从植物种子分离线粒体的高通量方法与流程
本公开的主题涉及从完整种子中分离亚细胞器，特别是线粒体的方法。分离的细胞器可以进一步加工以分离细胞器dna，可以对所述细胞器dna进行下游分析，包括实时pcr、定量pcr、snp发现和检测以及基因分型。
背景技术：
植物的杂种优势(也称为杂种优势)是现代植物育种的主要目标。育种者将各种单株植物杂交，希望获得与任一亲本相比具有改进的特征的子代杂种植物，即杂种优势。这些杂种优势特征包括增加的产量、增加的繁殖能力、增加的大小、更早的开花和成熟、对疾病和有害生物的更大抗性、更快的生长速度等。然而，植物能够自体受精，这导致了子代近交植物在基因上与亲本植物相同。这种现象减少了可以成功地筛选杂种优势的子代杂种植物的总数。
为了减少自体受精的频率(并增加异体受精事件的数量)，育种者为自体受精创造了物理障碍。例如，育种者可以将亲本植物种植在不同的地块中，并将花粉从一株植物手动携带到另一株植物中。在另一替代方案中，将雄性生殖器官物理移除或化学地赋予惰性，以防止自体受精事件。一种替代方案是使用细胞质雄性不育(“cms”)系统。参见，例如，美国专利号3,842,538(1974年10月22日发布)，其全部内容通过引用结合在此。
简而言之，使用cms育种系统可防止发生频繁的自体受精事件。cms育种系统需要三个系：母系、父系和保持系。母系在细胞质上是雄性不育的，由所述系的线粒体突变赋予。在典型的支持cms的育种计划中，母系需要通过与保持系杂交来进行世代维持，所述保持系不是细胞质雄性不育的，而是对于恢复基因而言是纯合隐性的。这种杂交产生了包含母系线粒体的下一代植物，赋予了细胞质雄性不育性。当育种者准备创建杂种系时，将父系与母系杂交。父系对于恢复基因至少是杂合显性的。由于母系不能自体受精，因此产生的f1种子必须与母系杂交。而且由于父系具有恢复基因，所以f1子代是雄性和雌性均可育的。
除了cms育种系统之外，在缺少基因组dna的情况下分析线粒体dna的原因很多，包括线粒体基因组测序。在某些植物物种(尤其是小麦)中，如果不先分离线粒体，很难在基因水平上了解线粒体差异，甚至无法确定。这是因为在进化过程中，线粒体和宿主基因组通过重组事件和基因转移共享了它们的遗传密码。因此，分析线粒体需要进行复杂的组织分离，线粒体分离，然后才能进行基因分析。
在本发明之前，现有技术至少教导了从种子中分离胚，因为种子的其余部分(例如胚乳、果皮或种皮或其他种子部分)会干扰线粒体dna的分离。另外，现有技术教导了使用若干个费时的若干个高速离心步骤来分离线粒体细胞器。例如参见，zaheerahmed和yong-bifu,animprovedmethodwithawiderapplicabilitytoisolateplantmitochondriaformtdnaextraction[一种对于分离植物线粒体用于mtdna提取而言适用性更广的改进方法],plantmethods[植物方法](2015)11:56。两种现有技术要求均阻止了以高通量方式执行现有技术方法。
技术实现要素：
本发明通过提供从干燥种子中分离线粒体dna的方法来显著改善本领域。在一个实施例中，所述方法需要取出大量的干燥种子并将其磨成粉末；对粉末进行采样，并使粉末样品与均化缓冲液接触，并任选地在缓冲液中孵育样品；离心样品，特别是低速离心，例如2000xg-4000xg，以获得含有植物线粒体的上清液；并且用dna酶处理上清液，以去除任何污染的基因组dna。在一方面，匀化缓冲液包含tris和蔗糖，并且特别地包含50mmtris-hclph7.5和0.5m蔗糖。在另一个实施例中，从植物线粒体中分离线粒体dna。特别地，用作起点的干燥种子是小麦种子，但是它们也可以是大麦种子、玉米种子、水稻种子、向日葵种子或其他农作物植物的种子。
在另一个实施例中，本发明以高通量的方式分离植物线粒体。这种高通量方法需要取出若干个干种批，然后将它们分别地磨成单独粉末。从这些单独粉末中采集样品，每个样品代表这些种子批中的一个，然后放入样品板的各个孔中。将均化缓冲液添加到采样板的每个孔中，并且将板任选地孵育。将板(或多个板，如果多于一个的话)离心，特别是以低速(例如2000xg-4000xg)离心，以沉淀种子碎片和细胞核，从而获得含有植物线粒体的上清液。将来自每个孔的上清液转移到新的采样板中的相应孔中。为了去除任何污染的基因组dna，用dna酶处理新板中的每个孔。在一方面，匀化缓冲液包含tris和蔗糖，并且特别地包含50mmtris-hclph7.5和0.5m蔗糖。在另一个实施例中，从植物线粒体中分离线粒体dna。特别地，用作起点的干燥种子是小麦种子，但是它们也可以是大麦种子、玉米种子、水稻种子、向日葵种子或其他农作物植物的种子。在另一方面，采样板是24孔板、或48孔板、或96孔板。
在另一个实施例中，本发明涉及对从相同样品获得的线粒体dna和基因组dna进行双重基因分型的方法。如上所述研磨种子，并如上所述获得植物线粒体dna。将上清液(包含植物线粒体)转移到新的采样板后，沉淀的细胞碎片重悬浮在均化缓冲液中。然后根据现有技术方法处理重悬浮的细胞碎片，以提取基因组dna，这可以通过已知的gdna提取方法来实现。参见例如，stephenl.dellaporta,jonathanwood,jamesb.hicks,aplantdnaminipreparation:versionii[植物dna微量制备：第二版],plantmolecularbiologyreporter[植物分子生物学报道],1983,第1卷,第4期,第19-21页。
定义
本发明不限于本文描述的具体方法、方案、细胞系、植物物种或属类、构建体和试剂。本文使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而无意限制本发明的范围，本发明将仅由所附权利要求限制。应当注意的是，如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”包括复数指代。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物等。如本文所用，词语“或”意指具体清单的任何一个成员并且还包括该清单的成员的任何组合(即，还包括“和”)。
术语“约”在本文用于表示近似、大致、约或在......左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，精确值(即，无“约”)是优选的。
如本文所用，术语“扩增”意指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核苷酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(pcr)系统、连接酶链式反应(lcr)系统、基于核酸序列的扩增(nasba，安大略省密西索加的坎基尼公司(cangene，mississauga，ontario))、q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(tas)、以及链置换扩增(sda)。参见例如，diagnosticmolecularmicrobiology:principlesandapplications[诊断分子微生物学：原理与应用],persing等人编著,华盛顿美国微生物学会(americansocietyformicrobiology,washington,d.c.),(1993)。扩增产物被称为“扩增子”。
术语“基因型”是指细胞或生物体的基因组成。个体的“一组基因标记的基因型”包括个体中存在的一个或多个基因标记基因座的具体等位基因。如本领域中已知的是，基因型可以涉及单一基因座或多个基因座，无论这些基因座是相关还是不相关的，和/或是连锁还是非连锁的。在一些实施例中，个体的基因型涉及一个或多个相关的基因，因为这些基因中的一个或多个参与感兴趣的表型(例如，如本文定义的数量性状)的表达。因此，在一些实施例中，基因型包括个体内在数量性状的一个或多个遗传基因座处存在的一个或多个等位基因的总和。
当在本发明的核酸分子和多核苷酸的上下文中使用时，术语“分离的”是指在相应源生物体内的染色体多核苷酸上下文中识别并分离/分开的多核苷酸。如果分离的核酸或多核苷酸确实具有天然存在的对应物，则其分离的核酸或多核苷酸不是其在其天然环境中存在的核酸。相比之下，非分离的核酸是核酸(如dna和rna)，它们是在自然界存在的状态下发现的。例如，在相邻基因附近的宿主细胞染色体上发现给定的多核苷酸(例如，基因)。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。替代性地，其可以包含正义链和反义链(即，核酸分子可以是双链的)。在优选的实施例中，本发明的核酸分子理解为分离的。
短语“核酸”或“多核苷酸”是指可以对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的dna聚合物或聚脱氧核糖核苷酸或rna聚合物或多核糖核苷酸)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含生物rna或dna不典型的碱基的寡核苷酸，例如2'-o-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另外指示，否则本发明的具体核酸或多核苷酸任选地包含或编码除明确指示的任何多核苷酸之外的互补多核苷酸。
“pcr(聚合酶链反应)”在本发明的范围内被理解为是指产生dna的相对较大量的具体区域，从而进行可能的基于那些区域的不同的分析的方法。
术语“探针”是指将与靶核酸分析物或其cdna衍生物中的基本上互补的寡核苷酸形成氢键合双链体的单链寡核苷酸。
如本文所用，术语“引物”是指当置于诱导引物延伸产物的合成的条件下(例如在核苷酸和用于聚合的试剂如dna聚合酶的存在下并且在合适的温度和ph下)时能够退火至扩增靶标的寡核苷酸，该扩增靶标允许dna聚合酶附接，从而用作dna合成的起始点。(扩增)引物优选地是单链的，以获得最大的扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括引物的温度和组成(a/t和g/c含量)。一对双向引物由dna扩增领域中(诸如在pcr扩增中)常用的一个正向引物和一个反向引物组成。应当理解的是，如本文所用，“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些模糊性的情况下。因此，“引物”包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。寡核苷酸引物可以通过任何合适的方法制备。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如在例如美国4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相载体法。如果需要，可以通过并入可通过例如光谱方法、荧光方法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法或化学方法检测的手段来对引物进行标记。一种或多种寡聚核苷酸引物的模板依赖性延伸由聚合试剂在适量的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(datp、dgtp、dctp和dttp；即dntp)或类似物的存在下、在反应介质(包含适当的盐、金属阳离子和ph缓冲体系)中催化。合适的聚合剂是已知催化引物和模板依赖性dna合成的酶。已知的dna聚合酶包括例如大肠杆菌(e.coli)dna聚合酶或其klenow片段、t4dna聚合酶和taqdna聚合酶。用这些dna聚合酶催化dna合成的反应条件是本领域已知的。合成的产物是由模板链和引物延伸链组成的双链分子，其包括靶序列。这些产物反过来作为另一轮复制的模板。在第二轮复制中，第一轮循环的引物延伸链用其互补引物退火；合成产生“短”产物，该产物通过引物序列或其互补物在5'-末端和3'-末端两者上结合。变性、引物退火和延伸的重复循环导致由引物限定的靶区域的指数累积。进行足够的循环以实现所需量的含有核酸靶区域的多核苷酸。所需的量可以变化，并且由产物多核苷酸起到的功能决定。pcr方法在手册中已经很好地描述，并且是本领域技术人员已知的。通过pcr进行扩增后，可以通过与探针多核苷酸杂交来检测靶多核苷酸，该探针多核苷酸在低、中度或甚至高度严格的杂交和洗涤条件下与靶序列的多核苷酸形成稳定的杂种。如果预期探针将与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更多)，则可以使用高度严格条件。如果预期有一些错配，例如如果预期变体品种会导致探针不完全互补，则可以降低杂交的严格性。然而，通常选择排除非特异性/偶然结合的条件。影响杂交并针对非特异性结合而选择的条件是本领域已知的，并且描述于例如sambrook和russell,2001中。通常，较低的盐浓度和较高温度增加了杂交条件的严格性。“pcr引物”在本发明的范围内优选地被理解为是指dna的特定区域的pcr扩增中所用的单链dna的相对短的片段。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文可以互换地使用。
术语“一个或多个等位基因”是指基因的一各或多个替代形式中的任何一个，所有等位基因均涉及至少一个性状或特征。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占有同源染色体对上相应的基因座。在某些情况下(例如，对于qtl)，用“单倍型”(即染色体片段的等位基因)代替“等位基因”更为准确，但是，在这些情况下，术语“等位基因”应理解为包括术语“单倍型”。如果两个个体在特定基因座处拥有相同的等位基因，则如果等位基因是从一个共同祖先遗传的(即，等位基因是同一亲本等位基因的拷贝)，则所述等位基因被称为“由于继承而相同”。可替代的是等位基因“按状态相同”(即，等位基因看起来是相同的，但衍生自等位基因的两个不同拷贝)。世代信息鉴定对连锁研究很有用；世代鉴定和状态信息鉴定都可以用于关联研究，尽管血统信息鉴定可能特别有用。
术语“回交”在本发明的范围内应理解为是指使杂种子代与亲本之一重复往回杂交的方法。
术语“有条件的雄性不育”是指雄性不育的表型(即，不能产生可育的花粉)，其可以被某些条件诱导和/或抑制。因此，可以通过应用所述某些条件将植物从雄性不育表型“转换”为雄性可育表型。雄性不育可能由多种因素引起，并且可以例如表现为完全缺乏雄性器官(花药)、花粉退化、不育花粉等。根据条件的程度，从雄性不育向雄性可育的“转换”可以是完全或不完全的。最优选地，在本发明的上下文中，术语“有条件的雄性不育”是指温度依赖性的雄性不育，并且因此是指细胞核雄性不育表型，其中所述不育是温度依赖性的，可以在超过35℃(优选在35℃至43℃之间，更优选在37℃至40℃之间，最优选在约39℃下；优选暴露一段优选的热处理时间，然后在室温下生长)的温度下恢复为可育。
术语“种质”是指一个群体或另外的个体组(例如，物种)的基因型的总体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，一组植物，其充当各种等位基因的储存库。短语“适应的种质”是指已证实具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，短语“未适应的种质”、“原始种质”和“外来种质”是指遗传价值未知或未经证实的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域；这样，短语“未适应的种质”在一些实施例中是指不属于已建立的育种群体并且与已建立的育种群体的成员没有已知关系的植物材料。
术语“单倍型”可以指从一个亲本那里继承的个体的等位基因集。因此，二倍体个体具有两个单倍型。术语“单倍型”可以在更有限的意义上使用，以指代与表型性状相关的物理连锁的和/或不连锁的遗传标记(例如，序列多态性)。短语“单倍型区块”(有时在文献中也简称为单倍型)是指在单个染色体(或其一部分)上物理连锁的一组两个或更多个遗传标记。通常，每个区块具有若干个常见的单倍型，并且可以选择遗传标记的子集(即“单倍型标签”)来唯一地鉴定这些单倍型中的每一个。
在植物育种的上下文中，术语“杂种”、“杂种植物”和“杂种子代”是指植物，所述植物是通过杂交不同系或品种或物种的植物(包括但不限于两个近交系(例如，基因杂合的或大部分杂合的个体)之间的杂交)而产生的基因上不同的亲本的后代。短语“单次杂交f1杂种”是指由两个近交系之间的杂交产生的f1杂种。
短语“近交系”是指在基因上是纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交系可以通过若干循环的兄弟/姐妹育种或自体受精来获得。在一些实施例中，近交系针对一个或多个感兴趣的表型性状进行纯育。“近交”、“近交个体”或“近交子代”是来自一个近交系的单独的样品。术语“近交”是指基本上纯合的个体或系。
术语“渐渗(introgression)”，“渐渗的(introgressed)”和“进行渐渗(introgressing)”是指自然过程和人工过程，其中通过将一个物种、品种或栽培品种与另一个物种、品种或栽培品种杂交来将基因组区域从所述一个物种、品种或栽培品种移至所述另一个物种、品种或栽培品种。该过程可以任选地通过回交到回交亲本来完成。
术语“基于标记的选择”在本发明的范围内应理解为是指使用基因标记从植物中检测一个或多个核酸，其中该核酸与所希望的性状相关联，以鉴别出携带令人希望的(或不希望的)性状的基因的植物，使得在选择性育种计划中可以使用(或避免)那些植物。
短语“表型性状”是指个体中由个体的基因组与环境的相互作用产生的外观或其他可检测的特征。
术语“多个”是指多于一个实体。因而，“多个个体”是指至少两个个体。在一些实施例中，术语多数是指多于整体的一半。例如，在一些实施例中，“群体中的多数”是指多于那个群体的成员的一半。
术语“子代”是指具体杂交的一个或多个后裔。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自体受精(即，同一个植物充当雄性和雌性配子两者的供体)。这一个或多个后裔可以是例如f1、f2或任何继代。
短语“质量性状”是指受一个或几个展现大多数表型作用的基因控制的表型性状。因此，质量性状通常被简单地遗传。植物中的实例包括但不限于花色、穗轴色和疾病抗性，例如北方玉米叶枯萎病抗性。
“表型”在本发明的范围内应理解为是指在基因上控制的性状的可区分的特征。
“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或培养细胞的形式，或作为高等组织化单位(例如像，植物组织、植物器官或整株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下各项的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、嫩枝和种子；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花朵、果实、茎、芽、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。
术语“群体”意指共享一个常见遗传衍生的植物的遗传上异质的集合。
术语“主要是雄性不育的”是指在至少100株植物中，所有这些植物上不超过10％，优选不超过5％，更优选不超过1％的花具有产生可育花粉的功能雄性器官。必须理解，单个植物可以同时具有可育和不育的花。在优选的实施例中，单个植物上不超过10％，优选不超过5％，更优选不超过1％的花具有产生可育花粉的功能雄性器官。
术语“后代”植物是指作为一种或多种亲本植物或其后裔的营养或有性繁殖的子代的任何植物。例如，后代植物可以通过亲本植物的克隆或自交或者通过两个亲本植物的杂交而获得，并且包括自交体以及f1或f2或甚至更远的世代。f1是产生自两个亲本的第一代后代(两个亲本的至少一个是第一次用作性状的供体)，而第二代(f2)或后续世代(f3、f4等)的后代是产生于f1'、f2'等的样本。因此，f1可以是由两个真正的育种亲本(真正的育种是性状的纯合子)杂交产生的杂种，而f2可以是所述f1杂种的自花授粉的后代。
“重组”是减数分裂过程中两个同源染色体之间的信息交换。双重重组的频率是单个重组体的频率的乘积。例如，在10cm区域中发现的重组子的频率为10％，并且双重重组子的频率发现为10％x10％＝1％(1厘摩被定义为测试杂交中1％的重组子代)。
术语“rhs”或“恢复的杂种系统”是指基于细胞核雄性不育的杂种系统。
如短语“有性杂交的”和“有性生殖”在本发明的主题的上下文中是指配子融合以产生子代(例如，通过受精，如在植物中通过授粉产生种子)。在一些实施例中，“有性杂交”或“异体受精”是一个个体被另一个体受精(例如，植物中的异花授粉)。在一些实施例中，术语“自交”是指通过自体受精或自花授粉产生种子；即花粉和胚珠来自同一株植物。
“选择性育种”在本发明的范围内应理解为是指使用具有或显示令人希望的性状的植物作为亲本的育种程序。
“测试”植物在本发明的范围内应理解为是指用于在基因上表征将被测试的植物中的性状的植物。典型地，使待测试的植物与“测试”植物杂交，并且对杂交子代中的性状的分离比率进行评分。
术语“测试对象”是指具有标准基因型，已知特征和已建立的性能的系或个体。“测试对象亲本”是指来自测试对象系的个体，其在有性杂交中被用作亲本。通常，测试对象亲本与其所杂交的个体无关并且在基因上不同。当与个体或近交系杂交以进行表型评估时，通常使用测试对象来产生f1子代。
短语“顶交组合”是指将单个测试对象系与多个系杂交过程。产生此类杂交的目的是确定杂种子代的表型表现；也就是说，通过测试对象杂交来评估多个系中的每一个系在衍生自所述系的杂种子代中产生期望表型的能力。
术语“品种”和“栽培品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。
作物是指小麦、玉蜀黍(玉米)、稻、向日葵、大豆、番茄或种植以获取食物(无论是用于动物饲料还是用于人类食用)或纤维的任何一种或多种植物。
磨碎的种子、粉和类似术语是指无论在室温还是在低于冰点的温度下已经受到机械破坏和/或粉碎的完整种子。示例包括磨盘式或磨刀式研磨、铣磨以及研钵和研杵研磨等。
高通量是指同时处理多个样品或快速连续处理多个样品或两者。例如，本发明能够同时处理24个样品，这被认为是高通量的。同样，同时处理48个或96个样品也被认为是高通量。此外，不认为单独处理一个样品或同时处理少量样品(例如八个或更少)是高通量的。
低速离心是指以小于4000xg的速度离心。单位“xg”等效于重力。在常规的线粒体分离中，现有技术教导了使用高速离心，例如17,000xg或更高对于沉淀线粒体是必要的，以使线粒体适于下游过程，例如dna分离和基因分型。
如本文所用，种子、籽粒、谷粒和类似术语是指能够播种并萌发成植物的成熟植物胚珠。对于一些物种，种子包含胚胎和胚乳。它还可以包含种皮(即果皮)。其他种子，例如大豆或向日葵，可能不包含胚乳。优选地，本发明中使用的种子基本上没有种子碎片取样、胚乳去除或任何其他形式的单独取样或修饰。本发明的种子可以来自任何种子繁殖的植物，包括但不限于玉蜀黍、小麦和大豆。
样品板、采样板、取样块、微孔、微孔板等是指包括至少四个排列成网格的孔的板。在一个实施例中，样品板包括以a×b格式布置的样品孔，其中a和b是垂直轴，并且沿a轴的孔的数量可以大于、小于或等于沿b轴的孔的数量。在一个实施例中，沿a轴或b轴的孔的数量至少为2。在一个实施例中，沿a轴或b轴的孔的数量在2到15之间。在一个方面，板总共包括24、48或96个孔。在一个实施例中，样品孔中的一个通过易碎区域连接到另一个样品孔。在一个实施例中，样品板包括基座，所述基座包括用于将样品板固定至板框保持器的对应对接部分的对接部分。
具体实施方式
本发明涉及从干燥种子获得植物线粒体的方法，所述方法包括：(a)获得多个干燥种子；(b)将所述多个干燥种子磨成粉末；(c)从步骤(b)的粉末中取样品，并使所述样品与均化缓冲液接触，并任选地将接触的样品孵育；(d)离心步骤(c)的接触的样品，离心速度足以使细胞核和细胞碎片沉淀，从而获得包含植物线粒体的上清液；并且(e)用一定浓度的dna酶处理步骤(d)的上清液；其中包含植物线粒体的上清液适合用于下游过程。在一个实施例中，线粒体用于线粒体dna(“mtdna”)提取。在另一个中，干燥种子是小麦、大麦、玉米、稻、向日葵或其他农作物种子。在又一个中，植物线粒体是小麦线粒体。
本发明特别涉及用于从多个成批干燥种子中获得植物线粒体的高通量方法，所述方法包括：(a)获得多个干燥种子批；(b)将所述多个干燥种子批磨成分开的粉末；(c)从步骤(b)的分开的粉末中的每一个中取样品，并将每个样品放入采样板的单独孔中；(d)将均化缓冲液添加至所述采样板的每个孔中的样品；(e)离心所述采样板，离心速度足以使细胞核和细胞碎片沉淀，从而获得包含植物线粒体的上清液；(f)将所述上清液转移到新的采样板上；并且(g)用一定浓度的dna酶处理步骤(f)的上清液。在一个实施例中，均化缓冲液包含tris和蔗糖。在一个方面，均化缓冲液包含50mmtris-hclph7.5和0.5m蔗糖。在另一个实施例中，步骤(e)的离心在2000xg和4000xg之间。在又一个实施例中，采样板是24孔板、或48孔板或96孔板。
本发明还涉及从干燥种子的相同样品中获得植物基因组dna和植物线粒体dna的方法，所述方法包括：(a)获得多个干燥种子；(b)将所述多个干燥种子磨成粉末；(c)从步骤(b)的粉末中选择样品，并使所述样品与均化缓冲液接触；(d)离心步骤(c)的接触的样品，离心速度足以使细胞核和细胞碎片沉淀，从而获得包含亚细胞器的上清液；(e)去除步骤(d)的上清液；(f)用合适浓度的dna酶处理步骤(d)的上清液；(g)从步骤(f)的经处理的上清液中提取细胞器dna；并且(f)重悬浮步骤(d)的沉淀的细胞核和细胞碎片，从而获得包含重悬浮的细胞核dna的溶液；其中步骤(f)的经dna酶处理的上清液包含适用于细胞器基因分型的亚细胞植物细胞器，并且其中步骤(h)的包含重悬浮的细胞核dna的溶液适用于细胞核基因分型。
实例
以下非限制性实例向本领域普通技术人员显示了如何实施所要求保护的方法。
实例1：材料
在要求保护的方法中使用以下材料。
1.均化缓冲液：50mmtris-hcl，ph7.5，0.5m蔗糖。储存在4℃。
2.购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich,inc.)的dna酶i(100mg)(产品编号：10104159001)，存储在4℃。
3.dna酶i溶解缓冲液：50mmtris-hcl，ph7.5，10mmcacl2，10mmmgcl2，50％甘油。
4.dna酶i反应缓冲液(10x)：500mmtris-hcl，ph7.5，100mmmgcl2，20mmcacl2。
5.dellaporta裂解缓冲液：200mmtrishclph8.5，edta25mm，1％sds
6.胍裂解缓冲液：4m硫氰酸胍，10mmtris。
7.洗涤缓冲液：62.5mmtris-hcl，ph7.5，12.5mmedta，0.25mnacl，25％乙醇，25％异丙醇。
8.7.5m醋酸铵。
9.100％乙醇(“etoh”)。
10.异丙醇。
11.70％etoh。
12.1xte：10mmtris-cl，ph8.0，1mmedta。
13.24深孔样品板，其中在每个孔中添加四个钢珠(直径为3/16”)，以及合适的垫，例如硅垫盖。
14.96孔半高板。
15.250μl和1000μl以及宽孔口吸头。
可以对以上列表进行合理的替换，并且本领域的普通技术人员将知道这类合理的替换。同样，可以对以上材料进行轻微修改，并且本领域的普通技术人员将知道这些修改。例如，胍裂解缓冲液可包含4m异硫氰酸胍(47.2g/100ml)，25mm乙酸钠，ph6.0和1mmedta。参见doi:10.1101/pdb.rec431,coldspringharb.protoc[冷泉港实验方案]2006。
为了制备用于使用的dna酶，先从100mg冻干的dna酶开始，并且添加40mldna酶i溶解缓冲液，轻轻混合。dna酶的最终浓度约为5u/μl。分装1.0mldna酶溶液至1.5ml试管中，并储存在-20℃。
实例2：种子粉样品制备
对于每批种子，取样300粒种子，并使用适当的磨机将其磨成细粉，将粉保持在4℃。重要的是要确保粉末非常细，并避免在磨的过程中过热。种子可以是任何种子，但特别是小麦或大麦种子。
获得预装有钢珠的24深孔样品板。使用适当的采样工具(例如量匙)从每个种子粉样品中，将约0.3g粉子样品取到孔中。子样品可以单次、两次，三次或更多次进行。用垫密封板，直到准备添加均化缓冲液为止。
准备就绪后，取下垫，并向每个孔中添加3.0ml均化缓冲液。重新固定垫，并将板(或多个板，如果是一个以上)放在约300rpm的定轨振荡器上约15分钟。任选地，也可以使用磁性板来移开钢珠，并帮助将粉和均化缓冲液混合。注意不要振荡太快，因为线粒体易碎。
在适当的装置(例如
取下垫，并且小心地将600μl上清液(总计，使用宽孔口移液器吸头)转移到96孔半高板上。请特别注意不要触摸沉淀物，以免污染细胞核dna。如果子样品是一式两份，则将来自两个24深孔板的上清液合并到一个96孔半高板中。将包含线粒体的上清液保存在4℃，直到准备进行下一步。
准备dna酶处理混合物。表1中的制备足以进行96个反应。
表1.dna酶处理混合物配方。
等分100μldna酶混合物到96孔半高板的每个孔中。用宽孔口移液器吸头，小心地将含有线粒体的100μl储存上清液添加到dna酶混合物的等分试样中。不要用吸头接触孔壁；将上清液添加到孔的底部中间。缓慢上下吸打三到五次以混合反应。用垫或黏性塑料薄膜密封板。在室温下以约400rpm离心约1分钟，以确保将孔中的内容物收集到孔底。将板放在定轨振荡器上，并以约300rpm振荡约5分钟，以进一步混合反应。在37℃下孵育平约1小时。
在这一点上，从业者已经从核中获得了基本上不含基因组植物dna的植物线粒体。
实例3：
硫氰酸胍裂解线粒体和异丙醇沉淀mtdna
从含有植物线粒体的板中去除垫或薄膜，并向每个孔中添加200μl裂解缓冲液以裂解线粒体。重新密封板，并在定轨振荡器上以约600rpm振荡约10分钟。在室温下以4000rpm离心1分钟。
将300μl异丙醇加到以上板的每个孔中。用垫密封板，并在定轨振荡器上以约600rpm振荡约10分钟。在室温或冷冻下，以4000rpm离心约20分钟。
去除垫，并通过轻轻翻转板或使用真空抽吸丢弃上清液。向每个孔中添加500μl70％-80％乙醇/孔。更换垫，并在定轨振荡器上以600rpm振荡约5分钟。在室温或冷冻下，以4000rpm离心约10分钟。
去除垫并丢弃上清液。将板倒置放在纸巾上，以吸收尽可能多的液体，使板干燥约20分钟，以使残留的乙醇完全蒸发。
向每个孔中添加80μl1xte缓冲液。在室温下将板放在振荡器台上最少1小时，优选在室温下过夜。
在室温或冷冻下，以4000rpm离心板约5分钟。任选地，可将70μl/孔转移至新的经标记的96孔板中。将线粒体dna板储存在4℃或-20℃下，直到有需要。在用于pcr反应之前，以4000rpm离心板5分钟，以确保所有液体都收集在孔的底部。
实例4：
硫氰酸胍裂解和用磁力珠分离mtdna
从含有植物线粒体的板中去除垫或薄膜，并向每个孔中添加200μl裂解缓冲液以裂解线粒体。重新密封板，并在定轨振荡器上以约600rpm振荡约10分钟。在室温下以4000rpm离心1分钟。
在每个孔的侧壁上添加6μl顺磁珠(“pmp”或“磁性珠”或“磁珠”)，注意不要接触溶液，以免造成交叉污染。如果需要更高产量的mtdna，则将pmp的体积增加至10μl/孔。通过上下移液几次将裂解液和pmp混合。通过在室温下孵育至少5分钟，优选在400rpm的定轨振荡器上，使mtdna与pmp结合。
将板放在磁性板上，并使pmp迁移到孔的角落。用真空抽气器抽吸液体，注意不要抽吸珠。
向每个孔中添加400μl洗涤缓冲液或简单地添加70％-80％etoh(优选使用多通道移液器)，并通过上下移液几次或通过在定轨振荡器上以400rpm旋转3-5分钟进行混合。
再次将板放在磁性板上，并使pmp迁移到孔的角落。用真空抽气器抽吸液体，注意不要抽吸珠。从磁铁上取下板，并且让珠风干约15分钟，或直到珠刚好干燥。一旦不再存在可检测到的酒精气味，并且珠变成浅褐色，珠准备就绪。注意，小心不要让珠干燥太久。
为了从现在干燥的珠上洗脱mtdna，向每个孔中添加100μl，然后上下移液或通过在定轨振荡器上以400rpm旋转5-10分钟进行混合。
在板下面放一块磁铁，并且让溶液澄清。将含有mtdna的90μl溶液从每个孔中转移到新板中。密封板并在4℃或-20℃储存，直到需要为止。使用前，将板以4000rpm离心1-2分钟。
实例5：
用dellaporta缓冲液裂解线粒体并且用异丙醇沉淀mtdna
从含有植物线粒体的板去除盖，并向每个孔中添加300μldellaporta裂解缓冲液以裂解线粒体。重新将板盖上并翻转若干次，以帮助混合裂解物，和/或任选地在定轨振荡器上以600rpm振荡约10分钟。这可以帮助获得高产量的dna。在室温下以4000rpm离心约2分钟。
去除盖，并且向每个孔中添加200μl7.5mnh4醋酸盐。重新固定盖子并将板翻转若干次，以帮助混合裂解物，和/或任选地在定轨振荡器上以600rpm振荡约10分钟。在4000rpm下离心15分钟。
在离心过程中，通过向新的96孔板中添加300μl异丙醇来制备沉淀板。将450μl上清液/孔从离心板转移至含有异丙醇的新96孔板中的相应孔中。用盖子密封板，并通过将板翻转数次来轻轻地混合。在4000rpm下离心20分钟。
去除盖子，小心地将板翻转以弃去上清液，或使用真空抽吸除去上清液。向每个孔中添加500μl70％乙醇/孔。更换盖子，并在定轨振荡器上以600rpm振荡约5分钟。以4000rpm离心10分钟以沉淀mtdna。去除盖子并丢弃上清液。让板干燥至少1-2小时，或长达一整夜，以使残留的乙醇蒸发。
向每个孔中添加100μl1xte洗脱缓冲液。密封板并将其放在轨道振荡器台上以约400rpm-600rpm在室温下旋转至少1小时或过夜。为了帮助破碎dna沉淀物以实现更完全的重悬浮，约30分钟后，将板轻轻翻转或在涡旋机上进行脉冲。
以4000rpm离心板约15分钟。将90μl/孔转移到新的96孔板中，将mtdna板盖上并在4℃或-20℃下储存，直到需要。在用于pcr反应之前，将板以4000rpm离心5分钟。
实例6：
检测和区分mtdna和gdna
为了检测小麦mtdna的存在，进行了实时pcr(“rtpcr”)反应。rtpcr在现有技术中是众所周知的。表2中列出的引物用于检测小麦mtdna。还包括产生的扩增子的序列。
显示小麦mtdna的存在的rtpcr反应结果如图1所示。
为了检测小麦基因组dna污染的存在，进行了进一步的rtpcr反应。表3中列出的引物用于检测小麦gdna污染。还包括产生的扩增子的序列。
显示不存在小麦细胞核gdna的rtpcr反应结果如图2所示。
这些结果表明，高质量的线粒体dna以高通量方式从完整种子中提取出来，而不受种子基因组dna的污染。
序列表
<110>syngentaparticipationsag
yu,wenjin
fan,chungyang
ji,yanshan
<120>从植物种子分离线粒体的高通量方法
<130>81479-wo-reg-org-p-1
<150>62/572780
<151>2017-10-16
<160>8
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ccaccatttctcctgcttgaa21
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
gtcgagtggtctcagttggagat23
<210>3
<211>29
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>3
ctcgttcaatccataaacacgtgcaatcc29
<210>4
<211>75
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>扩增子
<400>4
gtcgagtggtctcagttggagatgggattgcacgtgtttatggattgaacgagattcaag60
caggagaaatggtgg75
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
caaggacgccgaattcaaga20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
cgaagaaggtgcccttgaga20
<210>7
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>7
ccacccgatgaacttcctgaacgaga26
<210>8
<211>71
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>扩增子
<400>8
caaggacgccgaattcaagacccacccgatgaacttcctgaacgagaggactctcaaggg60
caccttcttcg71
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！