骤。
在第一步dna的提取步骤中，对于待测样品提取dna的方法没有特别的限定，可以采用任何本领域技术人员已知的dna提取方法，根据裂解方式的不同，可以分成机械法、物理法、以及化学法。机械法例如有匀浆法、捣碎法、研磨法；物理法例如有超声法、反复冻融法、冷热交替法、低渗裂法；化学法例如有利用有机溶剂的方法、利用去垢剂的方法以及利用酶解的方法。根据核酸分离纯化的方式的不同可以分为吸附材料结合法、浓盐法、有机溶剂抽提法、以及密度梯度离心法。
在本发明的一个具体实施方式中，待测样品例如为羊水或流产组织。
在本发明一个具体实施方式中采用了如下方法，其中裂解采用了酶解的方法，而分离利用了吸附材料进行分离。当然本领域技术人员可以根据自己的需要采用其他合适的dna提取方法。
在第二步中，可以首先采用检测dna浓度的手段来检测提取的dna的浓度，如果检测结果显示已经满足在2ng/μl以上，则可以直接用于后续步骤，如果不满足上述条件则需要对该样品进行处理以满足上述浓度要求。例如如果样品的浓度过高则可以对其进行稀释，如果样品的浓度过低则需要对样品进行浓缩。
在第三步中，将来自于混合样本组分的标准dna样品(标准品)进行混合。将两种不同来源的标准品(例如，来源于男性或女性的基因组dna)进行混合时可以根据需要检测的范围来进行混合，通常例如按照1:1，2:1，4:1，6:1，8:1，10:1来进行混合。
在第四步中，对在第三步中按照不同比例混合的标准品dna和第一步提取的dna分别进行带荧光标记的引物的pcr扩增。对于pcr的扩增通常可以根据待扩增的目标基因(即短串联重复)来设定扩增程序进行扩增。
在本发明的一个具体的实施方式中，用于计算嵌合比例的目标基因为amelogenin，即牙釉蛋白基因，其x染色体amelogenin基因(牙釉质蛋白基因)内含子l区中6bp缺失的特性设计引物，扩增x染色体特异性片段(amelx)长度为106bp，与其同源的y染色体特异性片段(amely)为112bp。
在第五步中，利用第四步pcr的结果，利用不同浓度下标准品的比例关系制作标准曲线，拟合回归方程，再将待测样本能区分出污染情况的峰面积比带入该回归方程进行计算，可以得到待测样本的混合比例。
利用本发明的方法，制备不同混合比例的混合样本进行dna分型检验，通过对结果的分析，精确计算混合样本各组分含量。
利用正常男性和女性样本的性染色体上amelogenin基因座的同源性，单一男性样本该基因座的等位基因峰面积比约为1，而女性和男性dna按照1：1混合后的检测到比例约为2：1，按照2：1混合后的检测到比例约为3：1，按照4：1混合后的检测到比例约为5：1，按照6：1混合后的检测到比例约为7：1，按照8：1混合后的检测到比例约为9：1，按照10：1混合后很难检测到女性特征片段，因此拟合5个比例的标准曲线并得到回归方程，将待测样本特征峰面积比带入方程计算，可以得出混合样本组分比为显然更接近于样本中混合组分的真实比例。
实施例
第一步：dna的提取
提取试剂盒：血液/组织/细胞基因组dna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)
按照该试剂盒的说明书，使用前请先在该试剂盒的缓冲液gd和漂洗液pw中加入无水乙醇。
a.将羊水转移到1.5ml离心管，12000rpm离心2分钟，用200μlga将沉淀重悬混匀，进行下一步；实验具体步骤如下：
b.加入20μlproteinasek溶液，混匀；
c.加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以除去管盖内壁的水珠(一般加入缓冲液gb会产生白色沉淀，70℃放置时会消失)；
d.加入200μl无水乙醇，充分震荡混匀15sec，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以除去管盖内壁的水珠；
e.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱cb3中，12000rpm(13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
f.向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm(13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
g.向吸附柱cb3中加入600μl缓冲液pw(使用前先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm(13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
h.重复操作步骤g；
i.将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm(13400×g)离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
j.将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液te(可根据实际需求选择eb或者水)，室温放置2-5min，12000rpm(13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；
k.将离心管中收集的溶液再次悬空滴加到吸附膜的中间部位，室温放置2-5min，12000rpm(13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，置于-20℃保存。
第二步：控制提取的dna的浓度
使用qubit2.0br定量提取组织的dna浓度，检测结果显示浓度为12.9ng/μl，在进行pcr之前，将样品稀释至2ng/μl。
第三步：标准品混合样本的制备
将两组标准品dna，即购买自promega的2800m和k562分别用qubit3.0hs定量，然后稀释至2ng/μl,按照两组标准品的混合比例为1：1，2：1，4：1，6：1，8：1，10：1来进行混合，然后用于下一步的pcr扩增步骤。
第四步：pcr扩增
采用
pcr的程序为：在96℃，2分钟，ramp设置为4(表示降温速度4℃/s)，然后进行10个以下的循环：94℃，30秒钟，ramp设置为4，60℃，30秒钟，ramp设置为0.6(表示降温速度0.6℃/s)，72℃，45秒钟，ramp设置为0.3(表示降温速度0.3℃/s)，然后进行22个以下的循环：90℃，30秒钟，ramp设置为4(表示降温速度4℃/s)，60℃，30秒钟，ramp设置为0.6(表示降温速度0.6℃/s)，72℃，45秒钟，ramp设置为0.3(表示降温速度0.3℃/s)，然后保持在60℃，20分钟，ramp设置为4(表示降温速度4℃/s)，最后保持在4℃。
pcr产物避光-20摄氏度保存，外送检测时要保持4℃。
第五步：计算步骤
利用不同浓度下k562基因组dna和2800m基因组dna混合样本标准品x\y染色体的比例关系制作标准曲线，拟合回归方程，再将待测样本能区分出污染情况的峰面积比带入方程计算，可以得到待测样本的混合比例。
表2给出了标准品在pcr扩增中检测到的峰面积比，该峰面积比是通过对在pcr扩增中得到的条带进行毛细管电泳荧光定量，然后使用genemarker软件分析电泳条带的峰面积，并分析吸收峰的峰面积之比而求算出的。根据表2中给出的数据可以将浓度比与峰面积比进行拟合，获得混合比例与峰面积比的标准曲线。
表2k562和2800m混合样本组分比与峰面积比
表3待测混合样本组分比与峰面积比
根据表2的数据拟合标准曲线，并得到回归方程y＝1.082x-1.038(r2＝0.996)，其中，y表示峰面积比，x表示混合比例。将待测样本该基因座的峰面积比2.175582带入方程计算，可以得出混合样本组分比为1.30994，结果为56.7％，与ngs检出比例较为相近。