用于单向核酸测序的组合物和方法与流程

背景核酸测序是可以用于提供核酸样品的序列信息的过程。此类序列信息可能有助于诊断和/或治疗受试者。例如，受试者的核酸序列可以用于鉴别、诊断和潜在地开发针对遗传疾病的治疗。作为另一个实例，对病原体的研究可能导致传染性疾病的治疗。存在可用于对核酸进行测序的方法可用。然而，此类方法是昂贵的，并且可能无法在一段时间内以诊断和/或治疗受试者可能必需的准确度提供序列信息。概述使单链核酸分子穿过纳米孔的核酸测序的方法的敏感性可能不足或另外不足为诊断和/或治疗目的提供日期。构成核酸分子的核酸碱基(例如，腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和/或尿嘧啶(u))可能无法提供彼此足够独特信号。具体而言，嘌呤(即，a和g)具有彼此相似的大小、形状和电荷，并且在一些情况下提供不足的独特信号。而且，嘧啶(即，c、t和u)具有彼此相似的大小、形状和电荷，并且在一些情况下提供不足的独特信号。本文中认识到需要用于核酸分子鉴别和核酸测序的改进方法。在一些实施方案中，核苷酸掺入事件(例如，核苷酸掺入与模板链互补的核酸链中)向纳米孔呈递标签和/或从被纳米孔检测的核苷酸释放标签。可以鉴别掺入的碱基(即，a、c、g、t或u)，因为对于每种类型的核苷酸(即，a、c、g、t或u)，释放和/或呈递独特的标签。在一些实施方案中，基于检测到标签与纳米孔相互作用的时间段，将标签归因于成功掺入的核苷酸。该时间段可以长于与核苷酸标签通过纳米孔的自由流动相关的时间段。成功掺入的核苷酸标签的检测时间段也可以长于未掺入的核苷酸(例如，与模板链错配的核苷酸)的时间段。在一些情况下，聚合酶与纳米孔缔合(例如，与纳米孔共价连接)，且聚合酶进行核苷酸掺入事件。当标记的核苷酸与聚合酶缔合时，可以通过纳米孔检测到标签。在一些情况下，未掺入的标记的核苷酸穿过纳米孔。该方法可以基于纳米孔检测到标记的核苷酸的时间长度来区分与未掺入的核苷酸缔合的标签和与掺入的核苷酸缔合的标签。在一个实施方案中，纳米孔检测到未掺入的核苷酸少于约1毫秒，并且纳米孔检测到掺入的核苷酸至少约1毫秒。在一些实施方案中，所述聚合酶具有缓慢的动力学步骤，其中标签可被纳米孔检测到至少1毫秒，其中平均检测时间为约100ms。所述聚合酶可以是突变的phi29dna聚合酶。可以将所述聚合酶突变以降低聚合酶将核苷酸掺入核酸链(例如，生长中的核酸链)的速率。在一些情况下，可以通过使核苷酸和/或模板链官能化以提供空间位阻，诸如例如通过模板核酸链的甲基化，来降低核苷酸掺入核酸链的速率。在一些情况下，通过掺入甲基化的核苷酸降低该速率。在一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中，其中标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，可借助纳米孔检测所述标签；(b)借助聚合酶实施聚合反应，由此将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中；和(c)在掺入单个标记的核苷酸期间和/或之后，借助纳米孔检测与单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当核苷酸与聚合酶缔合时，借助纳米孔检测到标签。在一些实施方案中，在与聚合酶缔合的同时多次检测到标签。在一些实施方案中，将电极在标签检测时段之间再充电。在一些实施方案中，所述方法基于纳米孔检测到标记的核苷酸的时间长度来区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔检测到未掺入的标记的核苷酸的时间的比率为至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000或10,000。在一些实施方案中，与掺入的核苷酸缔合的标签与纳米孔相互作用(并借助纳米孔检测到)的时间段和与未掺入的核苷酸缔合的标签与纳米孔相互作用的时间段的比率为至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000或10,000。在一些实施方案中，核苷酸与聚合酶缔合至少约1毫秒的平均(或平均)时间段。在一些实施方案中，当核苷酸不与聚合酶缔合时，标记的核苷酸在小于1毫秒(ms)内穿过纳米孔。在一些实施方案中，所述标签具有被选择为可被纳米孔检测到的长度。在一些实施方案中，第一标记的核苷酸的掺入不干扰与第二标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测。在一些实施方案中，与第一标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测不干扰第二标记的核苷酸的掺入。在一些实施方案中，纳米孔能够以至少95%的准确度区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔能够以至少99%的准确度区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，当标签从单个标记的核苷酸释放时，检测到与单个标记的核苷酸缔合的标签。在一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中，其中标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，可借助纳米孔检测所述标签；(b)借助酶将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与源自核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中；和(c)在掺入单个标记的核苷酸期间，借助纳米孔，区分与单个标记的核苷酸缔合的标签与一个或多个与一个或多个未掺入的单个标记的核苷酸缔合的标签。在一些实施方案中，所述酶是核酸聚合酶或可以基于模板聚合物延伸新合成的链的任何酶。在一些实施方案中，基于借助纳米孔检测到(b)中掺入的单个标记的核苷酸和未掺入的单个标记的核苷酸的时间长度和/或时间比，区分(b)中掺入的单个标记的核苷酸与未掺入的单个标记的核苷酸。在一个方面，借助膜中的纳米孔对核酸进行测序的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中，其中标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有可被纳米孔检测到的标签；(b)将标记的核苷酸掺入生长中的核酸链中，其中，在掺入期间，与标记的核苷酸的单个标记的核苷酸缔合的标签位于纳米孔的至少一部分中或附近，其中纳米孔可检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔可检测到未掺入的标签的时间的比率为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、10,000；和(c)借助纳米孔检测标签。在一些实施方案中，纳米孔可检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔可检测到未掺入的标签的时间的比率为至少约1,1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000或10,000。在一些实施方案中，标签在掺入核苷酸后保持与单个核苷酸缔合。在一些实施方案中，与单个核苷酸缔合的标签在掺入核苷酸后被释放。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从纳米孔排出标签。在一些实施方案中，标签在标签进入纳米孔的相反方向上被排出。在一些实施方案中，标签在纳米孔中停留至少约100ms。在一些实施方案中，标签在纳米孔中停留至少约10ms。在一些实施方案中，标签在纳米孔中停留至少约1ms。在一些实施方案中，标记的核苷酸以每秒最多约1个核苷酸的速率掺入。在一些实施方案中，纳米孔用电压脉冲排出标签分子。在一些实施方案中，标签分子至少99%可能用电压脉冲排出。在一些实施方案中，纳米孔在一段时间内排出标签分子，使得两个标签分子不同时存在于纳米孔中。在一些实施方案中，纳米孔在一段时间内排出标签分子，使得两个标签分子同时存在于纳米孔中的概率为至多1%。在一些实施方案中，标签具有小于约1.4nm的直径。在一些实施方案中，在标签附接至核苷酸的同时，借助纳米孔检测与掺入的标记的核苷酸缔合的每个标签。在一些实施方案中，当标签从单个标记的核苷酸释放时，检测到与单个标记的核苷酸缔合的标签。在一个方面，用于对核酸样品进行测序的芯片包括：多个纳米孔，所述多个纳米孔中的纳米孔在与电极相邻或邻近设置的膜中具有至少一个纳米孔，其中，在将标记的核苷酸掺入生长中的核酸链期间，每个纳米孔检测与单个标记的核苷酸缔合的标签。在一些实施方案中，所述纳米孔是单独可寻址的。在一些实施方案中，单个纳米孔在随后的标签通过纳米孔或在纳米孔邻近穿过期间检测与核苷酸缔合的标签。在一些实施方案中，芯片每平方毫米包含至少500个单独可寻址的电极。在一些实施方案中，芯片每平方毫米包含至少50个单独可寻址的电极。在一些实施方案中，芯片至少部分基于纳米孔检测到标记的核苷酸的时间长度来区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔可检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔可检测到未掺入的标签的时间的比率为至少约1.5。在一些实施方案中，第一标记的核苷酸的掺入不干扰与第二标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测。在一些实施方案中，与第一标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测不干扰第二标记的核苷酸的掺入。在一些实施方案中，纳米孔能够以至少95%的准确度区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔能够以至少99%的准确度区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，电极是集成电路的一部分。在一些实施方案中，电极与集成电路耦合。在一些实施方案中，在标签附接至核苷酸的同时，借助纳米孔检测与掺入的标记的核苷酸缔合的每个标签。在一些实施方案中，当标签从单个标记的核苷酸释放时，检测到与单个标记的核苷酸缔合的标签。在一个方面，用于对核酸样品进行测序的芯片包括：多个纳米孔，其中所述多个纳米孔中的纳米孔在与电极相邻设置的膜中含有至少一个纳米孔，其中在将包含标签物质的核酸分子掺入生长中的核酸链中期间，每个纳米孔能够检测到标签物质，其中，纳米孔可检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔可检测到未掺入的标签的时间的比率为至少约1.5。在一些实施方案中，多个纳米孔是单独可寻址的。在一些实施方案中，所述标签物质在掺入后不穿过纳米孔。在一些实施方案中，芯片被配置为从纳米孔排出标签物质。在一些实施方案中，纳米孔用电压脉冲排出标签物质。在一些实施方案中，电极是集成电路的一部分。在一些实施方案中，电极与集成电路耦合。在一些实施方案中，在标签附接至核苷酸的同时，借助纳米孔检测与掺入的标记的核苷酸缔合的每个标签。在一些实施方案中，检测核酸分子的标签物质，而没有标签物质从核酸分子释放。在一个方面，用于对核酸样品进行测序的系统包括：(a)包含一个或多个纳米孔装置的芯片，所述一个或多个纳米孔装置各自在与电极相邻的膜中包含纳米孔，其中，在通过聚合酶掺入标记的核苷酸期间，纳米孔装置检测与单个标记的核苷酸缔合的标签；和(b)与芯片耦合的处理器，其中所述处理器被编程为基于从所述纳米孔装置接收的电信号来帮助表征所述核酸样品的核酸序列。在一些实施方案中，纳米孔装置在随后的标签通过纳米孔或在纳米孔邻近行进期间检测与单个标记的核苷酸缔合的标签。在一些实施方案中，纳米孔装置包含单独可寻址的纳米孔。在一些实施方案中，芯片每平方毫米包含至少500个单独可寻址的电极。在一些实施方案中，芯片每平方毫米包含至少50个单独可寻址的电极。在一些实施方案中，芯片至少部分基于纳米孔检测到标记的核苷酸的时间长度来区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔可检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔可检测到未掺入的标签的时间的比率为至少约1.5。在一些实施方案中，第一标记的核苷酸的掺入不干扰与第二标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测。在一些实施方案中，与第一标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测不干扰第二标记的核苷酸的掺入。在一些实施方案中，纳米孔能够以至少95%的准确度区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔能够以至少99%的准确度区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，电极是集成电路的一部分。在一些实施方案中，电极与集成电路耦合。在一些实施方案中，在标签附接至核苷酸的同时，借助纳米孔检测与掺入的标记的核苷酸缔合的每个标签。在一些实施方案中，当标签从单个标记的核苷酸释放时，检测到与单个标记的核苷酸缔合的标签。在一些实施方案中，使用给定的驱动力，诸如施加至纳米孔或含有纳米孔的膜的电势(v+)，将标签引导进入并通过纳米孔的至少一部分。可以将标签从纳米孔的开口引导入纳米孔。然后可以反转驱动力(例如，施加相反极性的电势，或v-)以通过开口将标签的至少一部分从纳米孔排出。然后可以再次施加驱动力(例如，v+)以将标签的至少一部分通过开口驱动至纳米孔中。或者，可以反转标签的极性，并且可以使用包括v-、v+和v-的电势的序列。这可以增加可以借助纳米孔检测到标签的时间段。在一些实施方案中，纳米孔和/或标签被配置为提供能量地形，使得在纳米孔中，与核苷酸缔合的标签比另一方向(例如，出孔)更可能在一个方向(例如，入孔)移动)。在一些实施方案中，模板样品链中修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)的检测可以通过在核苷酸标签的核苷酸部分掺入新合成的链期间和/或之后标记的核苷酸的标签在与聚合酶缔合的同时被纳米孔检测到的时间的差异来检测。在一些情况下，当样品序列的相对核苷酸是甲基化的核苷酸时，与非甲基化的核苷酸相比，核苷酸标签与酶缔合的时间更长。本文所述的标记的核苷酸的实例可以是用可切割标签修饰的任何天然存在的核苷酸或用可切割标签修饰的合成的非天然核苷酸类似物。例如，用可切割或不可切割标签修饰的通用碱基可用于简单地计数样品链中碱基的数目。本文所述的标记的核苷酸的实例可以是可以作为二聚体单位延伸的二聚体核苷酸或二聚体核苷酸类似物，并且标签基于与聚合酶缔合的时间和纳米孔装置检测到的信号水平报告二聚体核苷酸的组合二聚体组成。尽管标签与酶缔合的时间可用于区分掺入的核苷酸和未掺入的核苷酸，但独特的电流水平和/或纳米孔中的标签对施加的电势或变化的施加电势的电响应允许区分与不同核苷酸缔合的标签。在一个方面，用于对核酸进行测序的方法包括将交流电(ac)波形施加至纳米孔和传感电极附近的电路，其中当波形具有第一极性时，检测到与掺入与模板核酸链互补的生长中的核酸链中的核苷酸缔合的标签，且当波形具有第二极性时，将电极再充电。在另一个方面，用于对核酸样品测序的方法包括：(a)将一个或多个标记的核苷酸提供至与电极相邻的膜中的纳米孔；(b)将所述一个或多个标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与所述核酸分子互补的链中；和(c)借助施加至所述电极的交流电(ac)波形一次或多次检测与所述标记的核苷酸缔合的标签，其中在所述标签附接至掺入所述链中的所述单个标记的核苷酸的同时检测所述标签。在一些实施方案中，所述波形使得电极在至少约1秒、10秒、30秒、1分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或1个月的时间段内不耗尽。在一些实施方案中，通过测量的电流和波形在各种电压下施加的电压之间的关系确定标签的身份。在一些实施方案中，所述核苷酸包括腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)、尿嘧啶(u)或其任何衍生物。在一些实施方案中，通过当碱基被甲基化时比当碱基未被碱基化时更长时间段检测到标签来确定模板核酸链的碱基的甲基化。在一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔测定核酸或其区段的长度的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中具有至少两个不同的碱基的核苷酸含有与核苷酸偶联的相同标签，可借助所述纳米孔检测所述标签；(b)借助聚合酶实施聚合反应，由此将所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自所述核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中；和(c)在掺入所述单个标记的核苷酸期间或之后，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸缔合的标签。在一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔测定核酸或其区段的长度的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，所述标签能够相对于当不存在标签时的电流降低流过所述纳米孔的电流的幅度；(b)借助聚合酶实施聚合反应，由此将所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自所述核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中，和降低流过所述纳米孔的电流的幅度；和(c)借助所述纳米孔检测掺入所述单个标记的核苷酸之间的时间段。在一些实施方案中，流过所述纳米孔的电流的幅度返回至在掺入所述单个标记的核苷酸之间的时间段期间的最大电流的至少80%。在一些实施方案中，所有核苷酸都具有与核苷酸偶联的相同标签。在一些实施方案中，所述核苷酸中的至少一些具有鉴别核苷酸的标签。在一些实施方案中，所述核苷酸中的至多20%具有鉴别核苷酸的标签。在一些实施方案中，所有核苷酸都被鉴别为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和/或尿嘧啶(u)。在一些实施方案中，所有核酸或其区段都是短串联重复区(str)。在一个方面，用于组装具有多个亚基的蛋白的方法包括：(a)提供多个第一亚基；(b)提供多个第二亚基，其中相对于第一亚基修饰第二亚基；(c)使第一亚基与第二亚基以第一比率接触，以形成多种具有第一亚基和第二亚基的蛋白，其中所述多个蛋白具有多种第一亚基与第二亚基的比率；(d)分级分离多种蛋白以富集具有第二比率的第一亚基与第二亚基的蛋白，其中第二比率是每(n-1)个第一亚基一个第二亚基，其中‘n’是构成蛋白的亚基的数量。在一些实施方案中，所述蛋白是纳米孔。在一些实施方案中，所述纳米孔与α-溶血素至少80%同源。在一些实施方案中，第一亚基或第二亚基包含纯化标签。在一些实施方案中，纯化标签是聚组氨酸标签。在一些实施方案中，使用离子交换色谱法进行分级分离。在一些实施方案中，第二比率是每6个第一亚基1个第二亚基。在一些实施方案中，第二比率是每5个第一亚基2个第二亚基，且单个聚合酶附接至每个第二亚基。在一些实施方案中，第二亚基包含化学反应性部分，且该方法进一步包括(e)进行反应以将实体附接至化学反应性部分。在一些实施方案中，蛋白是纳米孔，且实体是聚合酶。在一些实施方案中，第一亚基是野生型。在一些实施方案中，第一亚基和/或第二亚基是重组的。在一些实施方案中，第一比率近似等于第二比率。在一些实施方案中，第一比率大于第二比率。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将具有第二比率亚基的蛋白插入双层中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括借助具有第二比率亚基的蛋白对核酸分子进行测序。在另一个方面，纳米孔包含多个亚基，其中聚合酶附接至所述亚基之一，且所述亚基中的至少一个且少于全部包含第一纯化标签。在一些实施方案中，所述纳米孔与α-溶血素至少80%同源。在一些实施方案中，所述亚基全部都包含第一纯化标签或第二纯化标签。在一些实施方案中，第一纯化标签是聚组氨酸标签。在一些实施方案中，第一纯化标签在具有附接的聚合酶的亚基上。在一些实施方案中，第一纯化标签在没有附接的聚合酶的亚基上。在另一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，可借助所述纳米孔检测所述标签；(b)借助聚合酶实施聚合反应，由此将所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自所述核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中；(c)在掺入所述单个标记的核苷酸期间，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当所述核苷酸与所述聚合酶缔合时，借助所述纳米孔检测到所述标签，和其中所述检测包括：(i)提供跨所述纳米孔施加的电压，和(ii)在所述施加的电压下用所述传感电极测量电流；和(d)校准所述施加的电压。在一些实施方案中，所述校准包括：(i)测量所述标签分子的多个逃逸电压，(ii)计算测量的逃逸电压和参考点之间的差，和(iii)将施加的电压偏移计算的差。在一些实施方案中，估算预期逃逸电压相对于时间的分布。在一些实施方案中，参考点是测量的逃逸电压的平均值或中值。在一些实施方案中，所述方法除去检测到的预期逃逸电压分布中的变化。在一些实施方案中，所述方法在各自与传感电极相邻的多个独立可寻址的纳米孔上进行。在一些实施方案中，施加的电压随着时间减小。在一些实施方案中，标签在纳米孔中的存在降低在施加的电压下用传感电极测量的电流。在一些实施方案中，标记的核苷酸包含多个不同的标签，并且所述方法检测多个不同的标签中的每个。在一些实施方案中，与进行步骤(a)-(c)相比，(d)增加方法的准确度。在一些实施方案中，(d)补偿电化学条件随着时间的变化。在一些实施方案中，(d)在具有多个纳米孔的装置中补偿具有不同电化学条件的不同纳米孔。在一些实施方案中，(d)为该方法的每种性能补偿不同的电化学条件。在一些实施方案中，所述方法进一步包括(e)校准电流增益的变化和/或电流偏移的变化。在一些实施方案中，在与所述聚合酶缔合的同时多次检测到所述标签。在一些实施方案中，将电极在标签检测时段之间再充电。在一些实施方案中，所述方法基于所述纳米孔检测到所述标记的核苷酸的时间长度来区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在另一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括：(a)从核酸样品除去重复核酸序列以提供单链核酸分子用于测序；(b)将标记的核苷酸提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，可借助所述纳米孔检测所述标签；(c)借助聚合酶实施聚合反应，由此将所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与单链核酸分子互补的生长中的链中；和(d)在掺入所述单个标记的核苷酸期间，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当所述核苷酸与所述聚合酶缔合时，借助所述纳米孔检测到所述标签。在一些实施方案中，重复核酸序列包含至少20个连续的核酸碱基。在一些实施方案中，重复核酸序列包含至少200个连续的核酸碱基。在一些实施方案中，重复核酸序列包含至少20个连续的核酸碱基的重复亚基。在一些实施方案中，重复核酸序列包含至少200个连续的核酸碱基的重复亚基。在一些实施方案中，通过和与重复核酸序列互补的核酸序列杂交来除去重复核酸序列。在一些实施方案中，将与重复核酸序列互补的核酸序列固定在固体支持物上。在一些实施方案中，所述固体支持物是表面。在一些实施方案中，所述固体支持物是珠粒。在一些实施方案中，与重复核酸序列互补的核酸序列包含cot-1dna。在一些实施方案中，cot-1dna富含具有在约50至约100个核酸碱基之间的长度的重复核酸序列。在另一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，可借助所述纳米孔检测所述标签；(b)借助通过接头与纳米孔附接的聚合酶实施聚合反应，由此将所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自所述核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中；和(c)在掺入所述单个标记的核苷酸期间，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当所述核苷酸与所述聚合酶缔合时，借助所述纳米孔检测到所述标签。在一些实施方案中，接头是柔性的。在一些实施方案中，接头为至少5纳米长。在一些实施方案中，接头是直接附接。在一些实施方案中，接头包含氨基酸。在一些实施方案中，纳米孔和聚合酶包含单个多肽。在一些实施方案中，接头包含核酸或聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，接头包含非共价键。在一些实施方案中，接头包含生物素和链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，以下中的至少一种：(a)聚合酶的c-末端附接至纳米孔的n-末端；(b)聚合酶的c-末端附接至纳米孔的c-末端；(c)聚合酶的n-末端附接至纳米孔的n-末端；(d)聚合酶的n-末端附接至纳米孔的c-末端；且(e)聚合酶附接至纳米孔，其中聚合酶和纳米孔中的至少一种在末端不附接。在一些实施方案中，接头使聚合酶相对于纳米孔定向，使得借助纳米孔检测标签。在一些实施方案中，聚合酶通过两个或更多个接头附接至纳米孔。在一些实施方案中，接头包含seqidno2-35中的一个或多个，或由其产生的pcr产物。在一些实施方案中，接头包含由seqidno1-35中的一个或多个编码的肽，或由其产生的pcr产物。在一些实施方案中，纳米孔与α-溶血素至少80%同源。在一些实施方案中，纳米孔与phi-29至少80%同源。在另一个方面，标签分子包含：(a)包含第一区段和第二区段的第一聚合物链，其中第二区段比第一区段更窄；和(b)包含两个末端的第二聚合物链，其中第一末端固定至与第二区段相邻的第一聚合物链，且第二末端不固定至第一聚合物链，其中标签分子能够以第一方向穿过纳米孔，其中第二聚合物链与第二区段相邻对齐。在一些实施方案中，标签分子不能以第二方向穿过纳米孔，其中第二聚合物链不与第二区段相邻对齐。在一些实施方案中，当第二聚合物链不与第二区段相邻对齐时，第二聚合物链与第一聚合物链碱基配对。在一些实施方案中，第一聚合物链固定至核苷酸。在一些实施方案中，当核苷酸被掺入生长中的核酸链中时，第一聚合物链从核苷酸释放。在一些实施方案中，第一聚合物链固定至核苷酸的末端磷酸酯。在一些实施方案中，第一聚合物链包含核苷酸。在一些实施方案中，第二区段包含a-碱性核苷酸。在一些实施方案中，第二区段包含碳链。在另一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，可借助所述纳米孔检测所述标签，其中所述标签包含：(i)包含第一区段和第二区段的第一聚合物链，其中第二区段比第一区段更窄，和(ii)包含两个末端的第二聚合物链，其中第一末端固定至与第二区段相邻的第一聚合物链，且第二末端不固定至第一聚合物链，其中标签分子能够以第一方向穿过纳米孔，其中第二聚合物链与第二区段相邻对齐；(b)借助聚合酶实施聚合反应，由此将所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自所述核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中；和(c)在掺入所述单个标记的核苷酸期间，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当所述核苷酸与所述聚合酶缔合时，借助所述纳米孔检测到所述标签。在一些实施方案中，标签分子不能以第二方向穿过纳米孔，其中第二聚合物链不与第二区段相邻对齐。在一些实施方案中，在与所述聚合酶缔合的同时多次检测到所述标签。在一些实施方案中，将电极在标签检测时段之间再充电。在一些实施方案中，标签在单个标签核苷酸的掺入期间穿入纳米孔中，且其中当电极再充电时标签不穿出纳米孔。在一些实施方案中，所述方法基于所述纳米孔检测到所述标记的核苷酸的时间长度来区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔检测到未掺入的标记的核苷酸的时间的比率为至少约1.5。在另一个方面，用于核酸测序的方法包括：(a)提供待测序的单链核酸；(b)提供多种探针，其中所述探针包含：(i)能够与单链核酸杂交的杂交部分，(ii)具有两个末端的环结构，其中每个末端附接至所述杂交部分，和(iii)位于环结构的末端之间的杂交部分中的可切割基团，其中所述环结构包含铰链门，所述铰链门防止所述环结构以相反方向穿过纳米孔；(c)以通过杂交部分与待测序的单链核酸的杂交确定的顺序聚合多种探针；切割可切割基团以提供待测序的扩展线；(d)使扩展线穿过纳米孔，其中铰链门防止扩展线以相反方向穿过纳米孔；并且(e)借助纳米孔，以通过杂交部分与待测序的单链核酸杂交确定的顺序检测扩展线的环结构，由此对待测序的单链核酸进行测序。在一些实施方案中，环结构包含窄区段，且铰链门是包含两个末端的聚合物，其中第一末端固定至与窄区段相邻的环结构，且第二末端不固定至环结构，其中环结构能够以第一方向穿过纳米孔，其中铰链门与窄区段相邻对齐。在一些实施方案中，环结构不能以相反方向穿过纳米孔，其中铰链门不与窄区段相邻对齐。在一些实施方案中，当铰链门不与窄区段相邻对齐时，铰链门与环结构碱基配对。在一些实施方案中，铰链门包含核苷酸。在一些实施方案中，窄区段包含a-碱性核苷酸。在一些实施方案中，窄区段包含碳链。在一些实施方案中，将电极在检测时段之间再充电。在一些实施方案中，当电极再充电时，扩展线不以相反方向穿过纳米孔。从以下详述，本公开的额外方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅显示和描述本公开的说明性实施方案。如将意识到，本公开能够具有其他和不同的实施方案，并且其几个细节能够在各种显而易见的方面进行修改，所有都不脱离本公开内容。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的而非限制性的。通过引用并入本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入。附图简述在随附的权利要求中描述了本发明的新型特点。通过参考描述说明性实施方案(其中利用本发明的原理)的以下详述和附图将获得本发明的特征和优点的更好理解，所述附图为：图1示意性地显示该方法的步骤；图2a、2b和2c显示纳米孔检测器的实例，其中图2a具有设置在电极上的纳米孔，图2b具有在孔上方的膜中插入的纳米孔，且图2c具有在突出电极上方的纳米孔；图3举例说明该装置和方法的组件；图4举例说明用于核酸测序的方法，其中当标签与聚合酶缔合时，通过纳米孔检测释放的标签；图5举例说明用于核酸测序的方法，其中标签在核苷酸掺入事件后不释放，并且被纳米孔检测到。图6显示由短暂停留在纳米孔中的标签生成的信号的实例；图7显示纳米孔检测器的阵列；图8显示包含包括纳米孔而不是孔的芯片设置的实例；图9显示测试芯片单元阵列配置的实例；图10显示单元模拟电路的实例；图11显示超紧凑型测量电路的实例；图12显示超紧凑型测量电路的实例；图13显示附接至核苷酸的磷酸酯的标签分子的实例；图14显示替代标签位置的实例；图15显示可检测的tag-多磷酸酯和可检测的tag；图16显示配置为控制测序仪的计算机系统；图17显示phi29聚合酶与溶血素纳米孔的对接；图18显示表现出两个限制动力学步骤的聚合酶的停留时间的概率密度；图19显示与纳米孔侧更靠近检测电路的结合配偶体缔合的标签；图20显示比流出纳米孔更容易流过纳米孔的有倒钩的标签；图21显示波形的实例；图22显示四种核酸碱基腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)和胸腺嘧啶(t)的提取信号相比于施加的电压的图；图23显示四种核酸碱基腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)和胸腺嘧啶(t)的多次运行的提取信号相比于施加的电压的图；图24显示四种核酸碱基腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)和胸腺嘧啶(t)的多次运行的百分比参考导电差异(%rcd)相比于施加的电压的图；图25显示使用寡核苷酸减速带来减慢核酸聚合酶的行进；图26显示除了聚合酶以外还使用第二种酶或蛋白，诸如解旋酶或核酸结合蛋白；图27显示用于形成具有限定数目的修饰亚基的多聚体蛋白的方法的实例；图28显示分级分离具有不同数目的修饰亚基的分布的多个纳米孔的实例；图29显示分级分离具有不同数目的修饰亚基的分布的多个纳米孔的实例；图30显示施加的电压的校准的实例；图31显示具有铰链门的标记的核苷酸的实例；图32显示使用具有铰链门的标记的核苷酸的核酸测序的实例；图33显示用于expandamer测序的探针的实例；图34显示所聚合的expandamer探针的实例；图35显示切割可切割基团以提供待测序的扩展线的实例；图36显示使扩展线穿过纳米孔的实例；图37显示非法拉第传导的实例；图38显示捕获两个标签分子的实例；图39显示在待测序的核酸、标记的核苷酸以及纳米孔和聚合酶之间的融合体之间形成的三元复合物的实例；图40显示没有标记的核苷酸存在的情况下流过纳米孔的电流的实例；图41显示使用电流水平来区分不同标记的核苷酸的实例；图42显示使用电流水平来区分不同标记的核苷酸的实例；图43显示使用电流水平来区分不同标记的核苷酸的实例；图44显示使用电流水平来使用标记的核苷酸对核酸分子进行测序的实例；图45显示使用电流水平来使用标记的核苷酸对核酸分子进行测序的实例；图46显示使用电流水平来使用标记的核苷酸对核酸分子进行测序的实例；和图47显示使用电流水平来使用标记的核苷酸对核酸分子进行测序的实例。图48显示包含(α)9和(β)9报告单元的示例性不对称修饰核苷酸聚合物的单向运动的示意图。图49显示由位于与双链体区域(例如，双链庞大结构)相邻的聚合物内的亚酰胺（amidite）单元构成的各种报告单元的离子流电流水平(i/i0)特征。图50显示图49中相同的亚酰胺单元的停留时间特征。详述尽管本文中已经显示和描述了本发明的各个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。许多变化、改变和取代对于本领域技术人员在不偏离本发明的情况下是可以想到的。应当理解的是，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。如本文所用的术语“纳米孔”通常是指在膜中形成或以其他方式提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，诸如脂质双层，或合成膜，诸如由聚合物材料形成的膜。膜可以是聚合材料。可以将纳米孔布置在相邻或邻近于传感电路或与传感电路耦合的电极，诸如，例如，互补金属氧化物半导体(cmos)或场效应晶体管(fet)电路。在一些实例中，纳米孔具有0.1纳米(nm)至约1000nm的数量级的特征性宽度或直径。一些纳米孔是蛋白。α溶血素是蛋白纳米孔的一个实例。如本文所用的术语“核酸”通常是指包含一个或多个核酸亚基的分子。核酸可以包括一个或多个选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的亚单位。核苷酸可以包括a、c、g、t或u或其变体。核苷酸可以包括可以掺入生长中的核酸链的任何亚基。此类亚基可以是a、c、g、t、或u，或对于一个或多个互补a、c、g、t或u特异性的或与嘌呤(即，a或g，或其变体)或嘧啶(即，c、t或u，或其变体)互补的任何其他亚基。亚基可以使得能够解析单个核酸碱基或碱基组(例如，aa、ta、at、gc、cg、ct、tc、gt、tg、ac、ca或其尿嘧啶对应物)。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，或其衍生物。核酸可以是单链的或双链的。如本文所用的术语“聚合酶”通常是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶的实例包括，但不限于，核酸聚合酶、转录酶或连接酶。聚合酶可以是聚合的酶。用于对样品进行测序的方法和系统本文描述了使用或借助一个或多个纳米孔对核酸进行测序的方法、装置和系统。一个或多个纳米孔可以在膜(例如脂质双层)中，所述膜被布置在相邻或传感邻近于电极，所述电极是集成电路的一部分或耦合至集成电路。在一些实例中，纳米孔装置包括相邻或传感邻近于电极的膜中的单个纳米孔。在其他实例中，纳米孔装置包括邻近于传感器电路或传感电极的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000或10,000个纳米孔。一个或多个纳米孔可以与单个电极和传感集成电路或多个电极和传感集成电路缔合。系统可以包括反应室，所述反应室包括一个或多个纳米孔装置。纳米孔装置可以是单独可寻址的纳米孔装置(例如，能够检测信号并提供独立于系统中的其他纳米孔装置的输出的装置)。单独可寻址的纳米孔可以是单独可读的。在一些情况下，单独可寻址的纳米孔可以是单独可写的。作为替代方案，单独可寻址的纳米孔可以是单独可读和单独可写的。该系统可以包括一个或多个计算机处理器，用于促进样品制备和本公开的各种操作，诸如核酸测序。处理器可以耦合至纳米孔装置。纳米孔装置可以包括多个单独可寻址的传感电极。每个传感电极可以包括与电极相邻的膜，和膜中的一个或多个纳米孔。本公开的方法、装置和系统可以准确地检测单个核苷酸掺入事件，诸如在将核苷酸掺入与模板互补的生长中的链中后。酶(例如，dna聚合酶、rna聚合酶、连接酶)可以将核苷酸掺入生长中的多核苷酸链中。本文提供的酶(例如，聚合酶)可以生成聚合物链。添加的核苷酸可以与相应模板核酸链互补，所述模板核酸链与生长中的链杂交(例如，聚合酶链式反应(pcr))。核苷酸可以包括与核苷酸的任何位置偶联的标签(或标签物质)，包括但不限于核苷酸的磷酸酯(例如，γ-磷酸酯)、糖或含氮碱基部分。在一些情况下，在核苷酸标签的掺入期间，在标签与聚合酶缔合的同时，检测到标签。可以继续检测到标签，直到在核苷酸掺入以及随后标签的切割和/或释放后标签通过纳米孔易位。在一些情况下，核苷酸掺入事件从穿过纳米孔并被检测的核苷酸释放标签。标签可以通过聚合酶释放，或以任何合适的方式(包括但不限于被位于聚合酶附近的酶切割)切割/释放。以此方式，可以鉴别掺入的碱基(即，a、c、g、t或u)，因为从每种类型的核苷酸(即，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)释放独特的标签。在一些情况下，核苷酸掺入事件不释放标签。在这种情况下，借助纳米孔检测与掺入的核苷酸偶联的标签。在一些实例中，标签可以移动通过纳米孔或在纳米孔附近移动，并且借助纳米孔进行检测。本公开的方法和系统可以使得能够检测核酸掺入事件，诸如在给定时间段内以至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、500、1000、5000、10000、50000或100000个核酸碱基(“碱基”)的分辨率。在一些实例中，纳米孔装置用于检测单个核酸掺入事件，其中每个事件与单个核酸碱基相关。在其他实例中，纳米孔装置用于检测与多个碱基相关的事件。例如，通过纳米孔装置传感的信号可以是来自至少2、3、4或5个碱基的组合信号。在一些情况下，标签不穿过纳米孔。标签可以通过纳米孔检测并且在不穿过纳米孔的情况下离开纳米孔(例如，从标签进入纳米孔的相反方向离开)。芯片可以被配置为主动将标签从纳米孔排出。在一些情况下，标签不在核苷酸掺入事件后释放。在一些情况下，核苷酸掺入事件将标签“呈递”至纳米孔(即不释放标签)。标签可以被纳米孔检测而不被释放。标签可以通过足够长足以标签呈递至纳米孔用于检测的接头附接至核苷酸。核苷酸掺入事件可以实时(即，当它们发生时)且借助纳米孔检测。在一些情况下，附接至或邻近于纳米孔的酶(例如，dna聚合酶)可以促进核酸分子通过或相邻于纳米孔流动。核苷酸掺入事件或多个核苷酸的掺入可以释放或呈递一种或多种标签物质(在本文中也称为“标签”)，其可以被纳米孔检测到。当标签通过或相邻于纳米孔流动时，当标签驻留在纳米孔中时，和/或当将标签被呈递给纳米孔时，可以进行检测。在一些情况下，附接至或邻近于纳米孔的酶可以在掺入一个或多个核苷酸后帮助检测标签。本公开的标签可以是原子或分子，或原子或分子的集合。标签可以提供光学、电化学、磁性或静电(例如，感应，电容)特征，其特征可以借助纳米孔来检测。本文描述的方法可以是单分子方法。即，检测到的信号由单个分子(即，单个核苷酸掺入)生成，并且不是由多个克隆分子生成。该方法可能不需要dna扩增。核苷酸掺入事件可能从包含多种核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸三磷酸(dntp，其中n是腺苷(a)、胞苷(c)、胸苷(t)、鸟苷(g)或尿苷(u))的混合物发生。核苷酸掺入事件不一定从包含单一类型的核苷酸(例如，datp)的溶液发生。核苷酸掺入事件不一定从多种核苷酸(例如，datp，随后为dctp，随后为dgtp，随后为dttp，随后为datp)的交替溶液发生。在一些情况下，通过连接酶掺入多种核苷酸(例如，aa、ag、ac、at、ga、gg、gg、gc、gt、ca等…的二聚体)。用于核酸鉴别和测序的方法用于对核酸进行测序的方法可以包括：取回具有待测序的核酸的生物样品，从生物样品提取或以其他方式分离核酸样品，并且在一些情况下，准备核酸样品用于测序。图1示意性地举例说明用于对核酸样品进行测序的方法。所述方法包括从生物样品(例如，组织样品、流体样品)分离核酸分子，和制备核酸样品用于测序。在一些情况下，从细胞提取核酸样品。用于提取核酸的技术的实例是使用溶菌酶、超声处理、提取、高压或其任何组合。在一些情况下，核酸是无细胞的核酸，并且不需要从细胞提取。在一些情况下，可以通过涉及从核酸样品除去蛋白、细胞壁碎片和其他组分的过程来制备核酸样品用于测序。存在可用于完成此操作的许多商业产品，诸如，例如，旋转柱。也可以使用乙醇沉淀和离心。可以将核酸样品划分(或断裂)为多个片段，其可以诸如借助在阵列中包括多个纳米孔的装置促进核酸测序。然而，可能不一定将待测序的核酸分子断裂。在一些情况下，测定长序列(即，可能不需要“鸟枪测序”方法)。可以测定任何合适长度的核酸序列。例如，可以对至少约5、约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约800、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000或约100000个等碱基进行测序。在一些情况下，对至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000个等碱基进行测序。在一些情况下，测序的碱基是连续的。在一些情况下，测序的碱基不是连续的。例如，给定数量的碱基可以连续测序。在另一个实例中，一个或多个测序的碱基可以被其中序列信息未测定和/或可用的的一个或多个嵌段隔开。在一些实施方案中，模板可以被多次测序(例如，使用环状核酸模板)，在一些情况下，生成冗余序列信息。在一些情况下，使用软件来提供序列。在一些情况下，核酸样品可以在测序之前分配。在一些情况下，可以对核酸样品链进行处理，使得给定的双链体dna或rna/dna区域为环状，使得在环状dna或环状dna/rna分子中包括双链体dna或rna/dna区域的相应有义和反义部分。在这种情况下，来自这种分子的测序的碱基可以允许更容易的数据组装和碱基位置读数的检查。纳米孔测序和分子检测本文提供了用于借助纳米孔对核酸分子进行测序的系统和方法。所述纳米孔可以被形成或以其他方式嵌入相邻于传感电路、诸如集成电路的传感电极布置的膜中。所述集成电路可以是应用特异性的集成电路(asic)。在一些实例中，所述集成电路是场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(cmos)。所述传感电路可以位于具有纳米孔的芯片或其他装置中，或者位于所述芯片或装置之外，诸如在芯片外构型中。所述半导体可以是任何半导体，包括但不限于iv族(例如，硅)和iii-v族半导体(例如，砷化镓)。在一些情况下，当核酸或标签通过或相邻于纳米孔流动时，传感电路检测与核酸或标签相关的电信号。核酸可以是较大链的亚基。标签可以是核酸掺入事件或标记的核酸和纳米孔或相邻于纳米孔的物质(诸如从核酸切割标签的酶)之间的其他相互作用的副产物。标签可以保持附接至核苷酸。可以将检测到的信号收集并储存在存储器位置中，并且后来用于构建核酸的序列。可以将收集的信号处理以解释检测到的信号中的任何异常，诸如误差。图2显示具有温度控制的纳米孔检测器(或传感器)的实例，其可以根据在美国专利申请公开号2011/0193570(其通过引用以其整体并入本文)中描述的方法来制备。参考图2a，纳米孔检测器包括与导电溶液(例如，盐溶液)207接触的顶部电极201。底部导电电极202在插入膜205中的纳米孔206的附近、相邻或邻近。在一些情况下，底部导电电极202被嵌入半导体203中，其中嵌入半导体基底204中的电路。半导体203的表面可以被处理为疏水的。所检测的样品穿过纳米孔206中的孔。半导体芯片传感器被放置在包装208中，并且这进而在温度控制元件209的附近。温度控制元件209可以是热电加热和/或冷却装置(例如，珀耳帖装置)。多个纳米孔检测器可以形成纳米孔阵列。参考图2b，其中类似的数字代表类似的元件，膜205可以设置在孔210上方，其中传感器202形成孔的表面的一部分。图2c显示其中电极202从处理的半导体表面203突出的实例。在一些实例中，膜205在底部导电电极202上形成，而不在半导体203上形成。在这种情况下，膜205可以与底部导电电极202形成耦合相互作用。然而，在一些情况下，膜205在底部导电电极202和半导体203上形成。作为替代方案，膜205可以形成在半导体203上形成，而不在底部导电电极202上形成，但可以在底部导电电极202上方延伸。纳米孔可用于对核酸分子进行间接测序，在一些情况下用电检测。间接测序可以是其中在生长中的链中掺入的核苷酸不穿过纳米孔的任何方法。核酸分子可以在距纳米孔和/或接近纳米孔的任何合适的距离内穿过，在一些情况下在一定距离内穿过，使得在纳米孔中检测到从核苷酸掺入事件释放的标签。核苷酸掺入事件的副产物可以通过纳米孔检测。“核苷酸掺入事件”是核苷酸掺入生长中的多核苷酸链中。副产物可以与给定类型核苷酸的掺入相关。核苷酸掺入事件通常由酶、诸如dna聚合酶催化，并且使用与模板分子的碱基对相互作用来选择可用于在每个位置处掺入的核苷酸。可以使用标记的核苷酸或核苷酸类似物对核酸样品进行测序。在一些实例中，用于对核酸样品测序的方法包括(a)掺入(例如聚合)标记的核苷酸，其中在掺入后释放与单个核苷酸缔合的标签，且(b)借助纳米孔检测释放的标签。在一些情况下，所述方法进一步包括引导附接至单个核苷酸或从单个核苷酸释放的标签通过纳米孔。可以通过任何合适的技术来引导释放或附接的标签，在一些情况下，借助酶(或分子马达)和/或跨孔的电压差。或者，可以在不使用酶的情况下将释放或附接的标签引导通过纳米孔。例如，如本文所述，可以通过跨纳米孔的电压差来引导标签。用预装载的标签进行测序没有装载至纳米孔中而释放的标签可以远离纳米孔扩散并且不被纳米孔检测到。这可能引起对核酸分子测序的错误(例如，丢失核酸位置或以错误顺序检测标签)。本文提供了用于对核酸分子进行测序的方法，其中在从核苷酸释放标签之前将标签分子“预装载”至纳米孔中。与未预装载的标签相比，预装载的标签被纳米孔检测到的可能性高得多(例如，可能性高至少约100倍)。同样，预装载标签提供了用于确定是否已将标记的核苷酸掺入生长中的核酸链中的方法。与穿过纳米孔(并被纳米孔检测到)而不掺入的标签(例如，小于约1ms的平均值)相比，与掺入的核苷酸缔合的标签可以与纳米孔缔合更长的时间段(例如，至少约50毫秒(ms)的平均值)。在一些实例中，与掺入的核苷酸缔合的标签可以与纳米孔缔合或保持或以其他方式偶联至与纳米孔相邻的酶(例如聚合酶)持续至少约1毫秒(ms)、20ms、30ms、40ms、50ms、100ms、200ms或大于250ms的平均时间段。在一些实例中，与掺入的核苷酸缔合的标签信号可以具有至少约1毫秒(ms)、20ms、30ms、40ms、50ms、100ms、200ms或大于250ms的平均检测寿命。标签可以与偶联的掺入的核苷酸偶联。具有小于归因于掺入的核苷酸的平均检测寿命的平均检测寿命(例如，小于约1ms)的标签信号可以归因于与标签偶联的未掺入的核苷酸。在一些情况下，至少‘x’的平均检测寿命可以归因于掺入的核苷酸，且小于‘x’的平均检测寿命可以归因于未掺入的核苷酸。在一些实例中，‘x’可以是0.1ms、1ms、20ms、30ms、40ms、50ms、100ms、1秒。可以借助在膜中具有至少一个纳米孔的纳米孔装置来检测标签。标签可以在单个标记的核苷酸的掺入期间与单个标记的核苷酸缔合。本文提供的方法可以涉及借助纳米孔区分与单个标记的核苷酸缔合的标签与一个或多个与一个或多个未掺入的单个标记的核苷酸缔合的标签。在一些情况下，纳米孔装置在掺入期间检测与单个标记的核苷酸缔合的标签。通过纳米孔装置，在一定情况下借助纳米孔装置的电极和/或纳米孔，检测、测定或区分标记的核苷酸(无论是掺入生长中的核酸链中还是未掺入)给定的时间段。纳米孔装置检测标签的时间段可以短于，在一些情况下实质上短于，标签和/或与标签偶联的核苷酸被酶(诸如促进核苷酸掺入核酸链中的酶(例如，聚合酶)保持的时间段。在一些实例中，可以在掺入的标记的核苷酸与酶缔合的时间段内由电极多次检测到标签。例如，可以在掺入的标记的核苷酸与酶缔合的时间段内通过电极至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、10,000、100,000或1,000,000次检测到标签。检测时间或平均检测时间的任何叙述都可以允许一定比例的检测时间落在所述时间或平均时间之上或之下。在一些情况下，当对多个核酸碱基进行测序时的检测时间是统计学分布的(例如，指数分布或高斯分布)。例如，指数分布可以具有相对大百分比的落在平均检测时间之下的检测时间，如图18中所示。在一些实例中，预装载标签包括在标签附接至核苷酸的同时引导标签的至少一部分通过纳米孔的至少一部分，所述核苷酸已被掺入核酸链(例如，生长中的核酸酸链)，正在经历并入核酸链中，或尚未掺入核酸链中，但可能经历掺入核酸链中。在一些实例中，预装载标签包括在核苷酸已被掺入核酸链之前或在核苷酸被掺入核酸链的同时引导标签的至少一部分通过纳米孔的至少一部分。在一些情况下，预装载标签可以包括在核苷酸已经被掺入核酸链之后，引导标签的至少一部分通过纳米孔的至少一部分。图3显示该方法的主要组分。此处，纳米孔301在膜302中形成。酶303(例如，聚合酶，诸如dna聚合酶)与纳米孔缔合。在一些情况下，如下所述，酶共价附接至纳米孔。聚合酶与待测序的单链核酸分子304缔合。单链核酸分子在一些情况下是环状的，但这不是需要的。在一些情况下，核酸分子是线性的。在一些实施方案中，核酸引物305与核酸分子的一部分杂交。在一些情况下，引物具有发夹(例如，防止在围绕环状模板的第一次穿过后置换的新产生的核酸链穿入纳米孔)。聚合酶催化使用单链核酸分子作为模板的核苷酸掺入至引物上。核苷酸306包含如本文所述的标签物质(“标签”)307。图4示意性地举例说明借助“预装载的”标签进行核酸测序的方法。部分a显示如图3中所述的主要组分。部分c显示装载至纳米孔中的标签。“装载的”标签可以是被放置在纳米孔中和/或保留在纳米孔中或附近适当的时间量、诸如例如至少0.1毫秒(ms)、至少1ms、至少5ms、至少10ms、至少50ms、至少100ms或至少500ms或至少1000ms的标签。在一些情况下，“预装载”的标签在从核苷酸释放之前装载于纳米孔中。在一些情况下，如果标签在核苷酸掺入事件后释放后穿过纳米孔(和/或被纳米孔检测)的概率合适地高，诸如例如至少90%、至少95%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%、至少99.99%或至少99.999%，则预装载标签。在从部分a至部分b的转变中，核苷酸已经变得与聚合酶缔合。缔合的核苷酸与单链核酸分子碱基配对(例如，a与t，和g与c)。公认的是，许多核苷酸可以变得与聚合酶瞬时缔合，其不与单链核酸分子碱基配对。未配对的核苷酸可以被聚合酶排斥，并且通常仅在核苷酸碱基配对的情况下才进行核苷酸的掺入。未配对的核苷酸通常在比正确配对的核苷酸保持与聚合酶缔合的时间尺度更短的时间尺度内被排斥。未配对的核苷酸可以在至少约100纳秒(ns)、1ms、10ms、100ms、1秒的时间段(平均值)内被拒绝，而正确配对的核苷酸保持与聚合酶缔合更长的时间段，诸如至少约1毫秒(ms)、10ms、100ms、1秒或10秒的平均时间段。在一些情况下，在图4的b部分a和中穿过纳米孔的电流可以在3和30皮安(pa)之间。图4，部分c描绘了聚合酶与纳米孔的对接。可以借助施加至纳米孔所在的膜或纳米孔的电压(例如，dc或ac电压)将聚合酶吸引至纳米孔。图17还描绘聚合酶与纳米孔的对接，在这种情况下phi29dna聚合酶(φ29dna聚合酶)与α-溶血素纳米孔的对接。在对接期间，可以通过电力将标签拉入纳米孔中，所述电力诸如在由施加至膜和/或纳米孔的电压生成的电场存在的情况下生成的力。在一些实施方案中，在图4的部分c期间流过纳米孔的电流为约6pa、约8pa、约10pa、约15pa或约30pa。聚合酶经历异构化和转磷酸化反应以将核苷酸掺入生长中的核酸分子中并释放标签分子。在部分d中，描绘穿过纳米孔的标签。通过纳米孔检测标签，如本文所述。重复循环(即，部分a至e或a至f)允许对核酸分子进行测序。在一些情况下，未掺入生长中的核酸分子中的标记的核苷酸也将穿过纳米孔，如图4的部分f中所见。在一些情况下，纳米孔可以检测到未掺入的核苷酸，但该方法提供了至少部分地基于在纳米孔中检测核苷酸的时间来区分掺入的核苷酸和未掺入的核苷酸的方法。与未掺入的核苷酸结合的标签快速穿过纳米孔并持续短时间段(例如，小于100ms)被检测到，而与掺入的核苷酸结合的标签被装载至纳米孔中并持续长时间段(例如，至少100ms)被检测到。在一些实施方案中，所述方法基于纳米孔检测到标记的核苷酸的时间长度来区分掺入的(例如，聚合的)标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸。与当未掺入时相比，当掺入时，标签可以保持邻近于纳米孔更长的时间。在一些情况下，将聚合酶突变以增加掺入的标记的核苷酸和未掺入的标记的核苷酸之间的时间差。纳米孔检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔检测到未掺入的标签的时间的比率可以是任何合适的值。在一些实施方案中，纳米孔检测到掺入的标记的核苷酸的时间与纳米孔检测到未掺入的标签的时间的比率为约1.5、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约25、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500或约1000。在一些实施方案中，纳米孔检测到掺入的(例如，聚合的)标记的核苷酸的时间与纳米孔检测到未掺入的标签的时间的比率为至少约1.5、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约12、至少约14、至少约16、至少约18、至少约20、至少约25、至少约30、至少约40、至少约50、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500或至少约1000。标签被装载至纳米孔中(和/或被纳米孔检测)的时间是任何合适的值。在一些情况下，纳米孔检测到标签的平均时间为约10毫秒(ms)、约20ms、约30ms、约40ms、约50ms、约60ms、约80ms、约100ms、约120ms、约140ms、约160ms、约180ms、约200ms、约220ms、约240ms、约260ms、约280ms、约300ms、约400ms、约500ms、约600ms、约800ms或约1000ms。在一些情况下，纳米孔检测到标签的平均时间为至少约10毫秒(ms)、至少约20ms、至少约30ms、至少约40ms、至少约50ms、至少约60ms、至少约80ms、至少约100ms、至少约120ms、至少约140ms、至少约160ms、至少约180ms、至少约200ms、至少约220ms、至少约240ms、至少约260ms、至少约280ms、至少约300ms、至少约400ms、至少约500ms、至少约600ms、至少约800ms或至少约1000ms。在一些实例中，持续至少约1ms、至少约10ms、至少约50ms、至少约80ms、至少约100ms、至少约120ms、至少约140ms、至少约160ms、至少约180ms、至少约200ms、至少约220ms、至少约240ms或至少约260ms的时间段生成信号的标签归因于已经被掺入与模板的至少一部分互补的生长中的链中的核苷酸。在一些情况下，持续小于约100ms、小于约80ms、小于约60ms、小于约40ms、小于约20ms、小于约10ms、小于约5ms或小于约1ms的时间段生成信号的标签归因于未掺入生长中的链中的核苷酸。核酸分子可以是线性的(如图5中所示)。在一些情况下，如图3中所见，核酸分子304是环状的(例如，环状dna、环状rna)。可以对环化的(例如，单链的)核酸进行多次测序(例如，当聚合酶303完全绕环行进时，其开始对模板的部分进行重新测序)。环状dna可以是连接在一起的相同基因组位置的有义链和反义链(在一些情况下，允许进行更可靠和准确的读取)。可以对环状核酸进行测序，直到达到合适的准确度(例如，至少95%、至少99%、至少99.9%或至少99.99%准确度)。在一些情况下，对核酸进行至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少12次、至少15次、至少20次、至少40次、至少50次、至少100次或至少1000次测序。在一个方面，本文所述的方法和装置部分地基于纳米孔检测到和/或可检测到的掺入核苷酸的时间段比未掺入的核苷酸更长来区分掺入的核苷酸和未掺入的核苷酸。在一些情况下，与所测序的核酸链杂交的第二核酸链(双链核酸)的置换增加检测掺入和未掺入的核苷酸之间的时间差。参考图3，在第一次测序之后，聚合酶可能遇到双链核酸(例如，从当其遇到引物305时开始)，并且第二核酸链可能需要从模板置换以继续测序。与当模板是单链时相比，这种置换可以减慢聚合酶和/或核苷酸掺入事件的速率。在一些情况下，模板核酸分子是来自寡核苷酸与单链模板的杂交的双链。图25显示其中多个寡核苷酸2500被杂交的实例。聚合酶2501在指示2502的方向行进从模板置换寡核苷酸。与不存在寡核苷酸的情况相比，聚合酶可以行进慢得多。在一些情况下，如本文所述的寡核苷酸的使用部分地基于纳米孔检测到和/或可检测到的掺入核苷酸的时间段比未掺入的核苷酸更长来改进掺入的核苷酸和未掺入的核苷酸之间的分辨率。寡核苷酸可以是任何合适的长度(例如，约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约14、约16、约18或约20个碱基长)。寡核苷酸可以包含天然碱基(例如，腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和/或尿嘧啶(u))、通用碱基(例如，5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、3-甲基7-丙炔基异卡斯蒂尔(isocarbostyril)(pim)、3-甲基异卡斯蒂尔(mics)和/或5-甲基异卡斯蒂尔(5mics))或其任何比例的任何组合。在一些情况下，与未甲基化的核酸模板相比，用甲基化的核酸模板的核酸聚合酶行进更缓慢。在一个方面，本文所述的方法和/或装置使用甲基化的核酸和/或使核酸分子甲基化。在一些情况下，在胞嘧啶嘧啶环的5位置和/或腺嘌呤嘌呤环的6位置氮上存在甲基和/或向其添加甲基。待测序的核酸可以分离自使该核酸甲基化的生物体。在一些情况下，核酸可以在体外甲基化(例如，通过使用dna甲基转移酶)。时间可以用于区分甲基化的碱基和非甲基化的碱基。这可以实现表观遗传学研究。在一些情况下，基于特征性电流或电流/时间图的特征性形状，甲基化的碱基可与未甲基化的碱基区分开。例如，根据核酸模板在给定位置是否具有甲基化的碱基(例如，由于聚合酶中的构象差异)，标记的核苷酸可以导致不同的阻断电流。在一些情况下，c和/或a碱基被甲基化并且相应的g和/或t标记的核苷酸的掺入使电流偏移。用于核酸测序的酶所述方法可以使用酶(例如，聚合酶、转录酶或连接酶)来对具有如本文所述的纳米孔和标记的核苷酸的核酸分子进行测序。在一些情况下，所述方法涉及借助聚合酶(例如，dna聚合酶)掺入(例如，聚合)标记的核苷酸。在一些情况下，聚合酶已经突变，以允许其接受标记的核苷酸。聚合酶也可以被突变以增加纳米孔检测到标签的时间(例如，图4的部分c的时间)。在一些实施方案中，所述酶是通过核苷酸的磷酸酯键产生核酸链的任何酶。在一些情况下，dna聚合酶是9°n聚合酶或其变体，大肠杆菌dna聚合酶i，细菌噬菌体t4dna聚合酶，测序酶，taqdna聚合酶，9°n聚合酶(外切-)a485l/y409v，phi29dna聚合酶(φ29dna聚合酶)，bet聚合酶，或其变体、突变体或同源物。同源物可以具有任何合适的百分比同源性，包括但不限于至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%序列同一性。参考图3，酶303可以附接至纳米孔301。用于将酶附接至纳米孔的合适方法包括交联，诸如形成分子内二硫键。纳米孔和酶也可以是融合蛋白(即，由单个多肽链编码)。用于产生融合蛋白的方法可以包括融合与纳米孔的编码序列同框和相邻的酶的编码序列(在两者之间没有终止密码子)和从单个启动子表达该融合序列。在一些实例中，可以使用分子钉或蛋白指将酶303附接或偶联至纳米孔301。在一些情况下，该酶通过中间分子附接，诸如例如生物素与酶和纳米孔两者缀合，其中链霉抗生物素蛋白四聚体连接至两个生物素。该酶也可以用抗体附接至纳米孔。在一些情况下，彼此之间形成共价键的蛋白(例如，spytagtm/spycatchertm系统)用于将聚合酶附接至纳米孔。在一些情况下，磷酸酶或从核苷酸切割标签的酶也附接至纳米孔。在一些情况下，dna聚合酶是phi29dna聚合酶。可以将聚合酶突变以相对于非突变的聚合酶促进和/或提高突变的聚合酶用于将标记的核苷酸掺入生长中的核酸分子中的效率。可以将聚合酶突变以提高核苷酸类似物(例如，标记的核苷酸)进入聚合酶的活性位点区域和/或突变用于与活性区域中的核苷酸类似物配位。在一些实施方案中，聚合酶具有活性区域，所述活性区域具有与接受核苷酸类似物的聚合酶(例如，venta488l)的活性区域同源(例如，至少70%、至少80%或至少90%氨基酸位置相同)的氨基酸序列。phi29dna聚合酶的合适突变包括但不限于残基505-525的缺失，残基505-525的缺失，k135a突变，e375h突变，e375s突变，e375k突变，e375r突变，e375a突变，e375q突变，e375w突变，e375y突变，e375f突变，e486a突变，e486d突变，k512a突变及其组合。在一些情况下，dna聚合酶进一步包含l384r突变。合适的dna聚合酶描述于美国专利公开号2011/0059505，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，聚合酶是具有突变n62d、l253a、e375y、a484e和/或k512y的phi29dna聚合酶。phi29聚合酶的合适突变不限于赋予标记的核苷酸的提高的掺入的突变。其他突变(例如，氨基酸取代、插入、缺失和/或外源性特征)可以赋予但不限于相对于未突变的(野生型)phi29dna聚合酶增强的金属离子配位，降低的核酸外切酶活性，在聚合酶动力学循环的一个或多个步骤的降低的反应速率，减少的分支级分，改变的辅因子选择性，增加的产率，增加的热稳定性，增加的准确度，增加的速度，增加的阅读长度，增加的盐耐受性等。phi29dna聚合酶的合适突变包括但不限于在位置e375的突变，在位置k512的突变，和在选自l253、a484、v250、e239、y224、y148、e508和t368的一个或多个位置的突变。在一些实施方案中，在位置e375的突变包含选自以下的氨基酸取代：e375y、e375f、e375r、e375q、e375h、e375l、e375a、e375k、e375s、e375t、e375c、e375g和e375n。在一些情况下，在位置k512的突变包含选自以下的氨基酸取代：k512y、k512f、k512i、k512m、k512c、k512e、k512g、k512h、k512n、k512q、k512r、k512v和k512h。在一个实施方案中，在位置e375的突变包含e375y取代，且在位置k512的突变包含k512y取代。在一些情况下，突变的phi29聚合酶包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：l253a、l253c、l253s、a484e、a484q、a484n、a484d、a484k、v250i、v250q、v250l、v250m、v250c、v250f、v250n、v250r、v250t、v250y、e239g、y224k、y224q、y224r、y148i、y148a、y148k、y148f、y148c、y148d、y148e、y148g、y148h、y148k、y148l、y148m、y148n、y148p、y148q、y148r、y148s、y148t、y148v、y148w、e508r和e508k。在一些情况下，phi29dna聚合酶在选自d510、e515和f526的一个或多个位置包含突变。所述突变可以包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：d510k、d510y、d510r、d510h、d510c、e515q、e515k、e515d、e515h、e515y、e515c、e515m、e515n、e515p、e515r、e515s、e515t、e515v、e515a、f526l、f526q、f526v、f526k、f526i、f526a、f526t、f526h、f526m、f526v和f526y。可以与本公开的方法一起使用的dna聚合酶的实例描述于美国专利公开号2012/0034602，其整体通过引用并入本文。聚合酶可以具有适用于通过纳米孔检测标签的动力学速率概况。速率概况可以指核苷酸掺入的总体速率和/或核苷酸掺入的任何步骤(诸如核苷酸添加、酶促异构化(诸如酶促异构化为闭合状态或从闭合状态酶促异构化)、辅因子结合或释放、产物释放、核酸掺入生长中的核酸或易位)的速率。本公开的系统可以允许检测与测序相关的一个或多个事件。所述事件可以是动力学可观察的和/或非动力学可观察的(例如，核苷酸通过纳米孔迁移而不与聚合酶接触)。聚合酶可以适于允许测序事件的检测。在一些实施方案中，聚合酶的速率概况可以使得标签被装载至纳米孔中(和/或由纳米孔检测)的平均时间为约0.1毫秒(ms)、约1ms、约5ms、约10ms、约20ms、约30ms、约40ms、约50ms、约60ms、约80ms、约100ms、约120ms、约140ms、约160ms、约180ms、约200ms、约220ms、约240ms、约260ms、约280ms、约300ms、约400ms、约500ms、约600ms、约800ms或约1000ms。在一些实施方案中，聚合酶的速率概况可以使得标签被装载至纳米孔中(和/或由纳米孔检测)的平均时间为至少约5毫秒(ms)、至少约10ms、至少约20ms、至少约30ms、至少约40ms、至少约50ms、至少约60ms、至少约80ms、至少约100ms、至少约120ms、至少约140ms、至少约160ms、至少约180ms、至少约200ms、至少约220ms、至少约240ms、至少约260ms、至少约280ms、至少约300ms、至少约400ms、至少约500ms、至少约600ms、至少约800ms或至少约1000ms。在一些情况下，标签被纳米孔检测到的平均时间为约80ms和260ms之间，约100ms和200ms之间或约100ms和150ms之间。在一些情况下，聚合酶反应表现出从其中核苷酸或多磷酸酯产物与聚合酶结合的中间体进行的两个动力学步骤，以及从其中核苷酸或多磷酸酯产物不与聚合酶结合的中间体开始的两个动力学步骤。两个动力学步骤可以包括酶异构化、核苷酸掺入和产物释放。在一些情况下，两个动力学步骤是模板易位和核苷酸结合。图18举例说明在存在一个动力学步骤的情况下，随着停留时间增加1800，标签在纳米孔中的给定停留时间的概率指数下降，提供了其中标签在纳米孔中的停留时间将很短1801(且因此可能不被纳米孔检测到)的概率相对高的分布。图18还举例说明对于其中存在两个或更多个动力学步骤(例如，可观察的或“缓慢的”步骤)1802的情况，与具有一个缓慢步骤1801的情况相比，标签在纳米孔中的非常快速的停留时间的概率相对低1803。换句话说，两个指数函数的累加可以导致高斯函数或分布1802。另外，两个缓慢步骤的概率分布在概率密度vs停留时间的图1802中表现出一个峰。这种类型的停留时间分布对于如本文所述的核酸测序可以是有利的(例如，在期望检测高比例的掺入的标签的情况下)。相对更多的核苷酸掺入事件将标签装载至纳米孔中持续大于最小时间(tmin，其在一些情况下可能大于100ms)的时间段。在一些情况下，phi29dna聚合酶相对于野生型酶进行突变，以提供两个动力学缓慢的步骤和/或提供适合于通过纳米孔检测标签的速率概况。在一些情况下，phi29dna聚合酶具有选自位置484、位置198和位置381的至少一个氨基酸取代或取代的组合。在一些实施方案中，氨基酸取代选自e375y、k512y、t368f、a484e、a484y、n387l、t372q、t372l、k478y、1370w、f198w、l381a及其任何组合。合适的dna聚合酶描述于美国专利号8,133,672，其通过引用以其整体并入本文。酶的动力学也可以通过操纵与酶接触的溶液的含量来影响和/或控制。例如，可以将非催化性二价离子(例如，不促进聚合酶功能的离子，诸如锶(sr2+))与催化性二价离子(例如，促进聚合酶功能的离子，诸如镁(mg2+)和/或锰(mn2+))混合来减慢聚合酶。催化性离子与非催化性离子的比率可以是任何合适的值，包括约20、约15、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.5、约0.2或约0.1。在一些情况下，该比率取决于一价盐(例如，氯化钾(kcl))、温度和/或ph的浓度。在一个实例中，溶液包含1微摩尔mg2+和0.25微摩尔sr2+。在另一个实例中，溶液包含3微摩尔mg2+和0.7微摩尔sr2+。镁(mg2+)和锰(mn2+)的浓度可以是任何合适的值，并且可以改变以影响酶的动力学。在一个实例中，溶液包含1微摩尔mg2+和0.25微摩尔mn2+。在另一个实例中，溶液包含3微摩尔mg2+和0.7微摩尔mn2+。预装载的标签分子的纳米孔测序可以检测标签，而在与靶标链互补的核酸链的合成期间不从掺入的核苷酸释放。标签可以用接头附接至核苷酸，使得标签被呈递至纳米孔(例如，标签垂悬至纳米孔的至少一部分中或以其他方式延伸通过纳米孔的至少一部分)。接头的长度可以足够长，以允许标签延伸至或通过纳米孔的至少一部分。在一些情况下，通过电压差将标签呈递至(即，移入)纳米孔。将标签呈递至孔中的其他方式也可能是合适的(例如，使用酶、磁体、电场、压力差)。在一些情况下，没有主动力施加至标签(即，标签扩散至纳米孔中)。本发明的一个方面提供了用于对核酸进行测序的方法。所述方法包括掺入(例如聚合)标记的核苷酸。可以通过纳米孔检测与单个核苷酸缔合的标签，而不会在掺入后从核苷酸释放。用于对核酸样品进行测序的芯片可以包含多个单独可寻址的纳米孔。所述多个中的单独可寻址的纳米孔可以含有在与集成电路相邻设置的膜中形成的至少一个纳米孔。每个单独可寻址的纳米孔都能够检测与单个核苷酸缔合的标签。可以掺入(例如，聚合)核苷酸，并且在掺入后标签不从核苷酸释放。该方法的一个实例描绘于图5中。此处，核酸链500穿过纳米孔502或邻近于(但不如501处的箭头501所指示通过)纳米孔502。酶503(例如，dna聚合酶)通过使用第一核酸分子作为模板500一次掺入一个核苷酸来延伸生长中的核酸链504(即，该酶催化核苷酸掺入事件)。标签被纳米孔502检测到。标签可以在纳米孔中停留一段时间。酶503可以附接至纳米孔502。用于将酶附接至纳米孔的合适方法包括交联，诸如形成分子内二硫键和/或产生融合蛋白，如上所述。在一些情况下，磷酸酶也附接至纳米孔。这些酶可以进一步结合切割的标签上剩余的磷酸酯，并通过进一步增加纳米孔中的停留时间来产生更清晰的信号。合适的dna聚合酶包括phi29dna聚合酶(φ29dna聚合酶)，并且进一步包括但不限于上述那些。继续参考图5，酶从附接至标签分子(指示505处的空心圆圈)的核苷酸的合并物(指示505处的实心圆圈)提取。每种类型的核苷酸附接至不同的标签分子，使得当标签位于纳米孔502中时，它们可以基于在纳米孔中生成或与之相关的信号彼此区分。在一些情况下，标签在核苷酸掺入事件后被呈递至纳米孔并从核苷酸释放。在一些情况下，释放的标签穿过纳米孔。在一些情况下，标签不穿过纳米孔。在一些情况下，已经在核苷酸掺入事件后释放的标签与可能流过纳米孔、但在核苷酸掺入事件后未释放的标签区分，甚至至少部分地通过纳米孔中的停留时间。在一些情况下，在核苷酸掺入事件后释放停留在纳米孔中至少约100毫秒(ms)的标签，并且在核苷酸掺入事件后未释放停留在纳米孔中小于100ms的标签。在一些情况下，标签可以被第二种酶或蛋白(例如，核酸结合蛋白)捕获和/或引导通过纳米孔。第二种酶可以在核苷酸掺入后(例如，期间或之后)切割标签。可以切割标签和核苷酸之间的接头。如图26中所见，第二种酶或蛋白2600可以附接至聚合酶。在一些实施方案中，第二种酶或蛋白是促进双链模板解离为单链模板的核酸解旋酶。在一些情况下，第二种酶或蛋白不附接至聚合酶。第二种酶或蛋白可以是结合单链核酸模板以帮助保持模板单链的核酸结合蛋白。核酸结合蛋白可以沿着单链核酸分子滑动。可以基于其中借助纳米孔检测与核苷酸缔合的标签的时间长度来区分掺入的核苷酸与未掺入的核苷酸。在一些实例中，通过纳米孔或借助纳米孔检测到与已经掺入核酸链的核苷酸(“掺入的核苷酸”)缔合的标签的平均时间段为至少约5毫秒(ms)、10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、200ms、300ms、400ms或500ms。纳米孔检测到与未掺入(例如，自由流动)核苷酸缔合的标签的平均时间段为至少约500ms、400ms、300ms、200ms、100ms、90ms、80ms、70ms、60ms、50ms、40ms、30ms、20ms、10ms、5ms或1ms。在一些情况下，纳米孔检测到与掺入的核苷酸缔合的标签的平均时间段为至少约100ms，且纳米孔检测到与未掺入的核苷酸缔合的标签的平均时间段为小于约100ms。在一些实例中，基于标签在纳米孔中的停留时间或借助纳米孔从未掺入的核苷酸检测到的信号，区分与掺入的核苷酸偶联的标签和与未掺入生长中的互补链中的核苷酸缔合的标签。未掺入的核苷酸可以生成持续约1纳秒(ns)和100ms之间或约1ns和50ms之间的时间段可检测到的信号(例如，电压差、电流)，而掺入的核苷酸可以生成信号，寿命在约50ms和500ms之间，或100ms和200ms之间。在一些实例中，未掺入的核苷酸可以生成持续约1ns和10ms之间或1ns和1ms之间的时间段可检测到的信号。在一些情况下，未掺入的标签被纳米孔可检测到的时间段(平均)长于其中掺入的标签被纳米孔可检测到的时间段。在一些情况下，掺入的核苷酸被纳米孔检测到和/或被纳米孔可检测到的时间段短于未掺入的核苷酸。这些时间之间的差异和/或比率可用于确定是否掺入被纳米孔检测到的核苷酸，如本文所述。检测时段可以基于核苷酸通过纳米孔的自由流动；未掺入的核苷酸可以在纳米孔处或附近停留约1纳秒(ns)和100ms之间或约1ns和50ms之间的时间段，而掺入的核苷酸可以在纳米孔处或附近停留约50ms和500ms之间或100ms和200ms之间的时间。时间段可以基于处理条件而不同；然而，掺入的核苷酸可以具有大于未掺入的核苷酸的停留时间的停留时间。聚合(例如，掺入)和检测均可以进行而不干扰彼此。在一些实施方案中，第一标记的核苷酸的聚合不明显干扰与第二标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测。在一些实施方案中，与第一标记的核苷酸缔合的标签的纳米孔检测不干扰第二标记的核苷酸的聚合。在一些情况下，标签足够长、足以被纳米孔检测和/或被检测而不阻止核苷酸掺入事件。标签(或标签物质)可以包括可检测的原子或分子，或多个可检测的原子或分子。在一些情况下，标签包括一个或多个腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其衍生物，其连接至任何位置，包括核酸分子的磷酸酯基团、糖或含氮碱基。在一些实例中，标签包括一个或多个腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其衍生物，其共价连接至核酸碱基的磷酸酯基团。标签可以具有以下长度：至少约0.1纳米(nm)、1nm、2nm、3nm、4、nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm或1000nm。标签可以包括重复亚基的尾巴，诸如多个腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其衍生物。例如，标签可以包括具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、10,000或100,000个腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其衍生物的亚基的尾巴部分。所述亚基可以彼此连接，并且在末端连接至核酸的磷酸酯基团。标签部分的其他实例包括任何聚合材料，诸如聚乙二醇(peg)、多磺酸酯、氨基酸或任何完全或部分带正电荷、带负电荷或不带电荷的聚合物。标签物质可以具有对于掺入期间所掺入的核酸分子的类型独特的电子特征。例如，作为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的核酸碱基可以具有标签物质，其具有分别对腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶独特的一种或多种物质。图6显示当不同标签被纳米孔检测到时由它们生成的不同信号的实例。检测到四种不同的信号强度(601、602、603和604)。这些可以对应于四种不同的标签。例如，呈递至纳米孔和/或通过掺入腺苷(a)释放的标签可能生成具有一定幅度的信号601。呈递至纳米孔和/或通过掺入胞嘧啶(c)释放的标签可能生成具有更高幅度的信号603；呈递至纳米孔和/或通过掺入鸟嘌呤(g)释放的标签可能生成具有甚至更高幅度的信号604；且呈递至纳米孔和/或通过掺入胸腺嘧啶(t)释放的标签可能生成具有又更高幅度的信号602。图6还显示检测已经从核苷酸释放和/或在核苷酸掺入事件后呈递至纳米孔的标签分子的实例。本文所述的方法可能能够区分插入纳米孔中且随后切割的标签(参见，例如，图4，d)和自由浮动的未切割的标签(参见，例如，图4，f)。本文提供的方法可能能够以以下准确度区分释放的(或切割的)标签和未释放的(或未切割的)标签：至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、至少约99.5%、至少约99.9%、至少约99.95%或至少约99.99%或至少约99.999%或至少约99.9999%。参考图6，可以通过标签将电流的幅度降低任何合适的量，包括约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约99%。在一些实施方案中，电流的幅度降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。在一些实施方案中，电流的幅度降低至多5%、至多10%、至多15%、至多20%、至多25%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多95%或至多99%。所述方法可以进一步包括检测单个标记的核苷酸的掺入之间的时间段(例如，图6中的时段605)。单个标记的核苷酸的掺入之间的时间段可以具有高电流幅度。在一些实施方案中，在核苷酸掺入事件之间流过纳米孔的电流的幅度为(例如，返回至)最大电流(例如，当不存在标签时)的约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约99%。在一些实施方案中，在核苷酸掺入事件之间流过纳米孔的电流的幅度为最大电流的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。在一些情况下(例如，当对核酸的重复延伸段、诸如连续3个或更多个相同碱基进行测序时)，在掺入单个标记的核苷酸之间的时间段期间检测和/或观察电流可以提高测序准确度。核苷酸掺入事件之间的时段可以用作时钟信号，其给出所测序的核酸分子或其区段的长度。本文所述的方法可能能够区分掺入的(例如，聚合的)标记的核苷酸和非聚合的标签核苷酸(例如，图5中的506和505)。在一些实例中，可以以以下准确度区分掺入的标记的核苷酸与未掺入的标签核苷酸：至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、至少约99.5%、至少约99.9%、至少约99.95%或至少约99.99%或至少约99.999%或至少约99.9999%。标签和纳米孔之间的缔合在一个方面，本文所述的方法和装置部分地基于标签与纳米孔缔合和/或被纳米孔可检测到的时间量(或时间比率)区分掺入核酸分子中的标记的核苷酸和未掺入的标记的核苷酸。在一些情况下，核苷酸和聚合酶之间的相互作用增加标签与纳米孔缔合和/或被纳米孔可检测到的时间量。在一些情况下，标签与纳米孔相互作用和/或与纳米孔缔合。与从纳米孔除去相比，标签可以相对更容易插入纳米孔中。在一些情况下，与离开纳米孔的标签相比，标签更快速和/或以较小的力进入纳米孔。一旦与纳米孔缔合，标签就可以与从其进入纳米孔的方向离开纳米孔的标签相比更快速和/或以较小的力穿过纳米孔。标签和纳米孔之间的缔合可以是任何合适的力或相互作用，诸如非共价键，可以是可逆的共价键，静电力或电动力或其任何组合。在一些情况下，标签被设计为与纳米孔相互作用，纳米孔被突变或设计为与标签相互作用，或者标签或纳米孔两者被设计或选择为与彼此形成缔合。标签和纳米孔之间的缔合可以是任何合适的强度。在一些情况下，缔合足够强，使得可以在不从纳米孔弹出标签的情况下对电极再充电。在一些情况下，可以反转跨纳米孔的电压极性以对电极再充电，并且再次反转以检测标签，而标签不离开纳米孔。图19显示一个实例，其中标记的核苷酸1902的标签部分在与聚合酶相反的纳米孔1901的侧上结合亲和配偶体(例如，亲和分子)或结合配偶体1903和/或与其相互作用。亲和分子或结合配偶体1903可以与纳米孔1901分离，但连接至纳米孔，或者作为替代方案，可以是纳米孔1901的一部分。结合配偶体可以附接至任何合适的表面，诸如纳米孔或膜。在一些实例中，可以使用标签分子和结合配偶体的任何合适的组合。在一些情况下，标签分子和结合配偶体包含彼此杂交的核酸分子。在一些情况下，标签分子和结合配偶体包含彼此结合的链霉抗生物素蛋白和生物素。作为替代方案，结合配偶体1903可以是纳米孔1901的一部分。图20显示一个实例，其中标记的核苷酸包含核苷酸部分2001和标签部分2002，其中标签部分是有倒钩的（barbed）。标签部分被成形(例如，有倒钩)，其方式使得标签沿其进入纳米孔的方向比流出纳米孔更容易(例如，更快速和/或以较小的力)流过纳米孔2003。在一个实施方案中，标签部分包含单链核酸，并且碱基(例如，a、c、t、g)以指向标记的核苷酸(即，有倒钩的)的核苷酸部分2001的角度连接至核酸标签的主链。作为替代方案，纳米孔可以包括襟翼或其他障碍物，其允许标签部分沿第一方向(例如，离开纳米孔)流动并阻止标签部分沿第二方向(例如，与第二方向相反的方向)流动。襟翼可以是任何铰链的障碍物。标签可以被设计或选择为(例如，使用定向进化)与纳米孔结合和/或缔合(例如，在纳米孔的孔部分中)。在一些实施方案中，标签是具有结合纳米孔的亲水、疏水、带正电荷和带负电荷的氨基酸残基的排列的肽。在一些实施方案中，标签是具有结合纳米孔的碱基的排列的核酸。纳米孔可以被突变为与标签分子缔合。例如，纳米孔可以被设计或选择为(例如，使用定向进化)具有结合标签分子的亲水、疏水、带正电荷和带负电荷的氨基酸残基的排列。氨基酸残基可以在纳米孔的前庭和/或孔中。从纳米孔排出标签本公开提供了从纳米孔排出标签分子的方法。例如，在其中标签位于纳米孔中或在核苷酸掺入事件后、诸如例如在测序期间呈递至纳米孔的情况下，芯片可适于排出标签分子。标签可以以其进入纳米孔的相反方向排出(例如，在标签不穿过纳米孔的情况下)—例如，标签可以从第一开口引导入纳米孔，并且从与第一开口不同的第二开口从纳米孔排出。或者，标签可以从其进入纳米孔的开口排出—例如，标签可以从第一开口引导入纳米孔中，并且从第一开口从纳米孔排出。本发明的一个方面提供了用于对核酸样品进行测序的芯片，所述芯片包含多个单独可寻址的纳米孔，所述多个中的单独可寻址的纳米孔具有在与集成电路相邻设置的膜中形成的至少一个纳米孔，每个纳米孔可寻址的纳米孔适于从纳米孔排出标签分子。在一些实施方案中，芯片适于在标签进入纳米孔的方向排出(或该方法排出)标签。在一些情况下，纳米孔用电压脉冲或一系列电压脉冲排出标签分子。电压脉冲可以具有约1纳秒至1分钟或10纳秒至1秒的持续时间。纳米孔可以适于在一段时间内排出(或该方法排出)标签分子，使得两个标签分子不同时存在于纳米孔中。在一些实施方案中，两个分子同时存在于纳米孔中的概率为至多1%、至多0.5%、至多0.1%、至多0.05%或至多0.01%。在一些情况下，纳米孔适于在标签进入纳米孔的约0.1ms、0.5ms、1ms、5ms、10ms或50ms内(小于其的时间段内)排出标签分子。可以使用电势(或电压)从纳米孔排出标签。在一些情况下，电压可以具有与用于将标签拉入纳米孔的极性相反的极性。可以借助以下周期的交流电(ac)波形施加电压：至少约1纳秒、10纳秒、100纳秒、500纳秒、1微秒、100微秒、1毫秒(ms)、5ms、10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、100ms、200ms、300ms、400ms、500ms、600ms、700ms、800ms、900ms、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、100秒、200秒、300秒、400秒、500秒或1000秒。交流电(ac)波形通过使核酸链穿过纳米孔对核酸分子进行测序可能需要施加直流电(例如，使得不反转分子移动通过纳米孔的方向)。然而，使用直流电持续长时间段操作纳米孔传感器可以改变电极的组成，使跨纳米孔的离子浓度失衡，并且具有其他不期望的影响。应用交流(ac)波形可以避免这些不期望的影响，并且具有如下所述的某些优点。本文所述的利用标记的核苷酸的核酸测序方法与ac施加的电压完全相容，且因此ac波形可用于实现所述优点。当使用牺牲电极或在载流反应中改变分子特征的电极(例如，包含银的电极)或在载流反应中改变分子特征的电极时，在检测周期期间对电极再充电的能力可能是有利的。电极在检测周期期间可能耗尽，尽管在一些情况下，电极在检测周期期间可能不耗尽。再充电可以防止电极达到给定耗尽极限，诸如变得完全耗尽，这在电极小时(例如，当电极足够小足以提供每平方毫米具有至少500个电极的电极阵列时)可能是问题。在一些情况下，电极寿命与电极的宽度成比例，并且至少部分取决于电极的宽度。在一些情况下，电极是多孔的和/或“海绵状的”。与无孔电极相比，多孔电极可以具有增强的双层对于本体液体的电容。多孔电极可以通过在洗涤剂存在的情况下将金属(例如贵金属)电镀至表面上而形成。电镀的金属可以是任何合适的金属。该金属可以是贵金属(例如，钯、银、锇、铱、铂、银或金)。在一些情况下，该表面是金属表面(例如，钯、银、锇、铱、铂、银或金)。在一些情况下，表面直径为约5微米且光滑。去污剂可以在表面形成纳米级的空隙，使其为多孔或“海绵状”。产生多孔和/或海绵状电极的另一种方法是沉积金属氧化物(例如，氧化铂)并使其暴露于还原剂(例如，4%h2)。还原剂可以将金属氧化物(例如，氧化铂)还原成金属(例如，铂)，并且这样做提供海绵状和/或多孔电极。(例如，钯)海绵可以吸收电解质并产生大有效表面积(例如每平方微米电极上下面积33皮法拉)。如本文所述，通过使其多孔来增加电极的表面积可以产生具有不变得完全耗尽的电容的电极。在一些情况下，需要在检测长时间段期间(例如，当通过使核酸穿过纳米孔而对核酸进行测序时)维持跨纳米孔的保守极性的电压差耗尽电极，并且可以限制检测的持续时间和/或电极的大小。本文描述的装置和方法允许更长的(例如，无限的)检测时间和/或可以按比例缩小至任意小的大小的电极(例如，受除了检测期间的电极耗尽以外的考虑所限制)。如本文所述，可以仅持续标签与聚合酶缔合的一部分时间检测到标签。在检测时段之间切换跨纳米孔的电压的极性和/或幅度(例如，施加ac波形)允许对电极再充电。在一些情况下，多次检测到标签(例如，在100毫秒时段中2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000、100,000、1,000,000或更多次)。在一些情况下，周期性地反转跨纳米孔的电压的极性。可以在持续任何合适的时间量(例如，约1ms、约5ms、约10ms、约15ms、约20ms、约25ms、约30ms、约40ms、约50ms、约60ms、约80ms、约100ms、约125ms、约150ms、约200ms等)的检测时段之后，可以反转电压的极性。在对电极再充电的时段期间(即，当电压的极性与用于标签检测的电压的极性相反时)的时间段和电场强度使得电极恢复至其在检测之前的状态(例如，电极质量)。在一些情况下，跨纳米孔的净电压为零(例如，在合适长的时间尺度诸如1秒、1分钟或5分钟，正电压的时段抵消负电压的时段)。在一些情况下，施加至纳米孔的电压是平衡的，使得存在与纳米孔相邻或接近的传感电极检测到的净零电流。在一些实例中，将交流电(ac)波形施加至膜中的纳米孔或与膜相邻的电极，以通过或接近于纳米孔吸引标签并释放标签。ac波形可以具有大约至少10微秒、1毫秒(ms)、5ms、10ms、20ms、100ms、200ms、300ms、400ms、500ms的频率。波形可以帮助交替地且依次地捕获标签并释放标签，或者以其他方式在多个方向(例如，相反的方向)移动标签，这可以增加标签与纳米孔缔合的总时间段。充电和放电的这种平衡可以允许从纳米孔电极和/或给定标签生成更长的信号。在一些实例中，施加ac波形以将与标记的核苷酸(例如，掺入的标记的核苷酸)缔合的标签的至少一部分重复地引导至纳米孔中，并将标签的至少一部分引导出纳米孔。标签或与标签偶联的核苷酸可以被酶(例如，聚合酶)保持。被酶保持的单个标签的这种重复装载和排出可以有利地提供更多的机会来检测标签。例如，如果标签被酶保持40毫秒(ms)并且施加高ac波形5ms(以将标签引导至纳米孔中)并且施加低ac波形5ms(以将标签引导出纳米孔)，纳米孔可用于读取标签近似4次。多次读取可以实现校正错误，诸如与穿入和/或穿出纳米孔的标签相关的错误。波形可以具有任何合适的形状，包括规则形状(例如，在一段时间内重复)和不规则形状(例如，在任何合适的长时间段(诸如1小时、1天或1周)内不重复)。图21显示一些合适的(有规律的)波形。波形的实例包括三角波，(小图a)正弦波(小图b)，锯齿波，方波等。跨纳米孔的电压的极性的反转(即，从正至负或从负至正)，诸如在施加交流电(ac)波形后，可以出于任何原因进行，包括，但不限于，(a)对电极充电(例如，改变金属电极的化学组成)，(b)再平衡膜的顺侧和反侧的离子浓度，(c)重新建立跨纳米孔的非零施加的电压，和/或(d)改变双层电容(例如，将存在于金属电极和分析物界面处的电压或电荷重新设置为期望的水平，例如零)。图21c显示跨纳米孔的零电势差处的水平虚线，其中正电压与幅度成比例地向上延伸，且负电压与幅度成比例地向下延伸。无论波形的形状如何，“占空比”将正方向2100的电压vs时间图的组合曲线下面积与负方向2101的组合曲线下面积进行比较。在一些情况下，正区域2100等于负区域2101(即，净占空比为零)，然而，ac波形可以具有任何占空比。在一些情况下，可以使用具有最佳占空比的ac波形的公正使用，以实现以下中的任何一种或多种：(a)电化学平衡电极(例如，既不带电也不耗尽)，(b)平衡膜的顺侧和反侧之间的离子浓度，(c)跨纳米孔施加的电压是已知的(例如，因为电极上的电容性双层被定期重置，并且每次极性翻转时电容器放电至相同程度)，(d)在纳米孔中多次鉴别标签分子(例如，通过每次极性翻转排出并重新捕获标签)，(e)从标签分子的每次读取捕获额外信息(例如，因为测量的电流可能是对于每个标签分子施加的电压的不同函数)，(f)实现高密度的纳米孔传感器(例如，因为金属电极组成没有变化，其不受构成电极的金属量限制)，和/或(g)实现芯片的低功耗。这些益处可以允许装置的连续扩展操作(例如，至少1小时，至少1天，至少1周)。在一些情况下，在跨纳米孔施加正电势后，测量第一电流，并且在跨纳米孔施加负电势(例如，绝对幅度等于正电势)后，测量第二电流。第一电流可以等于第二电流，尽管在一些情况下，第一电流和第二电流可以不同。例如，第一电流可以小于第二电流。在一些情况下，仅测量正电流和负电流之一。在一些情况下，纳米孔在相对低的幅度电压下(例如，图21，指示2100)持续相对长的时间段检测到标记的核苷酸，并且在相对大的幅度电压下(例如，图21，指示2101)持续相对短的时间段对电极再充电。在一些情况下，检测的时间段比电极再充电的时间段长至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少8、至少10、至少15、至少20或至少50倍。在一些情况下，响应于输入而改变波形。在一些情况下，输入是电极的耗尽水平。在一些情况下，电压的极性和/或幅度至少部分地基于电极的耗尽或载流离子的耗尽而改变，并且波形是不规则的。在短时间段内(例如，在小于约5秒、小于约1秒、小于约500ms、小于约100ms、小于约50ms、小于约10ms或小于约1ms的时段内)重复检测和再充电电极的能力允许使用相对于可以维持恒定直流(dc)电势和dc电流并用于对穿过纳米孔的多核苷酸进行测序的电极较小的电极。较小的电极可以允许表面上大量的检测位点(例如，包含电极、传感电路、纳米孔和聚合酶)。该表面包含任何合适密度的离散位点(例如，适合于在给定量的时间内或以给定的成本对核酸样品进行测序的密度)。在一个实施方案中，该表面具有每1mm2大于或等于约500个位点的离散位点的密度。在一些实施方案中，该表面具有每1mm2约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或约500000个位点的离散位点的密度。在一些实施方案中，该表面具有每1mm2至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000或至少约500000个位点的离散位点的密度。可以在核苷酸掺入事件之前、之间、期间或之后对电极再充电。在一些情况下，电极在约20毫秒(ms)、约40ms、约60ms、约80ms、约100ms、约120ms、约140ms、约160ms、约180ms或约200ms中再充电。在一些情况下，电极在小于约20毫秒(ms)、小于约40ms、小于约60ms、小于约80ms、小于约100ms、小于约120ms、小于约140ms、小于约160ms、小于约180ms、约200ms、小于约500ms或小于约1秒中再充电。能够区分切割和未切割的标签的芯片另一个方面提供了用于对核酸样品进行测序的芯片。在一个实例中，芯片包含多个单独可寻址的纳米孔。所述多个中的单独可寻址的纳米孔可以具有在与集成电路相邻设置的膜中形成的至少一个纳米孔。每个单独可寻址的纳米孔可适于确定标签分子是否与核苷酸结合或不与核苷酸结合或读取不同标签之间的变化。在一些情况下，芯片可以包含多个单独可寻址的纳米孔。所述多个中的单独可寻址的纳米孔可以具有在与集成电路相邻设置的膜中形成的至少一个纳米孔。每个单独可寻址的纳米孔可适于确定标签分子与掺入的(例如，聚合的)核苷酸结合还是与未掺入的核苷酸结合。本文所述的芯片可能能够区分释放的标签和未释放的标签(例如，图4中的dvs.f)。在一些实施方案中，芯片能够以以下准确度区分释放的标签和未释放的标签：至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约99%、至少约99.5%、至少约99.9%、至少约99.95%或至少约99.99%。当检测约5、4、3或2个连续核苷酸的组时，可以实现准确度水平。在一些情况下，实现单碱基分辨率(即，1个连续核苷酸)的准确度。本文所述的芯片可能能够区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸(例如，图5中的506和505)。在一些实施方案中，芯片能够以以下准确度区分掺入的标记的核苷酸和未掺入的标签核苷酸：至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约99%、至少约99.5%、至少约99.9%、至少约99.95%或至少约99.99%。当检测约5、4、3或2个连续核苷酸的组时，可以实现准确度水平。在一些情况下，实现单碱基分辨率(即，1个连续核苷酸)的准确度。纳米孔可以帮助至少部分地基于电信号的差异来确定标签分子与核苷酸结合还是不与核苷酸结合。在一些情况下，纳米孔可以帮助至少部分地基于纳米孔中的停留时间来确定标签分子与核苷酸结合还是不与核苷酸结合。纳米孔可以至少部分地基于脱落电压(标签或标记的核苷酸离开纳米孔的电压)来帮助确定标签分子与核苷酸结合还是不与核苷酸结合。能够捕获高比例的切割的标签的芯片另一个方面提供了用于对核酸样品进行测序的芯片。在一个实例中，芯片包含多个单独可寻址的纳米孔。所述多个中的单独可寻址的纳米孔可以包括在与集成电路相邻设置的膜中形成的至少一个纳米孔。每个单独可寻址的纳米孔可适于捕获在掺入(例如，聚合)标记的核苷酸后释放的大多数标签分子。芯片可以被配置为捕获任何合适地高百分比的标签(例如，以便以合适高准确度测定核酸序列)。在一些实施方案中，芯片捕获所述标签分子中的至少90%、至少99%、至少99.9%或至少99.99%。在一些实施方案中，纳米孔在单一电流水平下捕获多个不同的标签分子(例如，在掺入四种核苷酸后释放的四种独特的标签分子)。该芯片可适于以与释放标签分子相同的顺序捕获标签分子。装置设置图8示意性地举例说明纳米孔装置100(或传感器)，其可用于对核酸进行测序和/或检测标签分子，如本文所述。含有脂质双层的纳米孔可以通过电阻和电容表征。纳米孔装置100包括在导电固体基底106的脂质双层相容表面104上形成的脂质双层102，其中脂质双层相容表面104可以通过脂质双层不相容表面105分隔，且导电固体基底106可以通过绝缘材料107电隔离，且其中脂质双层102可以被在脂质双层不相容表面105上形成的无定形脂质103包围。脂质双层102可以用单个纳米孔结构108嵌入，所述单个纳米孔结构108具有足够大的纳米孔110，足以使所表征的标签分子和/或小离子(例如，na+、k+、ca2+、cl-")在脂质双层102的两侧之间穿过。一层水分子114可以被吸附在脂质双层相容表面104上，并被夹在脂质双层102和脂质双层相容表面104之间。吸附在亲水性脂质双层相容表面104上的水膜114可以促进脂质分子的有序化并且促进脂质双层相容表面104上的脂质双层的形成。可以在脂质双层102上方提供含有核酸分子112和标记的核苷酸的溶液的样品室116。所述溶液可以是含有电解质的水溶液，并被缓冲至最佳离子浓度并维持在最佳ph以保持纳米孔110开放。所述装置包括与可变电压源120耦合的一对电极118(包括负节点118a和正节点118b)，用于提供跨脂质双层的电刺激(例如，偏压)和用于传感脂质双层的电特性(例如，电阻、电容和离子电流)。正电极118b的表面是或形成脂质双层相容表面104的一部分。导电固体基底106可以耦合至电极118之一或形成电极118之一的一部分。装置100还可以包括电路122，用于控制电刺激和用于处理检测到的信号。在一些实施方案中，可变电压源120被包括为电路122的一部分。电路122可以包括放大器、积分器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其他组件。电路122可以是集成在硅基底128内的集成电路，并且可以进一步耦合至与存储器126耦合的计算机处理器124。脂质双层相容表面104可以由适合于离子转导和气体形成以促进脂质双层形成的各种材料形成。在一些实施方案中，可以使用导电或半导电的亲水材料，因为它们可以允许更好地检测脂质双层电特性的变化。示例性材料包括ag-agcl、au、pt或掺杂的硅或其他半导体材料。在一些情况下，电极不是牺牲电极。脂质双层不相容表面105可以由不适合于脂质双层形成的各种材料形成，并且它们通常是疏水的。在一些实施方案中，非导电的疏水材料是优选的，因为除了使脂质双层区域与彼此分开之外，其还使脂质双层区域电绝缘。示例性的脂质双层不相容材料包括例如氮化硅(例如，si3n4)和teflon，用疏水分子硅烷化的氧化硅(例如，sio2)。在一个实例中，图8的纳米孔装置100是具有在铝材料106上涂覆的脂质双层相容的银(ag)表面104上形成的二植烷酰基磷脂酰胆碱(dphpc)脂质双层102中嵌入的单个α溶血素(ahl)蛋白108的α溶血素(ahl)纳米孔装置。脂质双层不相容的ag表面104通过脂质双层不相容的氮化硅表面105隔离，并且铝材料106通过氮化硅材料107电绝缘。铝106耦合至集成在硅基底128中的电路122。放置在芯片上或从盖板128向下延伸的银-氯化银电极与含有核酸分子的水溶液接触。ahl纳米孔是七个单独肽的组件。ahl纳米孔的入口或前庭直径为近似26埃，其宽度足以容纳dsdna分子的一部分。从前庭起，ahl纳米孔首先变宽，且然后变窄成具有近似15埃的直径的桶，其宽度足以允许单个ssdna分子(或较小的标签分子)穿过，但不足够宽以允许dsdna分子(或更大的标签分子)穿过。除了dphpc以外，纳米孔装置的脂质双层可以由各种其他合适的两亲材料组装而成，所述材料基于各种考虑进行选择，诸如使用的纳米孔的类型，表征的分子的类型，以及形成的脂质双层的各种物理、化学和/或电特性，诸如形成的脂质双层的稳定性和渗透性、电阻和电容。实例两亲性材料包括各种磷脂，诸如棕榈酰基-油酰基-磷脂酰-胆碱(popc)和二油酰基-磷脂酰-甲基酯(dopme)，二植酰基磷脂酰胆碱(dphpc)，1,2-二-o-植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dophpc)，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，磷脂酰肌醇，磷脂酰甘油和鞘磷脂。除了上面显示的ahl纳米孔以外，纳米孔还可以是各种其他类型的纳米孔。实例包括γ-溶血素、杀白细胞素、蜂毒肽、耻垢分枝杆菌孔蛋白a(mspa)和各种其他天然存在的、修饰的天然的和合成的纳米孔。可以基于分析物分子的各种特征、诸如与纳米孔的孔径有关的分析物分子的大小来选择合适的纳米孔。例如，具有近似15埃的限制性孔径的ahl纳米孔。电流测量在一些情况下，可以在不同的施加电压下测量电流。为了实现这一点，可以将期望的电势施加至电极，并且随后可以在整个测量过程中维持施加的电势。在一种实施方式中，如下所述，运算放大器积分器拓扑可用于此目的。积分器通过电容反馈的方式维持电极处的电势。积分器电路可以提供出色的线性度、单元间匹配(cell-to-cellmatching)和偏移特征。运算放大器积分器通常需要较大的大小来实现所需的性能。下面描述更紧凑的积分器拓扑。在一些情况下，可以将电压电势“v液体”施加至室，该室为芯片上的所有单元提供共同的电势(例如，350mv)。积分器电路可以将电极(其在电气上是积分电容器的顶板)起始至大于共同的液体电势的电势。例如，以450mv偏置可以在电极和液体之间给予100mv正电势。该正电压电势可以引起电流从电极流至液体室接触点。在该情况下，载流子是：(a)通过孔从双层的电极(反侧)流至双层的储液器(顺侧)的k+离子，和(b)反侧上的氯(cl-)离子，其根据以下电化学反应与银电极反应：ag+cl-agcl+e-。在一些情况下，k+从封闭的室流出(从双层的反侧至顺侧)，而cl-转化为氯化银。双层的电极侧可能由于电流流动而变得脱盐。在一些情况下，银/氯化银液体海绵状材料或基质可以充当储存器，以提供反向反应中的cl-离子，所述反向反应在电室触点处发生以完成电路。在一些情况下，电子最终流到积分电容器的顶侧，其产生被测量的电流。电化学反应将银转化为氯化银，并且仅电流将继续流动，只要存在可用的银被转化。在一些情况下，有限的银供应导致电流依赖性的电极寿命。在一些实施方案中，使用未耗尽的电极材料(例如，铂)。当将恒定电势施加至纳米孔检测器时，标签可以调节流过纳米孔的离子电流，允许记录电流以确定标签的身份。然而，恒定电势可能不足以区分不同的标签(例如，与a、c、t或g缔合的标签)。在一个方面，可以改变施加的电压(例如，在一定范围的电压上扫过)以鉴别标签(例如，具有至少90%、至少95%、至少99%、至少99.9%或至少99.99%的置信度)。可以以任何合适的方式，包括根据图21中显示的任何波形，来改变施加的电压。电压可以在任何合适的范围(包括从约120mv至约150mv，从约40mv至约150mv)内变化。图22显示核苷酸腺嘌呤(a，绿色)、胞嘧啶(c，蓝色)、鸟嘌呤(g，黑色)和胸腺嘧啶(t，红色)的提取信号(例如，差分对数电导(dlc))vs.施加的电压。图23显示多种核苷酸的相同信息(许多实验试验)。如此处所见，胞嘧啶在120mv相对容易与胸腺嘧啶区分，但在150mv难以与彼此相互区分(例如，因为提取的信号在150mv对于c和t是近似相等的)。同样，胸腺嘧啶在120mv难以与腺嘌呤区分，但在150mv相对更容易区分。因此，在一个实施方案中，施加的电压可以从120mv至150mv变化以区分核苷酸a、c、g和t中的每一个。图24显示核苷酸腺嘌呤(a，绿色)、胞嘧啶(c，蓝色)、鸟嘌呤(g，黑色)和胸腺嘧啶(t，红色)的作为施加的电压的函数的百分比参考导电差异(%rcd)。绘制%rcd(其基本上是针对30t参考分子参考的每个分子的电导率的差异)可以消除实验之间的偏移和增益变化。图24包括来自17/20试验的第一部分的单个dna波形。对于所有17个良好试验，所有单核苷酸dna的%rcd捕获数为50至200。指示其中每个核苷酸可区分的电压。尽管图22-24显示核苷酸对于改变的施加电压的响应，但改变的施加电压的概念可以用于区分标签分子(例如，附接至标记的核苷酸)。单元电路单元电路的实例显示于图12中。将施加的电压va施加至mosfet电流传输门1201之前的运算放大器1200。此处还显示电极1202以及通过装置1203检测到的核酸和/或标签的电阻。施加的电压va可以驱动电流传输门1201。然后电极上的所得电压为va-vt，其中vt是mosfet的阈值电压。在一些情况下，这导致施加至电极的实际电压的有限控制，因为mosfet阈值电压可以随着工艺、电压、温度和甚至在芯片内的装置之间而显著变化。该vt变化在低电流水平可以更大，其中亚阈值泄漏效应可以发挥作用。因此，为了提供施加的电压的更好控制，可以在具有电流传输装置的跟随器反馈配置中使用运算放大器。这确保施加至电极的电压是va，不依赖于mosfet阈值电压的变化。单元电路的另一个实例显示于图10中，并且包括积分器、比较器和数字逻辑，用于移入控制位并同时移出比较器输出的状态。单元电路可适于与本文提供的系统和方法一起使用。b0至b1线可以从移位寄存器出来。库内的所有单元共享模拟信号，而数字线可以从单元菊花链至单元。单元数字逻辑包含5位数据移位寄存器(dsr)、5位并行负载寄存器(plr)、控制逻辑和模拟积分器电路。使用lin信号，移入dsr的控制数据被并行装载至plr中。这5位控制数字“先断后通(break-before-make)”时序逻辑，其控制单元中的开关。另外，数字逻辑具有置位复位(sr)锁存器，以记录比较器输出的切换。该架构递送与单个单元电流成比例的可变样品率。较高的电流可以导致每秒比较低电流更多的样品。电流测量的分辨率与所测量的电流相关。可以用比大电流更精细的分辨率来测量小电流，这可能是优于固定分辨率测量系统的益处。存在模拟输入，其允许用户通过改变积分器的电压摆幅来调节采样率。可能增加采样率以分析生物学快的过程或减慢采样率(且由此获得准确度)以便分析生物学慢的过程。将积分器的输出初始化为电压lvb(低电压偏置)，并积分至电压cmp。每次积分器输出在这两个水平之间摆动时，生成样品。因此，电流越大，积分器输出摆动越快，且因此采样率越快。类似地，如果降低cmp电压，则生成新样品所需的积分器的输出摆动减小，且因此采样率增加。因此，简单地减小lvb和cmp之间的电压差提供了增加采样率的机制。基于纳米孔的测序芯片可以并入配置为阵列的大量自主操作或单独可寻址的单元。例如，一百万个单元的阵列可以由1000行单元乘以1000列单元构成。当例如通过纳米孔检测到核苷酸掺入事件后释放的标签时，该阵列通过测量电导差来实现核酸分子的平行测序。此外，该电路实施允许确定孔-分子复合物的电导特性，这在区分标签中可以是有价值的。集成的纳米孔/双层电子单元结构可以施加适当的电压以便进行电流测量。例如，可能有必要同时(a)控制电极电压电势和(b)监视电极电流以正确地执行。而且，可能有必要彼此独立地控制单元。需要单元的独立控制，以便管理可能处于不同物理状态的大量单元。施加至电极的分段线性电压波形刺激的精确控制可用于在单元的物理状态之间转变。为了减小电路大小和复杂性，提供施加两个单独电压的逻辑可能是足够的。这允许施加两个独立的单元分组和相应的状态转换刺激。状态转换本质上是随机的，发生的概率相对低。因此，能够断言适当的控制电压并随后进行测量以确定是否已经发生期望的状态转变可能是非常有用的。例如，可以将适当的电压施加至单元，且然后测量电流以确定是否已经形成双层。单元分为两组：(a)具有双层形式且不再需要具有施加的电压的那些。这些单元可能具有施加的0v偏压，以实现无效操作(nop)-其保持在相同的状态，和(b)没有形成的双层的那些。这些单元将再次具有施加的双层形成电压。通过将可允许的施加电压限制于两者并在物理状态之间迭代转变成批的单元，可以实现大大简化和电路大小减小。例如，通过限制可允许的施加电压，可以减少至少1.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100倍。使用紧凑的测量电路的本发明的又另一种实施方式显示于图11中。在一些情况下，紧凑的测量电路可用于实现本文所述的高阵列密度。还设计该电路以便向电极施加电压，同时测量低水平电流。该单元作为超紧凑型积分器(uci)操作，并且此处描述基本操作。该单元通过electrod-sense(elsns)连接电连接至电化学活性电极(例如agcl)。nmos晶体管m11执行两种独立的功能：(1)作为源极跟随器操作以向由(vglvtl)给出的elsns节点施加电压，并且(2)作为电流传输器操作以将电子从电容器c1移动至elsns节点(且反之亦然)。在一些情况下，可以将受控电压电势施加至elsns电极，并且这可以简单地通过改变电极源跟随器ml1的门上的电压来改变。此外，来自m11源引脚的任何电流都直接且准确地传播至m11漏极引脚，在这里它可以累积在电容器co上。因此m11和co一起充当超紧凑的积分器。该积分器可用于通过根据以下测量积分至电容器上的电压的变化来确定向/从电极流动/凹陷的电流：i*t=c*v，其中i是电流，t是时间，c是电容，且v是电压变化。在一些情况下，以固定间隔t(例如，每1ms)测量电压变化。晶体管m2可以被配置为源极跟随器，以便缓冲电容器电压并提供积分电压的低阻抗表示。这样防止电荷共享改变电容器上的电压。晶体管m3可以用作行访问设备，其中模拟电压输出aout连接为与许多其他单元共享的列。仅启用单行列连接的aout信号，使得测量单个单元的电压。在替代实施方式中，可以通过将晶体管m2的漏极连接至行可选择的“开关轨”来省略晶体管m3。晶体管m4可以用于将单元重新设置至预定的起始电压，从其积分电压。例如，向rst和rv两者施加高电压(例如：至vdd=1.8v)将电容器上拉至预充电值(vdd–vt5)。由于重新设置开关热噪声(sqrt(ktc)噪声)，确切的起始值可以从单元至单元(由于m4和m2的vt变化)以及从测量至测量变化。作为结果，相关的双采样(cds)技术用于测量积分器起始电压和终止电压，以确定积分时段期间的实际电压变化。还注意，晶体管m4的漏极可以连接至受控的电压rv(重新设置电压)。在正常操作中，可以将这驱动至vdd，然而也可以将其驱动至低电压。如果实际上将m4的“漏极”驱动到地，则可以反转电流(即，电流可以通过m1和m4从电极流入电路，并且可以交换源极和漏极的概念)。在一些情况下，当以这种模式操作电路时，施加至电极的负电压(相对于液体参考)由该rv电压控制(假设vg1和vg5至少是大于rv的阈值)。因此，rv上的接地电压可用于向电极施加负电压(例如，完成电穿孔或双层形成)。模数转换器(adc，未显示)在重新设置后立即测量aout电压，并在积分时段之后再次测量aout电压(进行cds测量)，以确定固定时间段期间的积分电流。并且adc可以按列实施，或者将用于每个列的单独晶体管作为模拟多路复用器实施，以在多个列之间共享单个adc。该列多路复用因子可以根据对噪声、准确度和通量的要求而变化。在任何给定时间，每个单元可能处于四种不同的物理状态之一：(1)与液体短路，(2)形成的双层，(3)双层+孔，(4)双层+孔+核酸和/或标签分子。在一些情况下，施加电压以便在状态之间移动单元。nop操作用于将单元格保持在特定的期望状态，而其他单元格用施加的电势刺激以从一种状态移动至另一种状态。这可以通过具有两个(或更多个)不同的电压来实现，该电压可以施加至m1源极跟随器的栅电压，其间接地用于控制相对于液体电势施加至电极的电压。因此，晶体管m5用于施加电压a，而晶体管m6用于施加电压b。因此，m5和m6一起作为模拟多路复用器工作，其中sela或selb被驱动为高水平以选择电压。由于每个单元可能处于可能的不同状态，并且由于sela和selb是互补的，因此可以在每个单元中使用存储元件以在电压a或b之间进行选择。该存储元件可以是动态元件(电容器)，其在每个循环或简单的作弊器-闭锁存储元件(交叉耦合逆变器)上更新。运算放大器测试芯片结构在一些实例中，测试芯片包括在四个单独的组(又称库)中排列的264个传感器的阵列，每组66个传感器单元。每组进而分为三“列”，每列中有22个传感器“单元”。考虑到理想地由双脂质层和插入的纳米孔组成的虚拟单元应当在阵列中264个传感器各自的上方形成，“单元”名称是适当的(尽管只有一部分传感器单元如此定位，装置可以成功地操作)。存在单个模拟i/o垫，其向安装在冲模的表面的导电圆柱体内含有的液体施加电压。这种“液体”电势被施加至孔的顶侧，并且对于检测器阵列中的所有单元都是共有的。孔的底侧具有暴露的电极，并且每个传感器单元可以向其电极施加不同的底侧电势。然后，在顶部液体连接和孔的底侧上每个单元的电极连接之间测量电流。传感器单元测量通过孔的电流，如由在孔内穿过的标签分子的调节。在一些情况下，五位控制每个传感器单元的模式。继续参考图9，可以单独控制阵列中的264个单元中的每一个。值分别应用于一组66个单元。通过将330个(66*5位/单元)数字值串行移入datashiftregister(dsr)，控制组中66个单元各自的模式。对于每组66个单元，使用kin(时钟)和din(数据输入)引脚与单独的引脚对将这些值移入阵列。因此，使用330个时钟将330位移位至dsr移位寄存器中。当相应的lin<i>(负载输入)置为高时，第二个330位并行装载寄存器(plr)从该移位寄存器并行装载。在并行装载plr的同时，将单元的状态值装载至dsr中。完整的操作可以由将330个数据位移入dsr的330个时钟、将lin信号置为高的单个时钟周期、随后是读取移出dsr的捕获状态数据的330个时钟周期组成。对该操作进行流水线处理，使得可以在从阵列中读出330位的同时将新的330位移入dsr。因此，以50mhz时钟频率，读取的周期时间为331/50mhz=6.62us。用于测序的纳米孔的阵列本公开提供了用于对核酸进行测序的纳米孔检测器(或传感器)的阵列。参考图7，可以在纳米孔检测器的阵列上对多种核酸分子进行测序。此处，每个纳米孔位置(例如，701)包含纳米孔，在一些情况下，其附接至聚合酶和/或磷酸酶。在每个阵列位置处通常也存在传感器，如本文其他地方所述。在一些实例中，提供了附接至核酸聚合酶的纳米孔阵列，并且用聚合酶掺入标记的核苷酸。在聚合期间，标签被纳米孔检测到(例如，通过释放并穿入或穿过纳米孔，或通过呈递至纳米孔)。纳米孔的阵列可以具有任何合适数目的纳米孔。在一些情况下，所述阵列包含约200、约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约10000、约15000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000、约200000、约400000、约600000、约800000、约1000000等个纳米孔。在一些情况下，所述阵列包含至少200、至少400、至少600、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少10000、至少15000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000、至少200000、至少400000、至少600000、至少800000或至少1000000个纳米孔。在一些情况下，单个标签在掺入单个核苷酸后释放和/或呈递并被纳米孔检测到。在其他情况下，多个标签在掺入多个核苷酸后释放和/或呈递。与纳米孔相邻的纳米孔传感器可以检测单个标签或多个标签。与多个标签相关的一个或多个信号可以被检测和处理以产生平均信号。标签可以被传感器检测为时间的函数。随着时间检测到的标签可以用于测定核酸样品的核酸序列，诸如借助计算机系统(参见，例如，图16)，所述计算机系统被编程为记录传感器数据并从该数据生成序列信息。纳米孔检测器的阵列可以具有高密度的离散位点。例如，每单位面积相对大量的位点(即密度)允许构建较小的装置，所述装置是便携式的，低成本的或具有其他有利特征。阵列中的单个站点可以是单独可寻址的位点。大量包含纳米孔和传感电路的位点可以允许一次测序相对大量的核酸分子，诸如，例如，通过平行测序。这种系统可以增加通量和/或降低对核酸样品进行测序的成本。可以使用具有基底的传感器(或检测器)对核酸样品进行测序，所述基底具有包含离散位点的表面，每个单个位点具有纳米孔、聚合酶以及在一些情况下至少一种附接至纳米孔的磷酸酶和与纳米孔相邻的传感电路。所述系统可以进一步包含与基底流体连通的流通室，该流通室适于将一种或多种试剂递送至基底。该表面包含任何合适密度的离散位点(例如，适合于在给定量的时间内或以给定的成本对核酸样品进行测序的密度)。每个离散站点可以包括传感器。该表面可以具有每1mm2大于或等于约500个位点的离散位点的密度。在一些实施方案中，该表面具有每1mm2约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或约500000个位点的离散位点的密度。在一些情况下，该表面具有每1mm2至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000或至少500000个位点的离散位点的密度。标记的核苷酸在一些情况下，标记的核苷酸包含能够在核苷酸掺入事件中切割并借助纳米孔检测的标签。标签可以附接至核苷酸的5’-磷酸酯。在一些情况下，所述标签不是荧光团。所述标签可以通过其电荷、形状、大小或其任何组合来检测。标签的实例包括各种聚合物。每种类型的核苷酸(即，a、c、g、t)通常包含独特的标签。标签可以位于核苷酸上的任何合适的位置。图13提供了标记的核苷酸的实例。此处，r1通常是oh，且r2是h(即，对于dna)或oh(即，对于rna)，尽管其他修饰是可接受的。在图13中，x是任何合适的接头。在一些情况下，接头是可切割的。接头的实例包括但不限于o、nh、s或ch2。用于位置z的合适的化学基团的实例包括o、s或bh3。该碱基是适合于掺入核酸的任何碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其衍生物。在一些情况下，通用碱基也是可接受的。磷酸酯的数量(n)是任何合适的整数值(例如，磷酸酯的数量，使得核苷酸可以被掺入核酸分子中)。在一些情况下，所有类型的标记的核苷酸都具有相同数量的磷酸酯，但这不是需要的。在一些应用中，每种类型的核苷酸存在不同的标签，并且磷酸酯的数量不一定用于区分各种标签。然而，在一些情况下，多于一种类型的核苷酸(例如，a、c、t、g或u)具有相同的标签分子，并且区分一种核苷酸与另一种的能力至少部分通过磷酸酯的数量来确定(其中各种类型的核苷酸对于n具有不同的值)。在一些实施方案中，n的值是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。下面描述合适的标签。在一些情况下，所述标签具有的电荷相对于化合物的剩余部分上的电荷符号相反。当附接标签时，整个化合物上的电荷可能是中性的。标签的释放可以产生两个分子，带电荷的标签和带电荷的核苷酸。带电荷的标签穿过纳米孔并且在一些情况下被检测到。合适的标记的核苷酸的更多实例显示于图14中。标签可以附接至糖分子、碱基分子或其任何组合。参考图13，y是标签，且x是接头(在一些情况下是可切割的)。此外，r1，如果存在，通常是oh、-och2n3或-o-2-硝基苄基，并且r2，如果存在，通常是h。而且，z通常是o、s或bh3，并且n是包括1、2、3或4的任何整数。在一些情况下，a是o、s、ch2、chf、cff或nh。继续参考图14，每种dnpp类似物上的碱基的类型通常与其他三种dnpp类似物各自上的碱基的类型不同，并且每种dnpp类似物上的标签的类型通常与其他三种dnpp类似物各自上的碱基的类型不同。合适的碱基包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其各自的衍生物。在一些情况下，碱基是7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶之一。在其中r1是-o-ch2n3的情况下，该方法可以进一步包括处理掺入的dnpp类似物，以除去-ch2n3并产生附接至3’位置的oh基团，由此允许掺入另外的dnpp类似物。在其中r1是-o-2-硝基苄基的情况下，该方法可以进一步包括处理掺入的核苷酸类似物，以除去-2-硝基苄基并产生附接至3’位置的oh基团，由此允许掺入另外的dnpp类似物。标签的实例标签可以是能够在纳米孔中被检测到的任何化学基团或分子。在一些情况下，标签包含乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂族酸、芳族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合中的一种或多种。还考虑标签进一步包含适当数量的赖氨酸或精氨酸以平衡化合物中的磷酸酯的数量。在一些情况下，所述标签是聚合物。聚乙二醇(peg)是聚合物的一个实例，并且具有如下结构：可以使用任何数量的乙二醇单元(w)。在一些情况下，w是0和100之间的整数。在一些情况下，对于每种类型的核苷酸，乙二醇单元的数目是不同的。在一个实施方案中，四种类型的核苷酸包含具有16、20、24或36个乙二醇单元的标签。在一些情况下，所述标签进一步包含额外的可鉴别部分，诸如基于香豆素的染料。在一些情况下，所述聚合物是带电荷的。在一些情况下，所述聚合物不带电荷，并且在高浓度的盐(例如，3-4m)中检测到标签。如本文所用，术语“烷基”包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基，并且可以是未取代的或取代的。如本文所用，“烯基”是指直链或支链的非芳族烃基，其含有至少1个碳碳双键，并且可以存在最多达最大数目的非芳族碳-碳双键，并且可以是未取代或取代的。术语“炔基”是指直链或支链的烃基，其含有至少1个碳碳三键，并且可以存在最多达最大可能数目的非芳族碳-碳三键，并且可以是未取代或取代的。术语“取代的”是指如上所述的官能团，诸如烷基或烃基，其中至其中含有的氢原子的至少一个键被至非氢或非碳原子的键替换，条件是维持正常的化合价，并且所述取代产生稳定的化合物。取代的基团还包括其中至碳或氢原子的一个或多个键被至杂原子的一个或多个键(包括双键或三键)替换的基团。在一些情况下，标签仅能够以一个方向(例如，没有反转方向)穿过纳米孔。标签可以具有附接至标签的铰链门，所述铰链门足够薄足以以当门在一个方向而不是在另一个方向与标签对齐时穿过纳米孔。参考图31，本公开提供了标签分子，其包含第一聚合物链3105，所述第一聚合物链3105包含第一区段3110和第二区段3115，其中第二区段比第一区段更窄。第二区段可以具有小于纳米孔的最窄开口的宽度。标签分子可以包括包含两个末端的第二聚合物链3120，其中第一末端固定至与第二区段相邻的第一聚合物链，且第二末端不固定至第一聚合物链。标签分子能够以第一方向穿过纳米孔，其中第二聚合物链与第二区段3125相邻对齐。在一些情况下，标签分子不能以第二方向穿过纳米孔，其中第二聚合物链不与第二区段3130相邻对齐。第二方向可以与第一方向相反。第一和/或第二聚合物链可以包含核苷酸。在一些情况下，当第二聚合物链不与第二区段相邻对齐时，第二聚合物链与第一聚合物链碱基配对。在一些情况下，第一聚合物链固定至核苷酸3135(例如，核苷酸的末端磷酸酯)。当核苷酸被掺入生长中的核酸链中时，第一聚合物链可以从核苷酸释放。第二区段可以包含任何聚合物或其他分子，其足够薄足以当与门(第二聚合物)对齐时穿过纳米孔。例如，第二区段可以包含a-碱性核苷酸(即，不具有任何核酸碱基的核酸链)或碳链。本公开还提供了借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法。参考图32，该方法可以包括将标记的核苷酸3205提供至包含纳米孔的反应室中，其中标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有与核苷酸偶联的标签，其中可借助纳米孔检测所述标签。所述标签包含第一聚合物链(其包含第一区段和第二区段，其中第二区段比第一区段更窄)，和包含两个末端的第二聚合物链，其中第一末端固定至与第二区段相邻的第一聚合物链，且第二末端不固定至第一聚合物链。标签分子能够以第一方向3210穿过纳米孔，其中第二聚合物链与第二区段相邻对齐。所述方法包括借助聚合酶3215实施聚合反应，由此将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自核酸样品的单链核酸分子3225互补的生长中的链3220中。所述方法可以包括在掺入单个标记的核苷酸期间，借助纳米孔3230检测与单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当核苷酸与聚合酶缔合时，借助纳米孔检测到标签。在一些情况下，标签分子不能以第二方向穿过纳米孔，其中第二聚合物链不与第二区段相邻对齐。可以在与聚合酶缔合的同时多次检测到标签。在一些实施方案中，将电极在标签检测时段之间再充电。在一些情况下，标签在单个标签核苷酸的掺入期间穿入纳米孔中，且当电极再充电时标签不穿出纳米孔。用于附接标签的方法可以使用用于附接标签的任何合适的方法。在一个实例中，标签可以通过如下附接至末端磷酸酯：(a)使核苷酸三磷酸酯与二环己基碳二亚胺/二甲基甲酰胺在允许产生环状三偏磷酸酯的条件下接触；(b)使从步骤a)所得的产物与亲核试剂接触，以形成-oh或-nh2官能化的化合物；和(c)使步骤b)的产物与具有与之附接的-cor基团的标签在允许标签间接键合至末端磷酸酯的条件下反应，由此形成核苷酸三磷酸酯类似物。在一些情况下，亲核试剂是h2n-r-oh、h2n-r-nh2、r’s-r-oh、r’s-r-nh2或在一些情况下，所述方法包括，在步骤b)中，使从步骤a)所得的产物与具有以下结构的化合物接触：且随后或同时使产物与nh4oh接触，以形成具有以下结构的化合物：然后可以使步骤b)的产物与具有与之附接的-cor基团的标签在允许标签间接键合至末端磷酸酯的条件下反应，由此形成具有以下结构的核苷酸三磷酸酯类似物：其中r1是oh，其中r2是h或oh，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。标签的释放标签可以以任何方式释放。可以在将具有标签的核苷酸掺入生长中的核酸链期间或之后释放标签。在一些情况下，标签附接至多磷酸酯(例如，图13)，并且核苷酸掺入核酸分子导致释放具有与之附接的标签的多磷酸酯。掺入可以被至少一种聚合酶催化，所述聚合酶可以附接至纳米孔。在一些情况下，至少一种磷酸酶也附接至孔。磷酸酶可以从多磷酸酯切割标签以释放标签。在一些情况下，定位磷酸酶，使得在聚合酶反应中由聚合酶产生的焦磷酸酯在进入孔之前与磷酸酶相互作用。在一些情况下，标签没有附接至多磷酸酯(参见，例如，图14)。在这些情况下，标签通过接头(x)连接，所述接头(x)是可切割的。用于产生可切割的加帽的和/或可切割的连接的核苷酸类似物的方法公开于美国专利号6,664,079中，其整体通过引入并入本文。接头不需要是可切割的。接头可以是任何合适的接头，并且可以以任何合适的方式切割。接头可以是光可切割的。在一个实施方案中，uv光用于光化学切割光化学可切割的接头和部分。在一个实施方案中，光可切割的接头是2-硝基苄基部分。可以用tcep(三(2-羧乙基)膦)处理-ch2n3基团，以便将其从dnpp类似物或rnpp类似物的3’o原子除去，由此产生3’oh基团。标签的检测在一些情况下，聚合酶从包含多个不同碱基(例如，a、c、g、t和/或u)的标记的核苷酸的合并物提取。还可能使聚合酶与各种类型的标记的碱基迭代接触。在该情况下，可能不必每种类型的核苷酸具有独特的碱基，但在一些情况下，不同碱基类型之间的循环增加方法的成本和复杂性，尽管如此，在本发明中涵盖该实施方案。图15显示，在一些实施方案中，将标记的核苷酸掺入核酸分子中(例如，使用聚合酶以延伸与模板配对的引物碱基)可以释放可检测的tag-多磷酸酯。在一些情况下，tag-多磷酸酯当其穿过纳米孔时被检测到。在一些实施方案中，tag-多磷酸酯当其存在于纳米孔中时被检测到。在一些情况下，所述方法基于构成多磷酸酯的磷酸酯的数量来区分核苷酸(例如，甚至当tag相同时)。尽管如此，每种类型的核苷酸通常具有独特的标签。参考图15，可以在使标签穿入和/或穿过纳米孔并测量离子电流之前，用磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)处理tag-多磷酸酯化合物。标签可以在它们从核苷酸释放之后流过纳米孔。在一些情况下，施加电压以将标签拉动通过纳米孔。释放的标签中的至少约85%、至少90%、至少95%、至少99%、至少99.9%或至少99.99%可以易位通过纳米孔。在一些情况下，标签可以在纳米孔中停留它们被检测到的时间段。在一些情况下，施加电压以将标签拉入纳米孔，检测标签，将标签从纳米孔排出，或其任何组合。在核苷酸掺入事件后，标签可以被释放或保持与核苷酸结合。(至少部分地)由于其电荷，可以在纳米孔中检测到标签。在一些情况下，标签化合物是具有第一净电荷并且在化学、物理或生物反应后具有不同的第二净电荷的交替带电荷的化合物。在一些情况下，标签上的电荷的幅度与化合物的其余部分上的电荷的幅度相同。在一个实施方案中，标签具有正电荷，并且标签的除去改变化合物的电荷。在一些情况下，随着标签穿入和/或穿过纳米孔，其可以生成电子变化。在一些情况下，电子变化是电流幅度的变化、纳米孔的电导率的变化或其任何组合。纳米孔可以是生物的或合成的。还考虑孔是蛋白性的，例如其中孔是α溶血素蛋白。合成纳米孔的一个实例是固态孔或石墨烯。在一些情况下，聚合酶和/或磷酸酶附接至纳米孔。融合蛋白或二硫键交联是用于附接至蛋白性纳米孔的方法的实例。在固态纳米孔的情况下，可以经由生物素-链霉抗生物素蛋白键附接至纳米孔附近的表面。在一个实例中，dna聚合酶经由用被氨基官能化的链烷硫醇自组装单层修饰的金表面附接至固体表面，其中氨基被修饰为nhs酯用于附接至dna聚合酶上的氨基。该方法可以在任何合适的温度下进行。在一些实施方案中，温度在4℃和10℃之间。在一些实施方案中，温度是环境温度。该方法可以在任何合适的溶液和/或缓冲液中进行。在一些情况下，缓冲液是300mmkcl，其用20mmhepes缓冲至ph7.0至8.0。在一些实施方案中，缓冲液不包含二价阳离子。在一些情况下，该方法不受二价阳离子的存在的影响。用于对核酸样品进行测序的计算机系统可以借助计算机系统来调节本公开的核酸测序系统和方法。图16显示系统1600，其包括耦合至核酸测序系统1602的计算机系统1601。计算机系统1601可以是一个服务器或多个服务器。可以对计算机系统1601进行编程以调节样品制备和处理，并且通过测序系统1602进行核酸测序。测序系统1602可以是基于纳米孔的测序仪(或检测器)，如本文其他地方所述。可以对计算机系统进行编程以执行本发明的方法。计算机系统1601包括中央处理单元(cpu，在本文中也称为“处理器”)1605，其可以是单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1601还包括存储器1610(例如，随机存取存储器，只读存储器，闪存)，电子存储单元1615(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1620(例如，网络适配器)，以及外围设备1625，诸如高速缓存，其他存储器，数据存储和/或电子显示适配器。存储器1610，存储单元1615，接口1620和外围设备1625通过通信总线(实线)、诸如母板与cpu1605进行通信。存储单元1615可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1601可以借助通信接口1620可操作地耦合至计算机网络(“网络”)。该网络可以是因特网，因特网和/或外联网，或与因特网通信的因特网和/或外联网。该网络可以包括一个或多个计算机服务器，可以使得进行分布式计算。本发明的方法可以通过存储在计算机系统1601的电子存储位置上、诸如例如在存储器1610或电子存储单元1615上的机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)来实现。在使用期间，所述代码可以由处理器1605执行。在一些情况下，代码可以从存储单元1615检索并存储在存储器1610上，用于由处理器1605随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元1615，并且将机器可执行指令存储在存储器1610上。可以对代码进行预编译并配置为与具有适用于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时间期间进行编译。代码可以在编程语言中提供，可以选择所述编程语言，以使得代码能够以预编译或编译时的方式执行。计算机系统1601可以适于存储用户概况信息，诸如例如姓名、物理地址、电子邮件地址、电话号码、即时通信(im)句柄、教育信息、工作信息、社交喜欢和/或不喜欢以及与该用户或其他用户潜在相关的其他信息。此类概况信息可以存储在计算机系统1601的存储单元1615上。本文提供的系统和方法的方面(诸如诸如计算机系统1601)可以在编程中体现。可以将技术的各个方面视为通常以机器可读介质的类型承载或在其中体现的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式的“产品”或“制造品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元、诸如存储器(例如，rom、ram)或硬盘上。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，诸如可以随时提供非暂时性存储用于软件编程的各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等。软件的全部或部分有时可以通过因特网或其他各种电信网络进行通信。例如，此类通信可以使得能够将软件从一个计算机或处理器装载至另一计算机或处理器，例如从管理服务器或主机计算机装载至应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如通过有线和光学陆线网络以及经各种空中链路跨本地设备之间的物理接口使用。承载此类波、诸如有线或无线链路、光学链路等的物理元件也可以被视为承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性的有形“存储”介质，否则术语诸如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令用于执行的任何介质。因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码可以采用多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的电线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号的形式，或者声波或光波的形式，诸如在射频(rf)和红外(ir)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括：软盘(floppydisk)、软盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、任何其他磁介质、cd-rom、dvd或dvd-rom、任何其他光学介质、打孔卡纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、ram、rom、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存储芯片或盒带、传输数据或指令的载波、传输此类载玻的电缆或链接或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多可能参与将一个或多个指令的一个或多个序列传送给处理器用于执行。本公开的系统和方法可以用于对各种类型的生物样品、诸如核酸(例如，dna、rna)和蛋白进行测序。在一些实施方案中，本文所述的方法、装置和系统可用于分选生物样品(例如，蛋白或核酸)。可以将分选的样品和/或分子引导至各个箱以用于进一步分析。测序准确度本文提供的方法可以准确地区分单个核苷酸掺入事件(例如，单分子事件)。该方法可以在一次穿过中准确地区分各个核苷酸掺入事件—即，不必对给定核酸分子重新测序。在一些情况下，本文提供的方法可用于对核酸分子进行测序和重新测序，或一次或多次传感与标记的分子缔合的标签。例如，可以借助纳米孔至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或10,000次传感标签。可以借助例如施加至具有纳米孔的膜的电压来传感和重新传感标签，所述电压可以将标签拉入纳米孔或从纳米孔排出。用于核酸测序的方法包括以大于约4σ的准确度区分单个核苷酸掺入事件。在一些情况下，借助纳米孔检测核苷酸掺入事件。与核苷酸缔合的标签可以在掺入后释放，并且标签穿过纳米孔。在一些情况下，标签不被释放(例如，被呈递至纳米孔)。在还有更多实施方案中，标签被释放，但驻留于纳米孔中(例如，不穿过纳米孔)。不同的标签可以与每种类型的核苷酸(例如，a、c、t、g)缔合和/或从其释放，并被纳米孔检测到。错误包括，但不限于：(a)未检测到标签，(b)错误鉴别标签，(c)在没有标签的情况下检测到标签，(d)以不正确的顺序检测到标签(例如，两个标签以第一顺序被释放，但以第二顺序被检测到)，(e)未从核苷酸释放的标签被检测为被释放，(f)未附接至掺入的核苷酸的标签被检测为掺入生长中的核苷酸链，或其任何组合。在一些实施方案中，区分单个核苷酸掺入事件的准确度是100%减去错误发生率(即错误率)。区分单个核苷酸掺入事件的准确度是任何合适的百分比。区分单个核苷酸掺入事件的准确度可以是约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、约99.5%、约99.9%、约99.99%、约99.999%、约99.9999%等。在一些情况下，区分单个核苷酸掺入事件的准确度是至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%、至少99.99%、至少99.999%、至少99.9999%等。在一些情况下，区分单个核苷酸掺入事件的准确度以sigma(σ)单位报告。sigma是统计变量，有时在商业管理和制造策略中用于报告错误率，诸如无缺陷产品的百分比。此处，可以根据如下关系准确地互换使用sigma值：4σ是99.38%准确度，5σ是99.977%准确度，且6σ是99.99966%准确度。根据本文所述的方法，区分单个核苷酸掺入事件可以用于准确地测定核酸序列。在一些情况下，核酸(例如，dna和rna)的核酸序列的测定包括错误。错误的实例包括，但不限于缺失(无法检测到核酸)、插入(在无一真实存在的情况下检测到核酸)和取代(检测到不正确的核酸)。核酸测序的准确度可以通过如下确定：将测量的核酸序列与真实的核酸序列对齐(例如，根据生物信息学技术)，并测定作为缺失、插入和/或取代的核酸位置的百分比。错误是缺失、插入和取代的任何组合。精确度范围为0%至100%，其中100%是完全正确测定核酸的序列。类似地，错误率是100%-准确度，并且范围为0%至100%，其中0%错误率是完全正确测定核酸的序列。如根据所述方法和/或使用本文所述的装置进行的核酸测序的准确度高。准确度是任何合适高的值。在一些情况下，准确度是约95%、约95.5%、约96%、约96.5%、约97%、约97.5%、约98%、约98.5%、约99%、约99.5%、约99.9%、约99.99%、约99.999%、约99.9999%等。在一些情况下，准确度是至少95%、至少95.5%、至少96%、至少96.5%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%、至少99.99%、至少99.999%、至少99.9999%等。在一些情况下，准确度是在约95%和99.9999%之间，在约97%和99.9999%之间，在约99%和99.9999%之间，在约99.5%和99.9999%之间，在约99.9%和99.9999%之间等。高准确度可以通过进行多次穿过(即，对核酸分子测序多次，例如，使核酸通过或接近于纳米孔穿过和对核酸分子的核酸碱基进行测序)来实现。可以将来自多次穿过的数据组合(例如，使用来自其他重复穿过的数据校正首次穿过中的缺失、插入和/或取代)。在一些情况下，可以通过使标签多次通过或接近于纳米孔穿过，诸如例如通过反转施加至纳米孔或膜的电压(例如，dc或ac电压)来增加标签的检测的准确度。该方法对于较少穿过(也称为读取，测序覆盖范围的多重性)提供高准确度。穿过次数是任何数目，且不必是整数。在一些实施方案中，将核酸分子测序1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、12次、14次、16次、18次、20次、25次、30次、35次、40次、45次、50次等。在一些实施方案中，将核酸分子测序至多1次、至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多12次、至多14次、至多16次、至多18次、至多20次、至多25次、至多30次、至多35次、至多40次、至多45次、至多50次等。在一些实施方案中，将核酸分子测序约1次和10次之间，约1次至5次之间，约1次至3次之间，等。准确度的水平可以通过组合从至多20次穿过收集的数据来实现。在一些实施方案中，准确度的水平通过组合从至多10次穿过收集的数据来实现。在一些实施方案中，准确度的水平通过组合从至多5次穿过收集的数据来实现。在一些情况下，准确度的水平在单次穿过中实现。错误率是任何合适低的比率。在一些情况下，错误率为约10%、约5%、约4%、约3%、约2%、约1%、约0.5%、约0.1%、约0.01%、约0.001%、约0.0001%等。在一些情况下，错误率为至多10%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、至多0.5%、至多0.1%、至多0.01%、至多0.001%、至多0.0001%等。在一些情况下，错误率为10%和0.0001%之间、3%和0.0001%之间、1%和0.0001%之间、0.01%和0.0001%之间等。重复序列的除去基因组dna可以含有重复序列，在一些情况下，当进行核酸测序反应时，所述重复序列不感兴趣。本文提供了用于除去这些重复序列的方法(例如，通过和与重复序列互补的序列、例如cot-1dna杂交)。在一个方面，用于借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括从核酸样品除去重复核酸序列以提供单链核酸分子用于测序。该方法可以进一步包括将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中，其中标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有借助纳米孔可检测到的与核苷酸偶联的标签。在一些情况下，该方法包括借助聚合酶实施聚合反应，由此将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与单链核酸分子互补的生长中的链中。所述方法可以包括在掺入单个标记的核苷酸期间，借助纳米孔检测与单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当核苷酸与聚合酶缔合时，借助纳米孔检测到标签。在一些情况下，重复序列并未从反应物理除去，但使得无法测序并留在反应混合物中(例如，通过与cot-1dna杂交，其使得重复序列为双链并从测序反应有效地“除去”)。在一些情况下，重复序列被制成双链。重复序列可以具有任何合适的长度。在一些情况下，重复核酸序列包含约20、约40、约60、约80、约100、约200、约400、约600、约800、约1000、约5000、约10000或约50000个核酸碱基。在一些情况下，重复核酸序列包含至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约200、至少约400、至少约600、至少约800、至少约1000、至少约5000、至少约10000或至少约50000个核酸碱基。在一些情况下，碱基是连续的。重复核酸序列可以具有任何数量的重复亚基。在一些情况下，重复亚基是连续的。在一些实施方案中，重复核酸序列包含约20、约40、约60、约80、约100、约200、约400、约600、约800或约1000个核酸碱基的重复亚基。在一些情况下，重复核酸序列包含至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约200、至少约400、至少约600、至少约800或至少约1000个核酸碱基的重复亚基。在一些情况下，通过和与重复核酸序列互补的核酸序列杂交来除去重复核酸序列。可以将与重复核酸序列互补的核酸序列固定在固体支持物、诸如表面或珠粒上。在一些情况下，与重复核酸序列互补的核酸序列包含cot-1dna(这是具有约50至约100个核酸碱基的长度的重复核酸序列的实例)。纳米孔组装和插入本文所述的方法可以使用具有附接至纳米孔的聚合酶的纳米孔。在一些情况下，期望每个纳米孔具有一个且只有一个聚合酶(例如，使得每个纳米孔仅测序一个核酸分子)。然而，许多纳米孔，包括α-溶血素(αhl)，可以是具有多个亚基(例如，对于αhl，7个亚基)的多聚体蛋白。亚基可以是相同拷贝的相同多肽。本文提供了具有限定比率的修饰的亚基与未修饰的亚基的多聚体蛋白(例如，纳米孔)。本文还提供了用于产生具有限定比率的修饰的亚基与未修饰的亚基的多聚体蛋白(例如，纳米孔)的方法。参考图27，用于组装具有多个亚基的蛋白的方法包括提供多个第一亚基2705和提供多个第二亚基2710，其中当与第一亚基相比时，第二亚基被修饰。在一些情况下，第一亚基是野生型(例如，从天然来源纯化或重组产生)。第二亚基可以以任何合适的方式修饰。在一些情况下，第二亚基具有附接的蛋白(例如，聚合酶)(例如，作为融合蛋白)。修饰的亚基可以包含化学反应性部分(例如，适合于形成键的叠氮化物或炔基)。在一些情况下，该方法进一步包括进行反应(例如，点击化学环加成)以将实体(例如，聚合酶)附接至化学反应性部分。该方法可以进一步包括使第一亚基与第二亚基2715以第一比率接触，以形成具有第一亚基和第二亚基的多个蛋白2720。例如，可以将一部分具有适合于附接聚合酶的反应性基团的修饰的αhl亚基与六部分野生型αhl亚基混合(即，第一比率为1:6)。多个蛋白可以具有多种第一亚基与第二亚基的比率。例如，混合的亚基可以形成几个纳米孔，其具有修饰亚基与未修饰亚基的化学计量分布(例如，1:6、2:5、3:4)。在一些情况下，通过简单地混合亚基而形成蛋白。例如，在αhl纳米孔的情况下，去污剂(例如，脱氧胆酸)可以触发αhl单体采用孔构象。纳米孔也可以使用脂质(例如，1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dphpc)或1,2-二-o-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dophpc)和适中的温度(例如，小于约100℃)形成。在一些情况下，将dphpc与缓冲溶液混合产生大的多层囊泡(lmv)，且向该溶液中添加αhl亚基，并在40℃下孵育30分钟，导致孔形成。如果使用两种不同类型的亚基(例如，天然野生型蛋白和可以含有单点突变的第二αhl单体)，则所得蛋白可以具有(例如，野生型和突变型蛋白的)混合化学计量。这些蛋白的化学计量可以遵循公式，该公式取决于孔形成反应中使用的两种蛋白的浓度比。该公式如下：100pm=100[n!/m!(n-m)!]·fmutm·fwtn-m，其中pm=具有m数目的突变亚基的孔的概率n=亚基的总数(例如，对于αhl为7)m=“突变型”亚基的数目fmut=混合在一起的突变型亚基的分数或比率fwt=混合在一起的野生型亚基的分数或比率该方法可以进一步包括分级分离多种蛋白以富集具有第二比率的第一亚基与第二亚基的蛋白2725。例如，可以分离具有一个且仅具有一个修饰亚基的纳米孔蛋白(例如，第二比例为1:6)。然而，任何第二比率是合适的。第二比率的分布也可以被分级，诸如富集具有一个或两个修饰亚基的蛋白。形成蛋白的亚基总数并不总是7(例如，可以使用不同的纳米孔或可以形成具有六个亚基的α-溶血素纳米孔)，如图27中所描绘。在一些情况下，富集仅具有一个修饰亚基的蛋白。在此类情况下，第二比率是每(n-1)个第一亚基1个第二亚基，其中n是构成蛋白的亚基的数目。第一比率可以与第二比率相同，然而，这不是需要的。在一些情况下，具有突变单体的蛋白的形成效率可以低于没有突变亚基的那些。如果是这样，则第一比率可以大于第二比率(例如，如果在纳米孔中期望1个突变亚基:6个非突变亚基的第二比率，则形成合适数目的1:6蛋白可能需要以大于1:6的比率混合亚基)。具有不同第二比率的亚基的蛋白可以在分离中行为不同(例如，具有不同的保留时间)。在一些情况下，可以使用色谱法(诸如离子交换色谱法或亲和色谱法)分级分离蛋白。由于除了修饰之外，第一和第二亚基可以是相同的，所以蛋白上的修饰的数目可以充当分离的基础。在一些情况下，第一或第二亚基具有纯化标签(例如，除了修饰之外)以允许或提高分级分离的效率。在一些情况下，使用多组氨酸标签(his-标签)、链霉抗生物素蛋白标签(strep-标签)或其他肽标签。在一些情况下，第一和第二亚基各自包含不同的标签，并且分级分离步骤基于每个标签进行分级分离。在his-标签的情况下，在低ph下在标签上产生电荷(组氨酸残基在侧链的pka下变为带正电荷)。在αhl分子之一上的电荷与另一种相比显著差异的情况下，离子交换色谱法可用于分离具有0、1、2、3、4、5、6或7个“电荷标记的”αhl亚基的寡聚体。原则上，该电荷标签可以是一串任何携带均一电荷的氨基酸。图28和图29显示基于his-标签的纳米孔的分级分离的实例。图28显示280纳米处的紫外线吸光度、260纳米处的紫外线吸光度和电导率的图。峰对应于具有各种比率的修饰亚基和未修饰亚基的纳米孔。图29显示使用his-标签和strep-标签对αhl纳米孔及其突变体的分级分离。在一些情况下，在分级分离2730之后，实体(例如，聚合酶)附接至蛋白。蛋白可以是纳米孔，且实体可以是聚合酶。在一些情况下，所述方法进一步包括将具有第二比率亚基的蛋白插入双层中。在一些情况下，纳米孔可以包含多个亚基。聚合酶可以附接至亚基之一，并且至少一个且少于所有的亚基包含第一纯化标签。在一些实例中，纳米孔是α-溶血素或其变体。在一些情况下，所述亚基全部都包含第一纯化标签或第二纯化标签。第一纯化标签可以是多组氨酸标签(例如，在具有附接的聚合酶的亚基上)。接头本文描述的方法可以使用附接至纳米孔的酶(例如，聚合酶)用于纳米孔检测，包括核酸测序。在一些情况下，酶和纳米孔之间的联系可以影响系统的性能。例如，工程改造dna聚合酶与孔(α-溶血素)的附接可以增加有效的标记核苷酸浓度，由此降低熵屏障。在一些情况下，聚合酶直接附接至纳米孔。在其他情况下，在聚合酶和纳米孔之间使用接头。本文所述的标签测序可以受益于通过电势诱导的特定标签核苷酸有效捕获至αhl孔。捕获可以在基于dna模板的聚合酶引物延伸期间或之后发生。一种提高捕获效率的方法是优化聚合酶和αhl孔之间的连接。无限制地，待优化的连接的三个特征是：(a)连接的长度(其可以增加有效的标记核苷酸浓度，影响捕获的动力学和/或改变熵屏障)；(b)连接灵活性(其可以影响连接子构象变化的动力学)；和(c)聚合酶和纳米孔之间的连接的数目和位置(其可以减少可用构象状态的数目，由此增加适当的孔-聚合酶取向的可能性，增加有效的标记核苷酸浓度并降低熵屏障)。酶和聚合酶可以任何合适的方式连接。在一些情况下，开放阅读框(orf)直接或用氨基酸的接头融合。融合可以以任何顺序进行。在一些情况下，形成化学键(例如，通过点击化学法)。在一些情况下，连接是非共价的(例如，分子钉，通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用，或通过蛋白-蛋白标签、诸如pdz、gbd、spytag、halo标签或sh3配体)。在一些情况下，接头是聚合物，诸如肽、核酸、聚乙二醇(peg)。接头可以是任何合适的长度。例如，接头长度可以为约5纳米(nm)、约10nm、约15nm、约20nm、约40nm、约50nm或约100nm。在一些情况下，接头长度为至少约5纳米(nm)、至少约10nm、至少约15nm、至少约20nm、至少约40nm、至少约50nm或至少约100nm。在一些情况下，接头长度为至多约5纳米(nm)、至多约10nm、至多约15nm、至多约20nm、至多约40nm、至多约50nm或至多约100nm。接头可以是刚性的、柔性的或其任何组合。在一些情况下，不使用接头(例如，聚合酶直接附接至纳米孔)。在一些情况下，多于一个接头将酶与纳米孔连接。可以改变聚合酶和纳米孔之间的连接的数目和位置。实例包括：αhlc-末端至聚合酶n-末端；αhln-末端至聚合酶c-末端；和不在末端的氨基酸之间的连接。在一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法包括将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中，其中标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有借助纳米孔可检测到的与核苷酸偶联的标签。该方法可以包括借助通过接头与纳米孔附接的聚合酶实施聚合反应，由此将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中。所述方法可以包括在掺入单个标记的核苷酸期间，借助纳米孔检测与单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当核苷酸与聚合酶缔合时，借助纳米孔检测到标签。在一些情况下，接头使聚合酶相对于纳米孔定向，使得借助纳米孔检测标签。在一些情况下，聚合酶通过两个或更多个接头附接至纳米孔。在一些情况下，接头包含seqidno2-35中的一个或多个，或由其产生的pcr产物。在一些情况下，接头包含由seqidno2-35中的一个或多个编码的肽，或由其产生的pcr产物。施加的电压的校准来自单分子纳米孔传感器装置的分子特异性输出信号可以源自跨被电解质溶液包围的离子不可渗透膜的电化学电势差的存在。该跨膜电势差可以确定纳米孔特异性电化学电流的强度，其可以通过装置内的电子器件经由在电极表面发生的牺牲(即法拉第)或非牺牲(即电容性)反应来检测。对于纳米孔的任何给定状态(即，开放通道、捕获状态等)，时间依赖性的跨膜电势可以充当输入信号，其可以确定随着时间变化的流过纳米孔复合物的所得电流。该纳米孔电流可以提供通过纳米孔传感器装置输出的特异性分子信号。可以通过纳米孔和捕获的分子之间的相互作用在不同程度上调节开放通道纳米孔电流，所述相互作用部分地阻断离子通过通道的流动。这些调节可以表现出对已捕获的分子类型的特异性，允许从其纳米孔电流调节直接鉴别一些分子。对于给定的分子类型和固定组的装置条件，捕获的这种类型的分子对开发通道纳米孔电流的调节程度可能不同，这取决于施加的跨膜电势，将每种类型的分子映射至特定电流-vs.-电压(iv)曲线。施加的电压设置和跨膜电势之间的系统可变偏移量可以引入该iv曲线沿水平电压轴的水平移位，潜在地降低基于由纳米孔传感器装置报告为输出信号的测量的电流信号进行分子鉴别的准确度。因此，对于在相同条件下准确比较同一分子的测量值，施加和跨膜电势之间的不受控制的偏移可能是有问题的。外部施加的电势与实际跨膜电势之间的这种所谓“电势偏移”可以在实验内和实验之间变化。初始条件的变化和纳米孔传感器装置内的电化学条件的时间依赖性变异(漂移)两者可以引起电位偏移的变化。如此处所述，可以通过校准每次实验的施加的电压和跨膜电势之间的时间依赖性偏移来除去这些测量误差。在物理上，观察被纳米孔捕获的分子的逃逸事件的概率可能取决于施加的跨膜电势，并且该概率分布对于在相同条件下相同的分子样品可以是相同的(例如，样品可以是不同类型的分子的混合物，条件是它们的比例在样品之间不变化)。在一些情况下，对于固定样品类型发生逃逸事件的电压分布提供了施加电势和跨膜电势之间的偏移的量度。可以使用该信息以校准跨纳米孔的施加电压，消除由实验内部和实验之间的潜在偏移引起的系统误差源，并且提高分子鉴别和其他测量值的准确度。对于用相同分子样品和试剂操作的给定纳米孔传感器设备，可以从单分子逃逸事件的统计样本中估算逃逸电压的分布的期望值(尽管每个个别事件可能是经历随机波动的随机过程)。该估算值可以是时间依赖性的，为实验内的潜在偏移的时间漂移的原因。这可以校正施加的电压设置和在孔处感受到的实际电压之间的可变差异，当在i-v空间中绘制时有效地“排列”所有测量值。在一些情况下，电势(即电压)偏移校准不是电流增益和电流偏移变化的原因，其也可以针对纳米孔电流测量值的提高的准确度和可重复性进行校准。然而，通常在增益和偏移校正之前进行电势偏移校准，以防止估算电流增益和电流偏移变化中的误差，因为这些进而可以涉及拟合电流vs.电压(iv)曲线，并且这些拟合的结果受电压偏移的变化的影响。即，在i-v空间中左右(水平)偏移数据可以在随后的电流增益和电流偏移拟合中引入误差。图30显示通过纳米孔的电流(实线)和施加的电压(虚线)相比于时间的图。当分子被捕获在纳米孔3005中时，电流可以减小。当施加的电压随着时间3010减小时，电流减小，直至分子从纳米孔3015中掉出，此时电流在施加的电压下增加至预期水平。分子脱落时施加的电压可以取决于分子的长度。例如，具有30个碱基的标签可以在约40mv掉出，而具有50个碱基的标签可以在约10mv掉出。随着时间推移，不同纳米孔或同一纳米孔上不同测量值的掉出电压可以存在变化3020。将该掉出电压调整至期望值可以使数据更易于解释和/或更准确。在一个方面，本文提供了借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品进行测序的方法。该方法可以包括将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中，其中标记的核苷酸的单个标记的核苷酸含有借助纳米孔可检测到的与核苷酸偶联的标签。所述方法可以包括借助聚合酶实施聚合反应，由此将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中。所述方法然后可以包括在掺入单个标记的核苷酸期间，借助纳米孔检测与单个标记的核苷酸缔合的标签，其中，当核苷酸与聚合酶缔合时，借助纳米孔检测到标签。在一些情况下，所述检测包括施加跨纳米孔施加的电压并在施加的电压下用传感电极测量电流。在一些情况下，校准施加的电压。该校准可以包括估算传感电极的预期逃逸电压相对于时间的分布。该校准然后可以计算期望逃逸电压分布和参考点(例如，任意参考点，诸如零)之间的差值。该校准然后可以将施加的电压偏移计算的差值。在一些情况下，施加的电压随着时间减小。在一些情况下，估算预期逃逸电压相对于时间的分布。在一些情况下，参考点是零伏。所述方法可以除去检测到的预期逃逸电压分布中的变化。在一些情况下，所述方法在各自与传感电极相邻的多个独立可寻址的纳米孔上进行。在一些实施方案中，标签在纳米孔中的存在降低在施加的电压下用传感电极测量的电流。在一些情况下，、标记的核苷酸包含多个不同的标签，并且所述方法检测多个不同的标签中的每个。在一些情况下，当与没有校准的情况下进行该方法相比时，该校准增加该方法的准确度。在一些情况下，该校准补偿电化学条件随着时间的变化。在一些情况下，该校准补偿在具有多个纳米孔的装置中具有不同电化学条件的不同纳米孔。在一些实施方案中，该校准为该方法的每种性能补偿不同的电化学条件。在一些情况下，该方法进一步包括校准电流增益的变化和/或电流偏移的变化。expandamer测序方法本公开提供了用于使用expandamer测序对核酸分子进行测序的方法。expandamer测序涉及许多步骤，其产生比待测序的核酸更长的扩展的聚合物，并且具有衍生自待测序的核酸分子的序列。可以使扩展的聚合物穿过纳米孔以测定其序列。如本文所述，扩展的聚合物可以在其上具有铰链门，使得扩展的聚合物可以仅在一个方向穿过纳米孔。该方法的步骤在图33至36中举例说明。关于通过扩增进行核酸测序(即，expandamer)的进一步信息可见于美国专利8,324,360，其通过引用以其整体并入本文。参考图33，在一个方面，用于核酸测序的方法包括提供待测序的单链核酸和提供多个探针。所述探针包含能够与单链核酸杂交的杂交部分3305，具有两个末端(其中每个末端都附接至杂交部分)的环结构3310，以及位于环结构的末端之间的杂交部分中的可切割基团3315。环结构包含铰链门3320，其防止环结构以相反方向穿过纳米孔。参考图34，该方法可以包括以通过杂交部分与待测序的单链核酸3410的杂交确定的顺序聚合3405多种探针。参考图35，该方法可以包括切割3505可切割基团以提供待测序的扩展线。参考图36，该方法可以包括使扩展线3610穿过3605纳米孔3615，其中铰链门防止扩展线以相反方向3620穿过纳米孔。该方法可以包括借助纳米孔以通过杂交部分与待测序的单链核酸杂交确定的顺序检测扩展线的环结构，由此对待测序的单链核酸进行测序。在一些情况下，环结构包含窄区段，且铰链门是包含两个末端的聚合物，其中第一末端固定至与窄区段相邻的环结构，且第二末端不固定至环结构。环结构可以能够以第一方向穿过纳米孔，其中铰链门与窄区段相邻对齐。在一些实施方案中，环结构不能以相反方向穿过纳米孔，其中铰链门不与窄区段相邻对齐。在一些情况下，铰链门包含核苷酸。当铰链门不与窄区段相邻对齐时，铰链门可以与环结构碱基配对。窄区段可以包含任何聚合物或分子，其足够窄，使得当铰链门与窄区段对齐时聚合物可以穿过纳米孔。在一些情况下，窄区段包含a-碱性核苷酸(即，没有与之附接的核苷酸碱基的核酸侧链)或碳链。在一些情况下，将电极在检测时段之间再充电。当电极再充电时，扩展线通常不以相反方向穿过纳米孔。铰链门结构本公开提供了特定的不对称的修饰的核苷酸聚合物结构，其包含至少2个不同的将铰链结构括起来的报告单元，其中修饰的核苷酸聚合物单向移动通过纳米孔，甚至当反转电压极性时。修饰的核苷酸聚合物单向移动通过纳米孔的能力不仅受到铰链结构驱动，而且还受到两个将铰链结构括起来的报告单元的独特结构驱动。设计这两个不同的报告单元结构，以表现出独特的离子流电流和停留时间特性，甚至在存在ac电流而没有方向反转的情况下，其也促进修饰的核苷酸聚合物在单个方向的运动。因此，在一个实施方案中，提供了铰链门化合物，其包含结构式(i)的修饰的核苷酸聚合物：其中，r1是第一报告单元，其包含1-12个单体单元的寡聚体，其中；b是庞大的结构，其包含1-聚体至8-聚体长度的主链寡核苷酸，接头单体单元以及与主链寡核苷酸单元互补的3-聚体至8-聚体长度的分支寡核苷酸，其中分支寡核苷酸共价附接至接头单体单元，并且能够与主链寡核苷酸杂交；r2是第二报告单元，其包含1-12个单体单元的寡聚体；且n是包含1-6个碳的间隔基的间隔基单元或核酸。在一些实施方案中，第二报告单元r2当被拉入纳米孔、随后为b时的停留时间比第一报告单元r1当r1被拉入纳米孔、随后为b时的停留时间长100倍。在一些实施方案中，第一报告单元r1当被拉入纳米孔、随后为b时的停留时间比第二报告单元r2当r2被拉入纳米孔、随后为b时的停留时间长100倍。在一些实施方案中，r1由寡聚体组成，其中单体单元选自：dt-羧基、spc2、spc3和dsp；且第二报告单元r2由寡聚体组成，其中单体单元选自：dtmp、spc12、spc6、sp18和吡咯烷。在一些实施方案中，第二报告单元r2由寡聚体组成，其中单体单元选自：dt-羧基、spc2、spc3和dsp；且第一报告单元r1由寡聚体组成，其中单体单元选自：dtmp、spc12、spc6、sp18和吡咯烷。可以在报告单元中使用的单体单元的进一步实例在下面进一步详细描述(参见表1)。铰链门化合物可以进一步包含含有式(ia)或式(1b)的结构的修饰的核苷酸聚合物其中第一报告单元r1是修饰的核苷酸单体单元α的9-聚体寡核苷酸；第二报告单元r2是修饰的核苷酸单体单元β的9-聚体寡核苷酸；且r2当被拉入纳米孔、随后为b的停留时间比r1当被拉入纳米孔、随后为b的停留时间长至少100倍。式(ia)的结构可以包含7-聚体“分支”寡核苷酸，例如，3’-cggcggc，经由其5’-末端共价附接至修饰的单体单元y，其为较长寡核苷酸的一部分，例如，35-45-聚体寡核苷酸。在另一个实施方案中，式(ib)的结构可以包含7-聚体“分支”寡核苷酸，例如，5’-cggcggc，经由其3’-末端共价附接至修饰的单体单元y，其为较长寡核苷酸的一部分，例如，35-45-聚体寡核苷酸。可以使用典型的接头化学法(例如，氨基-接头，点击-化学接头或树状聚合物接头)进行共价附接。可以设计分支寡核苷酸以与较长寡核苷酸上的互补序列杂交，由此形成双链区。当被捕获在纳米孔中时，该短的双链区域充当庞大的结构，且由此定位在相邻的9-聚体报告单元用于最佳的纳米孔检测。设计两个独特的9-聚体报告单元(α9和β9)，以便当聚合物穿过纳米孔(例如，α-溶血素)时提供截然不同的离子电流水平和停留时间。如本文其他地方所述，通过协调与分支相邻的这两个报告单元的离子流水平和停留时间特性，可以控制作为整体的修饰核苷酸聚合物的穿线运动，以维持单向性。例如，可以设计具有9个羧基-dt核苷酸的α9报告单元。这些单体单元具有非常短的停留时间和非常短的离子流电流水平。可以设计具有9个核苷甲基膦酸酯单元(tmp)的庞大结构的另一侧上的协调的β9报告单元。tmp单元提供非常低的离子流电流水平，其中停留时间(比羧基-dt停留时间)长100倍。因为庞大结构的一侧的报告分子的停留时间比另一侧的报告分子的停留时间长100倍，所以通过纳米孔的反向穿线运动仅以正向穿线速率的1%发生。因此，作为整体的修饰的核苷酸聚合物基本上仅以单个方向移动通过纳米孔。使用带正电荷的报告单元，可以实现正向和反向穿线之间的甚至更大差异。当尝试检测一系列报告单元时(如在条形码应用中)，控制报告单元在单个方向的移动方向的能力是特别有用的，且当使用ac模式纳米孔检测时它也是重要的，其中极性的快速反转可以大大增加电极寿命，且由此允许更长的读取与更少的错误。然而，极性的快速反转可以引起所检测的修饰核苷酸聚合物的穿线反转，且由此增加检测错误。包含(α)9和(β)9报告单元的示例性不对称修饰核苷酸聚合物的单向运动的示意图显示于图48中。报告单元(r)本公开的包含修饰的核苷酸聚合物的化合物包含一系列包含单体单元的报告单元。报告单元是修饰的核苷酸聚合物的一部分，其包括4至10个核苷酸或4至25个核苷酸类似物(或其他单体单元)。该报告单元位于庞大结构(b)附近，这导致当庞大结构由于其不能穿过孔而停止时，该报告单元位于纳米孔的桶中。纳米孔的桶中的报告单元(r)的存在产生独特的纳米孔-可检测信号(例如，电流水平和/或停留时间)。可用于本公开的修饰的核苷酸聚合物中的报告单元包含4至10个核苷酸或4至25个核苷酸类似物单体单元。通常，单体单元可以是经由亚酰胺(amidite)偶联化学法合成插入核苷酸聚合物中的任何类型的。考虑本公开的报告单元可以包含核苷酸单体单元和/或核苷酸类似物单体单元。核苷酸类似物单体单元通常具有带有电荷和空间体积的结构，所述空间体积相对于天然存在的(或规范的)核苷酸单体单元(例如，da、dc、dg、dt和du)实质上改变。核苷酸类似物单体单元的改变的电荷和大小特征允许报告单元能够在进入、驻留和/或穿过在施加的电压电势下的纳米孔后产生相对于四种规范的核苷酸单体单元更宽范围的纳米孔可检测信号(例如，报告单元电流和/或停留时间)。不意欲受任何特定机制的限制，据信修饰的核苷酸聚合物的报告单元位于聚合物中与庞大结构相邻，使得报告单元驻留于纳米孔的桶中，并且该位置提供了在电压电势下通过纳米孔的离子流的可测量改变的最佳水平。这些改变导致相对于纳米孔o.c.电流的大的测量的报告分子电流和/或停留时间，并且对于鉴别特定的报告单元和因此特定的修饰的核苷酸聚合物条形码单元而言是最佳的。由修饰的核苷酸聚合物中的报告单元的存在产生的纳米孔可检测测量值的改变可以包括减少或增加的离子流，并且导致报告单元电流和/或停留时间。在一些实施方案中，使用包含核苷酸类似物单体单元的报告单元，其相对于包含天然存在的核苷酸的报告单元导致大大增加的停留时间。增加的停留时间对于纳米孔检测系统中的使用特别有利，因为其允许更精确和准确的测量，其进一步提供了修饰的核苷酸聚合物条形码和所测量的任何相关分析物的更好和更准确的鉴别。在一些实施方案中，由报告单元(r)产生的可检测的停留时间为至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少8倍或至少10倍。在一些实施方案中，由报告单元(r)产生的可检测的停留时间为至少300msec、至少500msec、至少750msec、至少1000msec、至少2000msec或至少5000msec。包含核苷酸类似物单体单元的报告单元的重要特征是可用的核苷酸类似物种类很多，并且这些结构容易经由亚酰胺偶联化学法插入修饰的核苷酸聚合物中。例如，表1(下文)列出超过300种示例性的亚酰胺试剂(例如，亚磷酰胺酯或亚膦酰胺酯)，其可用于合成本公开的修饰的核苷酸聚合物中的报告单元(r)。表1中列出的每种亚酰胺试剂都是市售的，然而，存在数百种(如果不是数千种)更多的具有核苷酸类似物结构的亚酰胺试剂，其已经公开，并且本领域技术人员可用于制备本公开的修饰的核苷酸聚合物中的报告单元。表1核苷酸类别亚酰胺试剂目录号商业可得自：glenresearch,22825davisdrive,sterling,va,usada-5'-ce亚磷酰胺10-0001dc-5'-ce亚磷酰胺10-0101dt-5'-ce亚磷酰胺10-03017-脱氮-da-ce亚磷酰胺10-1001n6-me-da-ce亚磷酰胺10-10033'-da-ce亚磷酰胺10-1004亚乙烯基-da-ce亚磷酰胺10-10068-br-da-ce亚磷酰胺10-10078-氧代-da-ce亚磷酰胺10-1008pdc-ce亚磷酰胺10-1014tmp-f-du-ce亚磷酰胺10-1016吡咯并-dc-ce亚磷酰胺10-10175-me-dc分枝剂亚磷酰胺10-1018氨基-改性剂c6dc10-10197-脱氮-dg-ce亚磷酰胺10-10218-br-dg-ce亚磷酰胺10-10278-氧代-dg-ce亚磷酰胺10-1028dmf-dg-ce亚磷酰胺10-10295'-ome-dt-ce亚磷酰胺10-1031o4-me-dt-ce亚磷酰胺10-10324-硫基-dt-ce亚磷酰胺10-1034羧基-dt10-10352-硫基-dt-ce亚磷酰胺10-1036氨基-改性剂c2dt10-1037生物素-dt10-1038氨基-改性剂c6dt10-1039di-ce亚磷酰胺10-10402'-脱氧水粉蕈素-ce亚磷酰胺(嘌呤)10-1041o6-苯基-di-ce亚磷酰胺10-10425-硝基吲哚-ce亚磷酰胺10-10442-氨基嘌呤-ce亚磷酰胺10-1046dp-ce亚磷酰胺10-1047dk-ce亚磷酰胺10-1048du-ce亚磷酰胺10-1050o4-三唑基-du-ce亚磷酰胺10-10514-硫基-du-ce亚磷酰胺10-10525-oh-du-ce亚磷酰胺10-1053pdu-ce亚磷酰胺10-10542'-脱氧假u-ce亚磷酰胺10-1055荧光素-dt亚磷酰胺10-1056tamra-dt10-1057dabcyl-dt10-1058edta-c2-dt-ce亚磷酰胺10-10595-me-dc-ce亚磷酰胺10-10605-me-2'-脱氧zebularine-ce亚磷酰胺10-10615-羟基甲基-dc-ce亚磷酰胺10-10625-oh-dc-ce亚磷酰胺10-10633'-dc-ce亚磷酰胺10-1064dmf-5-me-isodc-ce亚磷酰胺10-10655-羧基-dc-ce亚磷酰胺10-1066n4-et-dc-ce亚磷酰胺10-1068o6-me-dg-ce亚磷酰胺10-10706-硫基-dg-ce亚磷酰胺10-10727-脱氮-8-氮杂-dg-ce亚磷酰胺(ppg)10-10733'-dg-ce亚磷酰胺10-10747-脱氮-dx-ce亚磷酰胺10-1076dmf-isodg-ce亚磷酰胺10-10788-氨基-dg-ce亚磷酰胺10-10795-br-dc-ce亚磷酰胺10-10805-i-dc-ce亚磷酰胺10-10812-f-di-ce亚磷酰胺10-10827-脱氮-8-氮杂-da-ce亚磷酰胺10-10833'-dt-ce亚磷酰胺10-10842-氨基-da-ce亚磷酰胺10-10858-氨基-da-ce亚磷酰胺10-10863-脱氮-da-ce亚磷酰胺10-1088氨基-改性剂c6da10-10895-br-du-ce亚磷酰胺10-10905-i-du-ce亚磷酰胺10-10915-f-du-ce亚磷酰胺10-10925-羟基甲基-du-ce亚磷酰胺10-1093胸苷乙二醇ce亚磷酰胺10-1096ap-dc-ce亚磷酰胺10-10978,5'-环-dace亚磷酰胺10-1098da-me亚磷酰胺10-1100ac-dc-me亚磷酰胺10-1115dg-me亚磷酰胺10-1120dt-me亚磷酰胺10-1130da-pace亚磷酰胺10-1140ac-dc-pace亚磷酰胺10-1150dg-pace亚磷酰胺10-1160dt-pace亚磷酰胺10-1170da-h-膦酸酯,tea盐10-1200dc-h-膦酸酯,dbu盐10-1210dg-h-膦酸酯,tea盐10-1220dt-h-膦酸酯,tea盐10-1230pac-da-me亚磷酰胺10-1301ac-dc-me亚磷酰胺10-1315ipr-pac-dg-me亚磷酰胺10-1321dt-me亚磷酰胺10-1330cleanamp™-pac-da-ce亚磷酰胺10-1440cleanamp™-ac-dc-ce亚磷酰胺10-1450cleanamp™-pac-dg-ce亚磷酰胺10-1460cleanamp™-dt-ce亚磷酰胺10-14701-me-da-ce亚磷酰胺10-1501n6-ac-n6-me-da-ce亚磷酰胺10-15035-羟基甲基-dcii-ce亚磷酰胺10-15105-氮杂-5,6-二氢-dc-ce亚磷酰胺10-1511n4-ac-n4-et-dc-ce亚磷酰胺10-15135-甲酰基-dc-ce亚磷酰胺10-1514tc-ce亚磷酰胺10-1516tc°-ce亚磷酰胺10-1517tc-硝基-ce亚磷酰胺10-15188-d-dg-ce亚磷酰胺10-1520dds-ce亚磷酰胺10-1521pac-ds-ce亚磷酰胺10-1522dpa-ce亚磷酰胺10-1523ddss-ce亚磷酰胺10-1524n2-氨基-改性剂c6dg10-15295,6-二氢-dt-ce亚磷酰胺10-1530n3-氰基乙基-dt10-15315'-dabsyl-dt-ce亚磷酰胺10-1532n-pom关闭的-dt-ce亚磷酰胺10-1534nhs-羧基-dt10-1535fmoc氨基-改性剂c6dt10-1536dx-ce亚磷酰胺10-1537s-bz-硫醇-改性剂c6-dt10-1538dbco-dt-ce亚磷酰胺10-1539c8-炔烃-dt-ce亚磷酰胺10-1540c8-tips-炔烃-dc-ce亚磷酰胺10-1541c8-tms-炔烃-dc-ce亚磷酰胺10-1542c8-炔烃-dc-ce亚磷酰胺10-1543c8-tips-炔烃-dt-ce亚磷酰胺10-1544c8-tms-炔烃-dt-ce亚磷酰胺10-15455,6-二氢-du-ce亚磷酰胺10-15505-乙炔基-du-ce亚磷酰胺10-1554ac-5-me-dc-ce亚磷酰胺10-15605-甲酰基dciiice亚磷酰胺10-1564二茂铁-dt-ce亚磷酰胺10-1576芘-du-ce亚磷酰胺10-1590苝-du-ce亚磷酰胺10-15918,5'-环-dg-ce亚磷酰胺10-1598pac-da-ce亚磷酰胺10-1601ipr-pac-dg-ce亚磷酰胺10-1621da-硫基亚磷酰胺10-1700dc-硫基亚磷酰胺10-1710dg-硫基亚磷酰胺10-1720dt-硫基亚磷酰胺10-1730化学磷酸化试剂10-1900化学磷酸化试剂ii10-1901固体化学磷酸化试剂ii10-19025'-氨基-改性剂510-19055'-氨基-改性剂c610-19065'-dms(o)mt-氨基-改性剂c610-19075'-己炔基亚磷酰胺10-1908间隔物亚磷酰胺910-19095'-氨基-改性剂c1210-1912间隔物亚磷酰胺c310-1913吡咯烷-ce亚磷酰胺10-19155'-氨基-改性剂c6-tfa10-19165'-氨基-改性剂tegce-亚磷酰胺10-1917间隔物亚磷酰胺1810-19185'-氨基氧基-改性剂-11-ce亚磷酰胺10-1919对称双倍体亚磷酰胺10-1920三倍体亚磷酰胺10-19225'-氨基-改性剂c3-tfa10-1923长三倍体亚磷酰胺10-19255'-硫醇-改性剂c610-1926脱碱基ii亚磷酰胺10-1927间隔物c12ce亚磷酰胺10-19285'-i-dt-ce亚磷酰胺10-19315'-氨基-dt-ce亚磷酰胺10-19325'-醛-改性剂c2亚磷酰胺10-19335-甲酰基吲哚-ce亚磷酰胺10-19345'-羧基-改性剂c1010-1935硫醇-改性剂c6s-s10-1936硫醇-改性剂c6s-s10-19365'-马来酰亚胺-改性剂亚磷酰胺10-1938精胺亚磷酰胺10-19395'-dbco-teg亚磷酰胺10-19415'-羧基-改性剂c510-19455'-溴己基亚磷酰胺10-19465'-氨基-改性剂c6-pda10-19475'-氨基-改性剂c12-pda10-19485'-氨基-改性剂tegpda10-1949脱硫生物素teg亚磷酰胺10-1952生物素亚磷酰胺10-1953生物素teg亚磷酰胺10-1955荧光素亚磷酰胺10-19636-荧光素亚磷酰胺10-1964吖啶亚磷酰胺10-1973胆甾醇基-teg亚磷酰胺10-19755'-胆甾醇基-teg亚磷酰胺10-1976α-生育酚-teg亚磷酰胺10-1977硬脂酰亚磷酰胺10-1979补骨脂素c2亚磷酰胺10-1982补骨脂素c6亚磷酰胺10-1983dnp-teg亚磷酰胺10-19855'-三甲氧基茋帽亚磷酰胺10-19865'-芘帽亚磷酰胺10-1987二硫醇丝氨醇亚磷酰胺10-1991炔烃-改性剂丝氨醇亚磷酰胺10-1992经保护的生物素丝氨醇亚磷酰胺10-19936-荧光素丝氨醇亚磷酰胺10-1994经保护的生物素lc丝氨醇亚磷酰胺10-1995氨基-改性剂丝氨醇亚磷酰胺10-1997pac-a-ce亚磷酰胺10-3000bz-a-ce亚磷酰胺10-3003a-tom-ce亚磷酰胺10-3004n6-甲基-a-ce亚磷酰胺10-3005zebularine-ce亚磷酰胺10-3011吡啶-2-酮-ce亚磷酰胺10-3012c-tom-ce亚磷酰胺10-3014ac-c-ce亚磷酰胺10-3015吡咯并-c-tom-ce亚磷酰胺10-3017ipr-pac-g-ce亚磷酰胺10-3021g-tom-ce亚磷酰胺10-3024ac-g-ce亚磷酰胺10-3025u-ce亚磷酰胺10-3030u-tom-ce亚磷酰胺10-3034氨基-改性剂c6-u亚磷酰胺10-3039i-ce亚磷酰胺10-30405-me-u-ce亚磷酰胺10-30504-硫基-u-tom-ce亚磷酰胺10-3052假尿苷-ce亚磷酰胺10-30555-me-c-tom-ce亚磷酰胺10-30642-氨基嘌呤-tbdms-ce亚磷酰胺10-30706-硫基-g-ce亚磷酰胺10-30728-氮杂-7-脱氮-a-ce亚磷酰胺10-30832,6-二氨基嘌呤-tom-ce亚磷酰胺10-3085br-u-ce亚磷酰胺10-30905-i-u-ce亚磷酰胺10-30912'-ome-a-ce亚磷酰胺10-31002'-ome-c-ce亚磷酰胺10-31102'-ome-tmp-5-f-u-ce亚磷酰胺10-31112'-ome-ac-c-ce亚磷酰胺10-31152'-ome-3-脱氮-5-氮杂-c-ce亚磷酰胺10-31162'-ome-ibu-g-ce亚磷酰胺10-31202'-ome-g-ce亚磷酰胺10-31212'-ome-2-氨基嘌呤-ce亚磷酰胺10-31232'-ome-2,6-二氨基嘌呤-ce亚磷酰胺10-31242'-ome-u-ce亚磷酰胺10-31302'-ome-5-me-u-ce亚磷酰胺10-31312'-ome-5-f-u-ce亚磷酰胺10-31322'-ome-i-ce亚磷酰胺10-31402'-ome-5-me-c-ce亚磷酰胺10-31602'-ome-5-br-u-ce亚磷酰胺10-31902'-f-a-ce亚磷酰胺10-34002'-f-ac-c-ce亚磷酰胺10-34152'-f-g-ce亚磷酰胺10-34202'-f-u-ce亚磷酰胺10-34301-me-a-ce亚磷酰胺10-35012'-ome-pac-a-ce亚磷酰胺10-36012'-ome-ipr-pac-g-ce亚磷酰胺10-36212'-f-a-ana-ce亚磷酰胺10-38002'-f-c-ana-ce亚磷酰胺10-38102'-f-ac-c-ana-ce亚磷酰胺10-38152'-f-g-ana-ce亚磷酰胺10-38202'-f-u-ana-ce亚磷酰胺10-3830r间隔物ce亚磷酰胺10-3914pc氨基-改性剂亚磷酰胺10-4906pc间隔物亚磷酰胺10-4913pc接头亚磷酰胺10-4920pc生物素亚磷酰胺10-4950偶氮苯亚磷酰胺10-58002,2'-二甲基吡啶胺亚磷酰胺10-58015'-荧光素亚磷酰胺10-59015'-六氯-荧光素亚磷酰胺10-59025'-四氯-荧光素亚磷酰胺10-5903sima(hex)亚磷酰胺10-59055'-二氯-二甲氧基-荧光素亚磷酰胺ii10-59065'-dabcyl亚磷酰胺10-5912青色素3亚磷酰胺10-5913青色素3.5亚磷酰胺10-5914青色素5亚磷酰胺10-5915青色素5.5亚磷酰胺10-5916dylightdy547亚磷酰胺10-5917dylightdy647亚磷酰胺10-5918epochredmondredtm亚磷酰胺10-5920epochyakimayellowtm亚磷酰胺10-5921epochgigharborgreentm亚磷酰胺10-5922epocheclipsetmquencher亚磷酰胺10-59255'-bhq-1亚磷酰胺10-59315'-bhq-2亚磷酰胺10-59325'-bbq-650®-ce亚磷酰胺10-5934bhq-1-dt10-5941bhq-2-dt10-5942bbq-650®-dt-ce亚磷酰胺10-5944sima(hex)-dt亚磷酰胺10-59455'-生物素亚磷酰胺10-5950亚甲基蓝c3亚磷酰胺10-5960dmf-dg-5'-ce亚磷酰胺10-9201cis-syn胸腺嘧啶二聚体亚磷酰胺11-1330商业可得自：chemgenescorporation,33industrialway,wilmington,ma,usadmt-丁烷-二醇亚磷酰胺clp-9775dmt-十二烷-二醇亚磷酰胺clp-1114dmt-乙烷-二醇亚磷酰胺clp-2250dmt-六乙基氧基-乙二醇亚磷酰胺clp-9765dmt-己烷-二醇亚磷酰胺clp-1120dmt-壬烷-二醇亚磷酰胺clp-9009dmt-丙烷-二醇亚磷酰胺clp-9908dmt-四乙基氧基-乙二醇ced亚磷酰胺clp-1368dmt-三乙基氧基-乙二醇亚磷酰胺clp-1113聚乙二醇2000ced亚磷酰胺clp-2119聚乙二醇4500ced亚磷酰胺clp-3118l-da(n-bz)ce亚磷酰胺anp-8031l-dc(n-乙酰基)ce亚磷酰胺anp-8035l-dc(n-bz)ce亚磷酰胺anp-8032l-dg(n-ibu)ce亚磷酰胺anp-8033l-dtce亚磷酰胺anp-8034上面表1中列出的亚酰胺试剂可用于经由标准的亚酰胺偶联化学法在修饰的核苷酸聚合物中的庞大结构附近插入报告单元。也就是说，每种亚磷酰胺酯(或亚膦酸酯)试剂将在亚酰胺偶联反应中与核苷酸聚合物反应，以将具有其特定核苷酸类似物结构的单体单元插入聚合物中。所得的报告单元将包含4至25个磷酸酯(或膦酸酯)键。因此，表1的超过300种亚酰胺化合物的列表有效地提供了数千种单体单元的可能组合，所述单体单元可以被合成为本发明的修饰的核苷酸聚合物中的报告单元。因此，考虑的是，结构式(i)的修饰的核苷酸聚合物可以至少包括条形码单元，所述条形码单元包括包含表1的核苷酸类似物单体的报告单元(r)(即，由表1的亚酰胺试剂的反应产生)。应当注意的是，表1中公开的一些核苷酸类似物单体单元在商业寡核苷酸合成目录中也被称为“间隔基”(例如，“isp”)、“染料”(例如，“icy3”)或“接头”(例如，“己炔基”)。使用众所周知的寡核苷酸合成命名法来提及本文提供的实施例中描述的一些报告单元(对于常用的寡核苷酸命名法的进一步细节，参见例如integrateddnatechnologies的网站www.idtdna.com)。在一些实施方案中，可用于本发明的修饰的核苷酸聚合物的条形码单元中的报告单元(和相关的使用方法)可以包括本文的任何报告单元，包括但不限于由以下组成的组：dsp、spc3、spc6、spc12、sp18、吡咯烷、精胺、dt-羧基、cy3、dtmp及其组合。修饰的核苷酸聚合物的报告单元(例如，包含来自表1的核苷酸类似物)的设计可以取决于单体单元的数量、期望的纳米孔检测特征和特定的使用方法。如本文更详细公开，包含庞大结构和报告单元的修饰的核苷酸聚合物可用于测序以及使用纳米孔检测系统检测和/或定量溶液中的分析物的方法中。本文考虑使用纳米孔检测的广泛范围的测定方案。因此，本公开为普通技术人员提供了制备具有报告单元的修饰的核苷酸聚合物的工具，其提供了在使用纳米孔检测系统的广泛范围的测定方案中有用的不同的纳米孔可检测信号。非测序方法和应用本文所述的装置和方法可用于测量核酸样品和/或核酸分子的除了其核酸序列以外的某些特性(例如，序列的长度或核酸样品的质量的任何量度，包括但不限于样品中核酸的交联程度。在一些情况下，可能期望不测定核酸分子的序列。例如，可以通过测定基因组中的某些重复序列(例如，称为微卫星、简单序列重复(ssr)或短串联重复(str))的长度来鉴别个体人(或其他生物体，诸如马等)。可能希望知道一个或多个str的长度(例如，以鉴别亲子关系或罪行的犯罪者)，而不知道str的序列和/或str之前(5’)或之后(3’)发现的dna的序列(例如，以便不鉴别该人的种族、患上疾病的可能性等)。在一个方面，一种方法鉴别基因组中存在的一个或多个str。可以鉴别任何数量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多)的str。str可以包含重复区段(例如，序列seq.id.no.1-aggtctaggtctaggtctaggtctaggtctaggtctaggtct的‘aggtct’)，其具有任意数量的核酸碱基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个碱基)。str可以包含任何数量的重复的重复区段，通常是连续重复的(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多次)。核苷酸掺入事件的数目和/或核酸或其区段的长度可以通过使用具有附接至标记的核苷酸中的一些、大多数或全部的相同标签的核苷酸来确定。检测到标签(在释放之前预先装载至纳米孔中，或者从标记的核苷酸释放后引导至纳米孔中)表明已经发生核苷酸掺入事件，但在这种情况下并不鉴别已经掺入哪个核苷酸(例如，未确定序列信息)。在一些实施方案中，所有核苷酸(例如，所有腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和/或尿嘧啶(u)核苷酸)具有与该核苷酸偶联的相同标签。然而，在一些情况下，这可能是不需要的。所述核苷酸中的至少一些可以具有鉴别核苷酸的标签(例如，使得将确定一些序列信息)。在一些情况下，所述核苷酸中的约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约40%或约50%具有鉴别核苷酸的标签(例如，使得对一些核酸位置进行测序)。测序的核酸位置可以沿核酸链随机分布。在一些情况下，所有单一类型的核苷酸都具有鉴别标签(例如，使得例如对所有腺嘌呤进行测序)。在一些情况下，所述核苷酸中的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%具有鉴别核苷酸的标签。在一些实施方案中，所述核苷酸中的至多5%、至多10%、至多15%、至多20%、至多25%、至多30%、至多40%或至多50%具有鉴别核苷酸的标签。在一些实施方案中，所有核酸或其区段都是短串联重复区(str)。在一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔测定核酸或其区段的长度的方法包括将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中。所述核苷酸可以具有不同的碱基，诸如至少两个不同的碱基，其含有与核苷酸偶联的相同标签，所述标签可借助纳米孔检测。所述方法可以进一步包括借助聚合酶实施聚合反应，由此将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中。所述方法可以进一步包括在掺入单个标记的核苷酸期间或之后，借助纳米孔检测与单个标记的核苷酸缔合的标签。在一个方面，借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔测定核酸或其区段的长度的方法包括将标记的核苷酸提供至包含纳米孔的反应室中。标记的核苷酸的单个标记的核苷酸可以含有与核苷酸偶联的标签，所述标签能够相对于当不存在标签时的电流减小流过纳米孔的电流的幅度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括借助聚合酶实施聚合反应，由此将标记的核苷酸的单个标记的核苷酸掺入与来自核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中，和降低流过纳米孔的电流的幅度。电流的幅度可以减小任何合适的量，包括约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约99%。在一些实施方案中，电流的幅度降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。在一些实施方案中，电流的幅度降低至多5%、至多10%、至多15%、至多20%、至多25%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多95%或至多99%。所述方法可以进一步包括借助纳米孔检测单个标记的核苷酸的掺入之间的时间段(例如，图6中的时段605)。单个标记的核苷酸的掺入之间的时间段可以具有高电流幅度。在一些实施方案中，在核苷酸掺入事件之间流过纳米孔的电流的幅度为(例如，返回至)最大电流(例如，当不存在标签时)的约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约99%。在一些实施方案中，在核苷酸掺入事件之间流过纳米孔的电流的幅度为最大电流的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。在一些情况下，在str之前(5’)或之后(3’)对核酸的节段进行测序，以鉴别哪个str在纳米孔中具有其确定的长度(例如，在其中朝向多个str引导多个引物的多重化背景下)。在一些情况下，在str之前(5’)或之后(3’)对约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个核酸进行测序。在其他实施方案中，提供了用于借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔检测和/或定量靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使靶标分子与包含标记的核苷酸的核酸条形码分子在包含所述纳米孔的反应室中接触，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸或二核苷酸含有与核苷酸或二核苷酸偶联的标签，其中所述标签包含含有单向铰链门的可扩展的环结构，且其中所述标签可借助所述纳米孔检测；(b)扩展所述可扩展的环结构；和(c)当标签被拉过纳米孔时，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸或二核苷酸缔合的标签。在一些实施方案中，包含单向铰链门的标签在向纳米孔施加电势或电压期间具有的停留时间比在施加反转的电势或电压期间标签的停留时间短至少100倍。在进一步实施方案中，所述可扩展的环结构包括窄区段，且所述门是包含两个末端的聚合物，其中第一末端固定至与窄区段相邻的环结构，且第二末端不固定至环结构。在进一步实施方案中，所述扩展的环结构可以在第一方向穿过纳米孔，其中所述门与窄区段相邻对齐，且所述扩展的环结构不能以相反方向穿过纳米孔，其中所述门不与窄区段相邻对齐。靶标分子可以是任何已知的靶标分子，包括核酸、修饰的核酸、多肽和小分子。在一些实施方案中，核酸条形码分子可以与亲和部分、诸如核酸或多肽缔合，并且可以包括抗体、抗体片段、dna结合蛋白或rna结合蛋白。在一些实施方案中，所述方法在检测纳米孔中的标签之前进一步包括使亲和部分结合靶标分子。在另一个实施方案中，提供了用于借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔检测和/或定量靶标核酸分子的方法，所述方法包括：(a)将包含标记的核苷酸的核酸序列提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸或二核苷酸含有与核苷酸或二核苷酸偶联的标签，其中所述标签包含含有单向铰链门的可扩展的环结构，且其中所述标签可借助所述纳米孔检测；(b)扩展所述可扩展的环结构；(c)当标签被拉过纳米孔时，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸或二核苷酸缔合的标签。在另一个实施方案中，提供了用于借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔检测和/或定量靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使靶标分子与包含标记的核苷酸的核酸条形码分子接触至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸或二核苷酸含有与核苷酸或二核苷酸偶联的标签，其中所述标签包含含有单向铰链门的可扩展的环结构，且其中所述标签可借助所述纳米孔检测；(b)扩展所述可扩展的环结构；和(c)当标签被拉过纳米孔时，借助所述纳米孔检测与所述单个标记的核苷酸缔合的标签。在另一个实施方案中，提供了借助与传感电极相邻的膜中的纳米孔对核酸样品中的核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：(a)将标记的核苷酸提供至包含所述纳米孔的反应室中，其中所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸或二核苷酸含有与核苷酸或二核苷酸偶联的标签，其中所述标签包含单向铰链门，且其中所述标签可借助所述纳米孔检测；(b)借助酶实施聚合反应，由此将所述标记的核苷酸的单个标记的核苷酸或二核苷酸掺入与来自所述核酸样品的单链核酸分子互补的生长中的链中；(c)当标签被拉过纳米孔时，借助所述纳米孔检测在掺入所述单个标记的核苷酸期间与所述单个标记的核苷酸或二核苷酸缔合的标签。模式匹配本公开还提供了用于使由纳米孔装置检测到的信号的模式与已知(或参考)信号相匹配的电子阅读器。纳米孔装置可以在膜中包括纳米孔，如本文其他地方所述。可以将已知信号维持在存储器位置，诸如远程数据库或位于包括纳米孔装置的芯片上的存储器位置。电子阅读器可以借助模式匹配算法来匹配模式，所述模式匹配算法可以借助电子阅读器的计算机处理器来实现。电子阅读器可以位于芯片上。模式匹配可以实时地实现，诸如在纳米孔装置正在收集数据的同时。作为替代方案，可以通过首先收集数据并随后处理数据以匹配模式来实现模式匹配。在一些情况下，阅读器含有用户感兴趣的一个或多个核酸序列的列表(本文中也是“白名单”)，以及用户不感兴趣的一个或多个其他核酸序列的列表(本文中也是“黑名单”)。在核酸检测(包括核酸掺入事件)期间，阅读器可以检测和记录白名单中的核酸序列，而不检测或记录黑名单中的核酸序列。实施例实施例1-非法拉第传导图37显示非法拉第传导可以将纳米孔与调制解耦。图的垂直轴是-30至30皮安(pa)范围内测量的电流。水平轴是0至2秒(s)范围内测量的时间。波形具有40%占空比。数据点3705是用海绵状铂工作电极在150mmkcl(ph7.5)存在的情况下用双层上方和下方的20mmhepes缓冲液和3mmsrcl2测量的电流。存在240nm粘性聚合酶和5gs夹心(具有0.0464o.d.)。脂质是75%磷脂酰乙醇胺(pe)和25%磷脂酰胆碱(pc)。跨工作电极和对电极(agcl小球)的模拟电压3710显示为乘以100以拟合该图。跨纳米孔-聚合酶复合物3715的模拟电化学电势显示为乘以100以拟合该图。使用具有集成电路重点(spice)模型的模拟程序来模拟电流3720。实施例2-标签捕获图38显示在交流电(ac)系统中被捕获在纳米孔中的两个标签。图的垂直轴是0至25皮安(pa)范围内测量的电流。水平轴是约769至780秒(s)范围内测量的时间。以约10pa捕获第一标签3805。以约5pa捕获第二标签3810。开放通道电流3815为约18pa。由于标签的快速捕获，在开放通道电流几乎看不到数据点。波形在10hz和40%占空比时为0至150mv。该溶液含有150mmkcl。实施例3-标签测序图39显示在待测序的模板dna分子3905、血素纳米孔3910和dna聚合酶3915的融合体以及标记的核苷酸3920之间形成的三元复合物3900的实例。聚合酶3915用蛋白接头3925附接至纳米孔3910。形成纳米孔/聚合酶构建体，使得纳米孔的七个多肽单体中只有一个具有附接的聚合酶。标记的核苷酸的一部分穿入3920纳米孔，并且影响穿过纳米孔的电流。图40显示在待测序的模板dna(但没有标记的核苷酸)存在的情况下流过纳米孔的电流。与纳米孔接触的溶液在100mv施加电压时具有150mmkcl、0.7mmsrcl2、3mmmgcl2和20mmhepes缓冲液ph7.5。电流保持在18皮安(pa)附近，具有少数例外4005。例外可以是电子噪声，并且只能是水平时间轴上的一个数据点。可以使用区分噪声与信号的算法，诸如例如自适应信号处理算法，来减轻电子噪声。图41、图42和图43显示不同的标签提供不同的电流水平。在所有实例中，与纳米孔接触的溶液在100mv施加电压时具有150mmkcl、0.7mmsrcl2、3mmmgcl2和20mmhepes缓冲液ph7.5。图41显示鸟嘌呤(g)4105与胸腺嘧啶(t)4110区分开。标签是具有约8至10pa的电流水平的dt6p-t6-dsp8-t16-c3(对于t)以及具有约4或5pa的电流水平的dg6p-cy3-30t-c6(对于g)。图42显示鸟嘌呤(g)4205与腺嘌呤(a)4210区分开。标签是具有约6至7pa的电流水平的da6p-t4-(sp18)-t22-c3(对于a)以及具有约4或5pa的电流水平的dg6p-cy3-30t-c6(对于g)。图43显示鸟嘌呤(g)4305与胞嘧啶(c)4310区分开。标签是具有约1至3pa的电流水平的dc6p-t4-(sp18)-t22-c3(对于c)以及具有约4或5pa的电流水平的dg6p-cy3-30t-c6(对于g)。图44、图45、图46和图47显示使用标记的核苷酸进行测序的实例。待测序的dna分子是单链的，并具有序列agtcagtc(seq.id.no:36)，并且被两个侧接发夹结构稳定。在所有实例中，与纳米孔接触的溶液在100mv施加电压时具有150mmkcl、0.7mmsrcl2、3mmmgcl2和20mmhepes缓冲液ph7.5。在溶液中包括对应于鸟嘌呤(dg6p-cy3-30t-c6)、腺嘌呤(da6p-t4-(spl8)-t22-c3)、胞嘧啶(dc6p-t4-(sp18)-t22-c3)和胸腺嘧啶(dt6p-t6-dsp8-t16-c3)的四个标签。图44显示一个实例，其中鉴别对应于seq.id.no:36中的序列gtca的四个连续的标记的核苷酸(即，c4405、a4410、g4415和t4420)。标签可以在掺入生长中的链中之前穿入和穿出纳米孔几次(例如，因此，对于每个掺入事件，电流水平可以在开放通道电流和区分标签的降低电流水平之间切换几次)。电流降低的持续时间在两次试验之间由于任何原因而不同，所述原因包括但不限于标签进入和退出纳米孔的次数不同和/或标签被聚合酶短暂保持但未完全掺入生长中的核酸链中。在一些实施方案中，电流降低的持续时间在试验之间近似一致(例如，变化不超过约200%、100%、50%或20%)。在一些情况下，选择酶、施加的电压波形、二价和/或单价离子的浓度、温度和/或ph，使得电流降低的持续时间在两次试验之间近似一致。图45显示所鉴别的seq.id.no:36中相同的序列gtca，如图44中所示(即，在这种情况下，鉴别的标记的核苷酸为c4505、a4510、g4515和t4520)。在一些情况下，电流保持降低延长的时间段(例如，如4520所示的约2秒)。图46显示对应于seq.id.no:36中的序列agtca的所鉴定的五个连续的标记的核苷酸(即，t4605、c4610、a4615、g4620、t4625)。图47显示对应于seq.id.no:36中的序列agtcag的所鉴定的五个连续的标记的核苷酸(即，t4705、c4710、a4715、g4720、t4725、c4730)。实施例3-报告单元离子流电流水平和停留时间特征的设计已经开发了修饰的核苷酸聚合物，其允许将位于双链体区域(例如，双链庞大结构)附近的聚合物内的电流水平和停留时间报告单元两者选择性“调谐”至期望的水平用于纳米孔检测。例如，使用由新型的亚酰胺单元构成的报告单元可得到各种各样的离子电流水平(i/io)，如图49的数据所示。类似地，使用这些相同的亚酰胺单元可以获得各种各样的停留时间，如图50中展示的数据所示。当前第1页12