来自液体活检的MSI的制作方法

本申请要求我们于2017年10月19日提交的序列号为62/574,718的共同未决的美国临时申请专利的优先权，将该专利通过引用并入本文。

本发明的领域是对涉及癌症(特别是涉及鉴定在来自血液和其他生物流体的实体瘤细胞中的微卫星不稳定性(msi))方面的组学数据进行谱分析(profiling)。

背景技术：

背景描述包括可用于理解本发明的信息。其并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或矛盾的情况下，本文提供的该术语的定义适用，而该术语在该参考文献中的定义不适用。

微卫星通常是短的串联重复dna序列，长度为1-6个碱基对。这些重复分布在整个基因组中，并且由于在每个基因座处的串联重复序列的数量不同从一个个体到另一个个体中的长度通常有所变化。最近，已经将微卫星标记用于检测msi(微卫星不稳定性)，该msi是基因组不稳定性的形式。msi的特征在于由于在dna复制期间重复单元的插入或缺失以及dna错配修复系统无法纠正这些错误所致的微卫星等位基因长度的变化。

通常，msi分析涉及比较通过从匹配的正常样品和测试样品中扩增dna产生的微卫星标记等位基因谱，这些正常样品和测试样品可能是错配修复(mmr)缺陷的。在测试样品中存在但是在对应的正常样品中不存在的等位基因指示msi。通常，选择在msi分析中所包括的单核苷酸重复标记以对含有错配修复缺陷的样品中的变化具有高敏感性和特异性，并且最优选地此类单核苷酸重复标记是准单态的(即，对于给定的标记，几乎所有个体(例如，至少90％、更通常地至少95％的个体)对相同的共同等位基因是纯合的)。如将容易理解的，准单态或单态标记的使用简化了数据解释，并且存在许多本领域中已知用于鉴定msi的合适的基因座。例如，合适的基因座描述于us6150100、us7662595、us2003/0113723、us2015/0337388和wo2017/112738中。

还存在许多在本领域中已知用于从所选择的基因座检测msi的方法，并且最通常包括基于pcr的方法。例如，用于msi分析的可商购获得的测试试剂盒是由普洛麦格公司(promegacorporation)(美国威斯康辛州麦迪逊市伍兹霍洛路2800号，邮编53711-5399(2800woodshollowroad,madison,wi53711-5399usa))提供。可替代地，如us2017/0032082中所述，还可以从具体的组学分析中推断出msi。

用于msi分析的大多数样品是来自手术或来自活检的新鲜样品，或者是福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)样品。然而，从ffpe样品中获得足够高质量的dna可能是有问题的，因为在包埋到石蜡中之前由于组织样品的延长的固定或不适当固定而使dna经常被降解。如在invivo[体内]28:349-354(2014)中所述，通过将血液中的总cfdna量与msi关联，又进行了检测msi的其他尝试，但是在此研究中，在mmr健全型样品与mmr缺陷型样品之间未发现相关性。因此，即使已知确定msi的多种系统和方法，但是它们中的全部或几乎全部均遭受一个或多个缺点。最通常地，具有高纯度和稳定性的样品只能使用侵袭性程序或手术获得，然而ffpe样品通常遭受纯度和/或稳定性的缺失。

因此，尤其是在能以简单且安全的方式获得生物样品的情况下，仍然需要分析癌症中的msi的改进方法。

技术实现要素：

本发明的主题涉及从不是肿瘤样品的患者样品中检测msi的多种方法。最有利地，可以从单个全血样品中检测msi，该单个全血样品从血清中提供ctdna，并且从血液中的细胞(最通常地白细胞)提供核dna。优选地，ctdna和核dna分别作为肿瘤样品和匹配的正常样品用作扩增和尺寸确定的起始材料。

在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种检测实体瘤中的微卫星不稳定性(msi)的方法，该方法包括从患有实体瘤的患者的血液样品中分离含细胞级分(优选地血沉棕黄层级分)和细胞耗竭级分的步骤，以及从细胞耗竭级分中分离无细胞循环肿瘤dna(ctdna)的另一步骤。在进一步的步骤中，从含细胞级分中分离核dna，并且在ctdna和核dna中扩增至少一个msi基因座。然后检测在ctdna中扩增的msi基因座与在核dna中扩增的msi基因座之间的尺寸差异。

更通常地，扩增至少一个msi基因座的步骤包括扩增至少三个msi基因座或至少五个msi基因座。进一步设想了至少一个msi基因座是准单态或单态重复标记，和/或至少一个msi基因座包括单核苷酸重复或二核苷酸重复。例如，合适的msi基因座包括nr-21、bat-26、bat-25、nr-24和mono-27。在进一步设想的方面，通过毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、基于芯片的微流体电泳(methodsmolbiol.[方法分子生物学]2013；919:287-96)或变性高效液相色谱来完成检测尺寸差异的优选步骤。另外地，设想了检测尺寸差异的步骤包括比较扩增的msi基因座的色谱图的洗脱曲线中的峰形状和峰位置的步骤。例如，峰形状是曲线下面积和/或峰高，或者设想了比较步骤包括独立成分分析的步骤。

在本发明主题的另一方面，诸位发明人设想了一种检测在实体瘤中的微卫星不稳定性(msi)的方法，该方法包括从患有实体瘤的患者的血液样品中获得肿瘤和匹配的正常dna的步骤，以及将来自血液样品的肿瘤和匹配的正常dna用作msi分析的源材料的进一步的步骤。

优选地，该肿瘤dna是ctdna，和/或该匹配的正常dna是来自白细胞的dna。此外，设想了msi分析包括至少一个msi基因座的pcr扩增步骤，和/或设想了msi分析包括毛细管电泳和荧光检测的步骤。可替代地，该msi分析可以包括无荧光检测的尺寸分离色谱的步骤。

从不同的角度看，诸位发明人设想了一种将来自患者的血液样品中的无细胞循环肿瘤dna(ctdna)和核dna用于检测患者实体瘤中的微卫星不稳定性(msi)的用途。最通常地，该肿瘤dna是ctdna，并且该匹配的正常dna是来自白细胞的dna。进一步优选的是，msi分析包括至少五个msi基因座的pcr扩增的步骤，和/或msi基因座是准单态或单态重复标记。如前所述，设想了对msi的检测包括无荧光检测的尺寸分离色谱的步骤，以及比较扩增的msi基因座的色谱图的洗脱曲线中的峰形状和峰位置的步骤。

本发明主题的多个对象、特征、方面和优点将根据以下关于优选实施例的详细描述以及附图而变得更清楚。

附图说明

现有技术图1是描绘通过毛细管凝胶电泳分离的、使用可商购获得的msi检测试剂盒对所选择的msi基因座扩增的产物的尺寸分布的图。

图2是展示根据本发明主题的方法的示例性工作流程的示意图。

图3是具有肿瘤和正常痕迹的、微卫星稳定的(mss)样品的一种示例性洗脱曲线。

图4是具有肿瘤和正常痕迹的、微卫星稳定的(mss)样品的另一种示例性洗脱曲线。

图5是具有肿瘤和正常痕迹的、微卫星稳定的(mss)样品的进一步示例性洗脱曲线。

图6是具有肿瘤和正常痕迹的、具有低微卫星不稳定性(msi-l)的样品的一种示例性洗脱曲线。

图7是具有肿瘤和正常痕迹的、具有高微卫星不稳定性(msi-h)的样品的一种示例性洗脱曲线。

图8是具有肿瘤和正常痕迹的、微卫星稳定的(mss)样品的一种示例性洗脱曲线。

图9是具有肿瘤和正常痕迹的、具有高微卫星不稳定性(msi-h)的样品的一种示例性洗脱曲线。

图10是具有肿瘤和正常痕迹的、微卫星稳定的(mss)样品的一种示例性洗脱曲线。

图11是具有肿瘤和正常痕迹的、具有低微卫星不稳定性(msi-l)的样品的一种示例性洗脱曲线。

具体实施方式

诸位发明人现在已经发现，通过使用来自患者的血液样品，无需活检或手术就可以检测实体瘤中的msi。在优选的方面，处理血液样品以通常从血清中获得ctdna，并且通常从血沉棕黄层中获得核dna。最通常地，可以从相同的血液流出物或甚至相同的血液样品中获得ctdna和核dna。然后将如此获得的dna用作扩增一个或多个msi基因座的源材料，并且然后对这些扩增子进行尺寸分析，优选地无需荧光标记，这增加了分析速度并降低了成本。

如本文所用，术语“肿瘤”是指以下项并且可与以下项互换使用：一种或多种癌细胞、癌组织、恶性肿瘤细胞或恶性肿瘤组织，它们可以位于或者发现于人体的一个或多个解剖位置中。如本文所用，术语“施用”药物或癌症治疗是指直接或间接施用药物或癌症治疗。通常通过卫生保健专业人员(例如，医生、护士等)进行药物或癌症治疗的直接施用，并且其中间接施用包括向卫生保健专业人员提供药物或癌症治疗或使卫生保健专业人员可获得药物或癌症治疗用于直接施用(例如，经由注射、口服消费、局部应用等)的步骤。

应当指出的是，如本文所用的术语“患者”包括被诊断为患有病状(例如，癌症)的个体以及为了检测或鉴定病状经历检查和/或测试的个体。因此，患有肿瘤的患者是指诊断为患有癌症的个体以及被怀疑患有癌症的个体二者。如本文所用，术语“提供(provide)”或“提供(providing)”是指并且包括制造、产生、放置、使得能使用、转移或使得即可使用的任何行为。

常规的msi检测系统通常使用从新鲜活检材料中分离的dna和来自非肿瘤组织的匹配的正常对照dna制剂。然后将如此获得的dna用于扩增msi基因座，表1中示出了常见的msi基因座。例如，将两纳克的基因组dna进行扩增并且使用具有聚合物和36cm毛细管的abi3100基因分析仪进行分析，并且所得的正常和测试样品的等位基因模式示于现有技术图1中。不存在于正常样品中而存在于测试样品中的新等位基因(由箭头指示)指示msi。

表1.msi分析系统基因座信息。

¹使用具有聚合物和36cm毛细管的abi3100基因分析仪确定等位基因尺寸。

可能存在这些尺寸范围以外的稀有等位基因。当使用不同的聚合物或仪器配置时，等位基因尺寸可能有所变化。

²tmr＝羧基-四甲基罗丹明；fl＝荧光素；joe＝6-羧基-4′，5′-二氯-2′-7′-二甲氧基荧光素

诸位发明人现在已经发现，与活检或手术相比，可以在简单的并且对患者具有低风险的过程中采用多种材料(除了ffpe样品、新鲜肿瘤样品或肿瘤活检之外)。更具体地，诸位发明人已经发现包括cfdna的任何生物流体都是合适的，并且尤其是全血。有利地，全血将在单个样品中提供循环肿瘤dna以及来自非肿瘤细胞(以及尤其是白细胞)的核dna。更进一步地，应该认识到全血也是cfrna/ctrna的来源，它可以提供对肿瘤状态的进一步了解。图2描绘了用于从血液确定实体瘤中的msi的示例性和示意性流程图。这里，通常以在1-50ml之间、以及更通常地在5-10ml之间的体积从患者获得血液样品。然后将全血样品分成血浆级分和含细胞级分，其中将血沉棕黄层用于分离核‘匹配的正常’dna。从血浆级分中分离ctdna，并且然后使用常规方法在所选择的msi基因座上进行各自的pcr反应以获得扩增子，然后将这些扩增子进行片段尺寸分析。

如将容易理解的，片段尺寸的确定并且能以多种方式进行，并且尺寸确定的所有已知方式都被认为适合用于本文。现有技术图1展示了荧光标记的扩增子的洗脱曲线，而图3-7展示了使用如图2中概述的程序获得的未标记的扩增子的洗脱曲线。更具体地，图3-5描绘了来自mss样品扩增子的洗脱曲线，其中峰具有如通过最大值的位置所证明的基本上相同的位置，并且峰还具有基本上相同的形状。相比之下，图6描绘了来自msi-l样品(即，具有低等级msi的样品)的扩增子的洗脱曲线，其中至少两个峰改变了峰形状、曲线下面积和/或最大值位置(106峰与109峰的比率指示在109处丢失msi等位基因且在106处获得等位基因，而152峰与147峰的比率指示在152和147处的等位基因丢失)。图7描绘了来自msi-l样品的扩增子的另一种洗脱曲线。这里，肿瘤中基本上丢失在294和256处的等位基因，而在125和114处存在等位基因丢失，其中在125处的丢失更加明显。如从mss样品与msi样品的比较中可以看出，色谱图的洗脱曲线中的总体峰形状和峰位置可以指示msi，如下文更详细地进一步描述的。

例如，可以从肿瘤cfdna和核dna扩增msi等位基因，以产生具有在约110(碱基长度)、120、128、150和230的最大值的峰的扩增子。当然，只要此类扩增子具有可以通过峰位移分离或以其他方式区分的峰最大值，则可以产生多种替代性扩增子。应当注意，在采用了简化的分离和检测技术的情况下，由于不同的峰，单碱基差异的分辨率将不明显，然而将卷积到整个峰谱上。然后可以分析这种峰谱以检测最大值(指示长度丢失)位置的位移、形状位移(指示长度分布的变化，其可能是由于不完全丢失或等位基因缩短)、和/或以及相对于匹配的正常样品的峰高的增加或减少(其可能指示等位基因丢失)。如将容易理解的，可以由医学专业人员进行，并且更优选地通过随后将检测msi和/或确定msi类型的算法(通常是机器学习算法)进行这样的峰分析。例如，在cfdna和核dna样品展现出在峰形状、最大值和/或与另一个峰的比率中的两个、三个、四个或更多个变化的情况下，指示msi不稳定性(例如，msi高)。在另一方面，在cfdna和核dna样品展现出在峰形状、最大值和/或与另一个峰的比率中的一个或两个变化的情况下，指示msi不稳定性(例如，msi低)，并且在cfdna和核dna样品展现出在峰形状、最大值和/或与另一个峰的比率中的一个变化或没有变化的情况下，指示msi稳定性(例如，msi低)。

如将容易理解的，在检测到msi不稳定性(低或高)时，将向患者施用适合用于治疗具有msi的癌症的一种或多种治疗剂。例如，合适的药剂包括多种检查点抑制剂(例如，靶向pd-1或ctla4介导的信号传导)、使用重组疫苗(例如，病毒、酵母或细菌)的免疫疗法、dna损伤剂(例如5-fu和/或奥沙利铂、dna烷化剂或嵌入剂等)和/或干扰dna修复(例如，干扰错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复和同源性定向修复)的药剂。

无细胞dna/rna的分离和扩增

设想了分离和扩增无细胞dna/rna的任何合适的方法。最通常地，无细胞dna/rna是从体液(例如全血)中分离的，该体液是在合适的条件(包括稳定无细胞rna的条件)下处理的。优选地，从相同的样品或患者体液流出物中同时分离无细胞dna和rna二者。然而，还设想了可以将体液样品分为可以分别从其中分离dna或rna的两个或更多个较小样品。一旦与非核酸组分分离，然后就优选地使用实时定量pcr或实时定量rt-pcr对无细胞dna或rna进行定量。

根据组学分析的目的，可以在任何一个或多个所需时间点获得患者的体液。例如，患者的体液可以在确认患者患有肿瘤之前和/或之后获得、和/或此后周期性地(例如，每周、每月等)获得，以便将无细胞dna/rna数据与癌症的预后和msi状态相关联。在一些实施例中，患者的体液可以在癌症治疗之前和之后(例如，化学疗法、放射疗法、药物治疗、癌症免疫疗法等之前/之后)从患者获得。虽然这可能根据治疗类型和/或癌症类型而变，但是患者的体液可以在癌症治疗后至少24小时、至少3天、至少7天时获得。为了进行更准确的比较，在癌症治疗之前来自患者的体液可以在开始癌症治疗之前小于1小时、之前小于6小时、之前小于24小时、小于一周时获得。另外，可以在癌症治疗之前和/或之后的时段期间(例如，在24小时后每天一次，持续7天等)获得患者体液的多个样品。

另外地或可替代地，可以获得健康个体的体液以比较无细胞dna的序列/修饰，和/或无细胞rna的量/亚型表达。如本文所用，健康个体是指没有肿瘤的个体。优选地，健康个体可以在与患者具有共同特征(例如，年龄、性别、种族、饮食、生活环境、家族史等)的人群中选择。

设想了分离无细胞dna/rna的任何合适的方法。例如，在dna分离的一种示例性方法中，接受作为10ml吸到试管中的全血的样本。可以使用磁珠将无细胞dna与来自单核小体和双核小体复合物中的其他物分离，这些磁珠可以分离出大小在100-300bp之间的无细胞dna。在rna分离的另一实例中，分别接受作为10ml吸到无细胞rna管中或吸到含有rna稳定剂的无细胞管中的全血的样本。有利地，无细胞rna在无细胞rnabct管中的全血中稳定7天，而无细胞rna在无细胞dnabct管中的全血中稳定14天，从而使得有时间在无细胞rna不降解的情况下运输来自世界范围内的位置的患者样品。此外，通常优选使用不使或基本上不使血细胞裂解(例如，裂解等于或小于1％、或等于或小于0.1％、或等于或小于0.01％、或等于或小于0.001％)的rna稳定剂分离无细胞rna。从不同的角度来看，在rna稳定试剂与血液合并后，这些试剂不会导致血清或血浆中的rna量实质性增加(例如，总rna增加不超过10％、或不超过5％、或不超过2％、或不超过1％)。同样，这些试剂也会保存血液中的细胞的物理完整性，以减少或甚至消除在血细胞中发现的细胞rna的释放。此类保存可以呈可能已经被分离或可能未被分离的所收集血液的形式。在不太优选的方面，所设想的试剂将使无细胞rna在除了血液之外的所收集组织中稳定至少2天、更优选至少5天、且最优选至少7天。当然，应该认识到许多其他收集方式也被认为是适当的，并且可以将无细胞rna至少部分地纯化或吸附到固相上，以便在进一步加工之前增加稳定性。类似地，可以使用可商购获得的试剂和方法分离无细胞dna和ctdna，并且特别优选的试剂盒和方法包括cell-freednabct(斯特莱克公司(streckinc.)，内布拉斯加州拉维斯塔市第109街道南7002号，邮编68128(7002s.109thstreet,lavista,ne68128))。

因此，能以许多方式完成血浆的分级和无细胞dna/rna的提取。在一个示例性优选方面中，将10ml管中的全血以1600rcf离心20分钟将血浆分级(fractionate)。然后将如此获得的血浆分离并且以16,000rcf离心10分钟，以去除细胞碎片。当然，各种替代性离心方案也被认为是合适的，只要离心不会导致实质性细胞裂解(例如，所有细胞中裂解不超过1％、或不超过0.1％、或不超过0.01％、或不超过0.001％)即可。使用凯杰公司(qiagen)试剂从2ml血浆中提取无细胞rna。提取方案被设计为去除潜在的污染血细胞、其他杂质，并且在提取期间维持核酸的稳定性。将所有核酸保存在带条形码的矩阵存储管中，其中将dna储存在-4℃，并且将rna储存在-80℃或逆转录为cdna，然后将该cdna储存在-4℃。值得注意的是，可以在进一步处理之前将如此分离的无细胞rna冷冻。

如将容易理解的，可以按照熟知的方案将含细胞级分(并且尤其是血沉棕黄层(含有大部分的白细胞))用于分离核dna(参见例如，jtranslmed.[转化医学杂志]2011年6月10；9:91)。可替代地或另外地，可以使用多种可商购获得的试剂盒，并且这些试剂盒包括qiaampdnabloodmini试剂盒(凯杰公司(qiagen)，加利福尼亚州雷德伍德城海港大街1700号第3层，邮编94063(1700seaportblvd,3rdfloor,redwoodcity,ca94063))。

来自ctdna的msi-基因座、扩增和尺寸确定

关于合适的msi基因座，诸位发明人设想了任何已知的msi基因座被认为适合在本文中使用。然而，特别优选的msi基因座包括单核苷酸重复标记和二核苷酸重复标记，并且最优选与错配修复缺陷相关的那些。因此，并且从不同的角度看，所设想的重复标记是准单态的(即，对于给定的标记，几乎所有个体(例如，至少90％、更通常地至少95％的个体)对相同的共同等位基因是纯合的)。合适的基因座描述于us6150100、us7662595、us2003/0113723、us2015/0337388和wo2017/112738中，将这些专利全部通过引用并入本文。因此，示例性重复包括nr-21、bat-26、bat-25、nr-27、nr-24、d2s123、d5s346、d17s250、bat40、mono-27、pentac、pentad、d18535、d1s2883等。

根据特定的重复序列/msi基因座，扩增条件可能如可以预期的有所变化。然而，将容易地确定用于特定msi基因座的特定pcr条件而无需过多的实验。例如，用于扩增nr-21、bat26、bat-25、nr-24和mono-27的pcr条件和试剂描述于来自普洛麦格公司(promegacorp)的可商购获得的msi分析系统的产品手册中。在此情境中，应当理解，扩增试剂可以包括荧光或以其他方式标记的核苷酸，或者可以在没有可检测标记的情况下进行。因此，检测方式将有所变化。

通常，对于扩增子的尺寸确定，设想将对扩增产物进行色谱步骤，该色谱步骤提供在扩增子的尺寸范围内的足够分辨率。例如，可以使用毛细管电泳(例如，使用abiprism310或appliedbiosystems3130基因分析仪)、聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、基于芯片的微流体电泳(methodsmolbiol.[方法分子生物学]2013；919:287-96)和变性高效液相色谱来进行合适的片段尺寸确定。通常，设想了与患者匹配的正常样品平行进行尺寸确定以检测等位基因尺寸分布的位移。这样的尺寸确定和方法是本领域熟知的，并且不需要过多的实验。

通过使用非荧光扩增子，可以向所设想的系统和方法添加另外的改进。从现有技术图1可以看出，在单个碱基对水平上分辨出每个扩增子尺寸的荧光信号，并且这些荧光信号产生独立的信号。然而，当采用其他检测方法(如uv检测、安培检测等)时，这种分辨率通常会丢失。然而，当使用非荧光方法时，单独的峰将叠加到最终信号上，其可以如方程式i和ii所示的从数学上来陈述

f(x)＝[f1(x),f2(x),...,fn(x)]方程式i

可以将最终的标度信号表示为独立信号的叠加：

ff＝[ff1,ff2,...,ffn]方程式ii

g(x)＝ff.f(x)

将每个单独的峰的最终信号(根据上述方程式计算的值)与截止值30％进行比较。如果该值为>＝30％，则单独的峰将被确定为位移。两个或更多个峰位移将确定样品的状态为msi高(参见图8-11)。

诸位发明人现在设想，只要有足够的训练数据可用，就可以用独立成分分析来恢复独立的信号。尽管可以采用线性叠加和其他方法，但是神经网络可能是更有利的选择，因为可以将信号转换为固定尺寸特征。

例如，在基于规则的系统中，可以使用以下程序：(a)找到参考样品和测试样品的所有最大值和最小值；(b)确保峰的质量；(c)找到参考样品的主峰；(d)找到测试样品的、基于参考峰的主峰；(e)计算与每个主峰相关的信息，如峰值比率(之前，当前)、(当前，下一个)、峰面积比率和峰宽；(f)计算每个测试主峰的概率；以及(g)基于峰概率评价msi-h、msi-l或mss概率。这种方法通常将不需要训练样品，并且可以用于改进对数据的理解。

在另一个更优选的实例中，可以采用基于手工特征的系统，其中特征向量包括每个主峰的以下量：峰值、峰宽、峰面积、在(之前，当前)、(当前，下一个)之间的峰值比率、以及在(之前，当前)、(当前，下一个)之间的峰面积比率。因此，对于5个主峰，在本实例中的特征向量尺寸将是5*5＝25。可以使用支持向量方法(supportingvectormethod)或随机森林(randomforest)进行分类。最常见的是，训练样品大小将超过100个样品。

可替代地，可以采用基于原始特征的系统。例如，特征向量可以包括所有荧光读数(具有三次样条插值)，使得数据以碱基对尺寸(在[80，250]之间，特征尺寸为170)均匀分布。可以将暹罗神经网络(siameseneuralnetwork)与参考样品一起用作一个完全连接的网络，并且将测试样品用作第二完全连接的网络。最常见的是，训练样品大小将超过1,000个样品。图8-11展示了在不使用荧光标记的情况下的扩增子的洗脱曲线(例如，在agilent2100生物分析仪上基于芯片的微流体电泳)。这里，获得了来自患有实体瘤(结直肠癌)和具有已知肿瘤msi状态(以前使用常规方法从新鲜肿瘤样品建立的)的患者的血液样品。如上所述制备cfdna和核dna，并且按照已知方法扩增所选择的msi等位基因。实施如上所述的图像分析，并且在图8-11中示例性地展示了在洗脱曲线中检测到的显著峰特征。更具体地，图8和10展示了微卫星稳定(mss)的实例。图9展示了高微卫星不稳定性(msi-h)的一个实例，而图11展示了低微卫星不稳定性(msi-l)的一个实例。

用于cfrna分析的其他感兴趣的序列

诸位发明人进一步设想肿瘤细胞和/或与肿瘤细胞相互作用或在肿瘤细胞周围的一些免疫细胞将无细胞rna释放到患者的体液中，并且因此可以如与健康个体相比增加患者体液中特定无细胞dna/rna的量。如上所述，患者体液包括但不限于患者的血液、血清、血浆、粘液、脑脊液、腹水、唾液和尿液。可替代地，应该注意的是各种其他体液也被认为是适当的，只要无细胞dna/rna存在于此类流体中即可。患者体液可以是新鲜的，或者是保存的/冷冻的。适当的体液包括唾液、腹水、脊髓液、尿液等，这些体液可以是新鲜的或者是保存的/冷冻的。

无细胞rna可以包括在人的体液中循环而没有被封闭在细胞体或细胞核中的任何类型的dna/rna。最通常地，无细胞dna/rna的来源是肿瘤细胞。然而，还设想无细胞dna/rna的来源是免疫细胞(例如，nk细胞、t细胞、巨噬细胞等)。因此，无细胞dna/rna可以是循环的肿瘤dna/rna(ctdna/rna)和/或循环的游离dna/rna(cfdna/rna，不源自肿瘤的循环核酸)。然而不希望受特定理论束缚，设想当肿瘤细胞与免疫细胞相互作用时或者当肿瘤细胞经历细胞死亡(例如，坏死、细胞凋亡、自体吞噬等)时，来源于肿瘤细胞的无细胞dna/rna的释放可能增加。因此，在一些实施例中，可以将无细胞dna/rna封闭在小泡结构中(例如，经由细胞质物质的外泌体释放)，使得它可以受到保护免受某种类型的体液中的核酸酶(例如，rna酶)活性。但是，还设想在其他方面，该无细胞dna/rna是裸dna/rna，该裸dna/rna没有被封闭在任何膜结构中，但可以自身呈稳定形式或者经由与一种或多种非核苷酸分子(例如，任何rna结合蛋白等)的相互作用而稳定化。

鉴于上述情况，设想无细胞dna/rna可以是可以从癌细胞或免疫细胞释放的任何类型的dna/rna。因此，无细胞dna可以包括任何完整的或片段化的基因组dna或线粒体dna，并且无细胞rna可以包括mrna、trna、微小rna、小干扰rna、长的非编码rna(lncrna)。最通常地，无细胞dna是通常具有至少50个碱基对(bp)、100个碱基对(bp)、200bp、500bp或1kbp的长度的片段化dna。而且，设想无细胞rna是mrna的全长或片段(例如，全长的至少70％、全长的至少50％、全长的至少30％等)。尽管无细胞dna/rna可以包括编码任何细胞、细胞外蛋白质或非蛋白质元素的任何类型的dna/rna，优选的是至少一些无细胞dna/rna编码一种或多种癌症相关蛋白或炎症相关蛋白。在另一个实例中，可替代地或另外地设想的cfdna/mrna是编码炎症相关蛋白的全长或片段的那些或其片段，这些炎症相关蛋白包括但不限于hmgb1、hmgb2、hmgb3、muc1、vwf、mmp、crp、pbef1、tnf-α、tgf-β、pdgfa、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、fgf、g-csf、gm-csf、ifn-γ、ip-10、mcp-1、pdgf和htert，并且在又另一个实例中，无细胞mrna编码hmgb1的全长或片段。在仍另一个实例中，无细胞dna/mrna是编码dna修复相关蛋白或rna修复相关蛋白的全长或片段的那些或其片段，例如碱基切除修复(ber)相关基因、错配修复(mmr)相关基因、核苷酸切除修复(ner)相关基因、同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)相关基因。

在需要时，无细胞dna/mrna是编码与疾病不相关的基因(例如，管家基因)的全长或片段的那些或其片段，该与疾病不相关的基因包括与以下相关的那些：转录因子(例如，atf1、atf2、atf4、atf6、atf7、atfip、btf3、e2f4、erh、hmgb1、ilf2、ier2、jund、tceb2等)、阻遏物(例如，puf60)、rna剪接(例如，bat1、hnrpd、hnrpk、pabpn1、srsf3等)、翻译因子(eif1、eif1ad、eif1b、eif2a、eif2ak1、eif2ak3、eif2ak4、eif2b2、eif2b3、eif2b4、eif2s2、eif3a等)、trna合成酶(例如，aars、cars、dars、fars、gars、hars、iars、kars、mars等)、rna结合蛋白(例如，elavl1等)、核糖体蛋白(例如，rpl5、rpl8、rpl9、rpl10、rpl11、rpl14、rpl25等)、线粒体核糖体蛋白(例如，mrpl9、mrpl1、mrpl10、mrpl11、mrpl12、mrpl13、mrpl14等)、rna聚合酶(例如，polr1c、polr1d、polr1e、polr2a、polr2b、polr2c、polr2d、polr3c等)、蛋白质加工(例如，ppid、ppi3、ppif、canx、capn1、naca、pfdn2、snx2、ss41、sumo1等)、热激蛋白(例如，hspa4、hspa5、hsbp1等)、组蛋白(例如，hist1hsbc、h1fx等)、细胞周期(例如，arhgap35、rab10、rab11a、ccny、ccnl、ppp1ca、rad1、rad17等)、碳水化合物代谢(例如，aldoa、gsk3a、pgk1、pgam5等)、脂质代谢(例如，hadha)、柠檬酸循环(例如，sdha、sdhb等)、氨基酸代谢(例如，comt等)、nadh脱氢酶(例如，ndufa2等)、细胞色素c氧化酶(例如，cox5b、cox8、cox11等)、atp酶(例如，atp2c1、atp5f1等)、溶酶体(例如，ctsd、cstb、lamp1等)、蛋白酶(例如，psma1、uba1等)、细胞支架蛋白(例如，anxa6、arpc2等)、和细胞器合成(例如，bloc1s1、ap2a1等)。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的范围中之外，本发明主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含(comprises和comprising)”应当被解释为以非排他性方式指代元素、组分或步骤，从而表明所提及的元素、组分或步骤可以与未明确提及的其他元素、组分或步骤一起存在或使用或组合。如本文的说明书和贯穿随后的整个权利要求书中所使用，“一个”、“一种”以及“该”的含义包括复数指示物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，除非上下文清楚地另外指明。在本说明书权利要求书涉及选自由a、b、c……和n组成的组中的至少一种的情况下，该文字应当被解释为只需要该组中的一个元素，而不是a加n、或b加n等。