本发明涉及一种具有乳酸生产能力的嗜氢菌属细菌转化体，并涉及使用所述转化体生产乳酸的方法。
背景技术：
：使用微生物生产化学产品2015年通过的《巴黎协定》规定，应迅速减少全球温室气体排放量。根据该协定，日本设定了到2030年将其温室气体例如二氧化碳和甲烷的排放量与2013年水平相比减少26％的目标。在世界范围内，大多数化学品的生产依赖于石油资源，加剧了温室气体排放量增加的问题。因此，摆脱对石油的依赖是生产化学品的理想策略，并且在各个国家中正认真地进行从生物质生产绿色化学品的生物炼制的研究和开发。然而，用作微生物发酵原材料的生物质的糖化除了成本高之外还需要复杂的过程。作为致力于摆脱石油依赖的研究的一部分，诸如二氧化碳、甲烷和一氧化碳的气体作为更具可持续性的碳源已引起关注，并且使用利用这些气体的微生物生产有价值的化学品和生物燃料的技术已成为引起强烈兴趣的主题。具体来说，非常期待对全球变暖具有显著贡献的二氧化碳的碳固定和二氧化碳的高效利用。鉴于由塑料垃圾造成的海洋污染等问题，最终被自然界中的微生物分解成水和二氧化碳的生物可降解塑料已引起关注。生物可降解塑料根据制造方法被分类为细菌产物系列、天然产物系列和化学合成系列。在所有生物可降解塑料中研究和实际实现进展最快的聚乳酸(乳酸树脂)，由于其原材料是糖酵解系统这一活体内代谢途径的产物乳酸，因此被认为是介于细菌产物系列和化学合成系列之间的一种中间生物可降解塑料。也就是说，聚乳酸通过由微生物发酵产生的乳酸的纯化和化学缩聚来生产。当前的聚乳酸生产使用生物质作为原材料，将所述生物质转变成糖类如上所述需要复杂的步骤，因此当前的聚乳酸生产具有高成本的问题。因此，需要一种能够以更简单的步骤生产乳酸的实用方法，尤其是能够通过二氧化碳固定来生产乳酸的实用方法。乳酸从活体内的重要代谢产物丙酮酸产生。也就是说，乳酸通过乳酸脱氢酶的催化活性产生。作为一种使用重组微生物制造乳酸的技术，专利文献1描述了一种使用通过将瑞士乳杆菌(lactobacillushelvetics)或巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)的乳酸脱氢酶基因引入到酵母菌株中而获得的转化体来生产乳酸的方法。专利文献2描述了一种使用通过将戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)ldh基因作为乳酸脱氢酶基因引入到粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。专利文献3描述了一种使用通过将thermoanaerobacterpseudethanolicusldh基因作为乳酸脱氢酶基因引入到热醋穆尔氏菌(moorellathermoacetica)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。专利文献4描述了一种使用通过将德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)hdhd基因或ldha基因作为乳酸脱氢酶基因引入到geobacillusthermoglucosidans中而获得的转化体来生产乳酸的方法。非专利文献1描述了一种使用通过将干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)的乳酸脱氢酶基因引入到大肠埃希氏杆菌(escherichiacoli)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。然而，所有这些方法都是使用糖作为碳源来生产乳酸的方法，而不是使用二氧化碳作为碳源来生产乳酸的方法。非专利文献2描述了一种使用通过将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的乳酸脱氢酶基因引入到集胞藻属(synechocystissp.)pcc6803菌株中而获得的转化体来生产乳酸的方法。这种方法使用作为光合细菌的蓝细菌作为宿主并使用碳酸氢钠作为碳源来生产乳酸。与植物相比，蓝细菌对二氧化碳具有更高的碳固定能力。然而，使用蓝细菌作为宿主的方法尚未作为生产乳酸的工业化方法投入实用，因为蓝细菌的二氧化碳固定能力不足。专利文献5描述了一种使用通过将嗜热栖热菌(thermusthermophilus)ldha基因作为乳酸脱氢酶基因引入到嗜热氢杆菌(hydrogenobacterthermophilus)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。嗜热氢杆菌是一种在1.5小时内翻倍生长的氢氧化细菌。然而，为了产生足够量的乳酸必需施加电流，因此使用嗜热氢杆菌作为宿主的方法尚未作为生产乳酸的工业化方法投入实用。引文表专利文献[专利文献1]jp2005-528106a[专利文献2]jp2014/030655a1[专利文献3]jp2015-023854a[专利文献4]jp2017-523778a[专利文献5]jp2017-093465a非专利文献[非专利文献1]“代谢工程改造的大肠杆菌rr1中d-或l-乳酸的同型发酵生产”(homofermentativeproductionofd-orl-lactateinmetabolicallyengineeredescherichiacolirr1)，changde,junghc,rheejs,panjg.appl.environ.microbiol.(1999)65:1384-1389[非专利文献2]“工程改造蓝细菌细胞工厂以生产乳酸”(engineeringacyanobacterialcellfactoryforproductionoflacticacid)，angermayrsa,paszotam,hellingwerfkj.appl.environ.microbiol.(2012)78:7098-7106技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供一种能够利用二氧化碳作为唯一碳源来高效生产乳酸的嗜氢菌属细菌的转化体，以及使用该转化体高效生产乳酸的方法。技术解决方案嗜氢菌属细菌是通过利用氢能从二氧化碳产生有机物质来生长的氢氧化细菌。氢氧化细菌的生长速率通常极慢，然而嗜氢菌属细菌的生长速率快，并且它们对二氧化碳的碳固定能力显著高于植物和光合细菌。嗜氢菌属细菌不具有乳酸脱氢酶基因和苹果酸/乳酸脱氢酶基因，已知这些基因编码催化从丙酮酸产生乳酸的反应的酶。为了给所述细菌提供以工业规模生产乳酸的能力，需要引入催化产生乳酸的反应的酶的基因。本发明的发明人发现，当使用在嗜氢菌属细菌中有功能的载体将异源基因引入到所述嗜氢菌属细菌中时，通常不产生或不充足地产生有功能的蛋白质。在嗜氢菌属之外的细菌中产生高活性的基因通常不或不充足地产生活性。面对这种情况，本发明的发明人发现，当将乳酸脱氢酶基因和/或编码具有乳酸脱氢酶活性的苹果酸/乳酸脱氢酶的基因引入到嗜氢菌属细菌中时，所述基因在嗜氢菌属细菌中起作用并产生高活性。本发明的发明人还发现，通过将乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到嗜氢菌属细菌中而获得的转化体利用二氧化碳作为唯一碳源高效生产乳酸。此外，本发明的发明人发现，乳酸脱氢酶基因中的parageobacillusthermoglucosidasius、嗜热地芽孢杆菌(geobacilluskaustophilus)或嗜热栖热菌的ldh基因以及苹果酸/乳酸脱氢酶基因中的嗜热栖热菌(thermusthermophilus)的mldh基因和红色亚栖热菌(meiothermusruber)的mldh-1和mldh-2基因产生更高的酶活性表达，特别是在嗜氢菌属细菌中。本发明在上述发现的基础上完成，并提供了下述用于生产乳酸的转化体和方法。方面1.一种转化体，其通过将(a)乳酸脱氢酶基因和/或(b)苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到嗜氢菌属细菌中而获得。方面2.根据方面1所述的转化体，其中(a)所述乳酸脱氢酶基因是下述dna(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)或(a6)：(a1)由seqidno：1、2或3的碱基序列构成的dna；(a2)由与seqidno：1、2或3具有90％或更高同一性的碱基序列构成的dna，所述dna编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽；(a3)在严紧条件下与由互补于seqidno：1、2或3的碱基序列构成的dna杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的dna；(a4)编码由seqidno：4、5或6的氨基酸序列构成的多肽的dna；(a5)编码由与seqidno：4、5或6具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性；(a6)编码由在seqidno：4、5或6的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性。方面3.根据方面1或2所述的转化体，其中(b)所述苹果酸/乳酸脱氢酶基因是下述dna(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：(b1)由seqidno：7、8或9的碱基序列构成的dna；(b2)由与seqidno：7、8或9具有90％或更高同一性的碱基序列构成的dna，所述dna编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽；(b3)在严紧条件下与由互补于seqidno：7、8或9的碱基序列构成的dna杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的dna；(b4)编码由seqidno：10、11或12的氨基酸序列构成的多肽的dna；(b5)编码由与seqidno：10、11或12具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性；(b6)编码由在seqidno：10、11或12的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性。方面4.根据方面1-3中的任一方面所述的转化体，其中所述嗜氢菌属细菌是热淡黄嗜氢菌(hydrogenophilusthermoluteolus)。方面5.一种生产乳酸的方法，所述方法包括使用二氧化碳作为基本上唯一的碳源来培养根据方面1-4中的任一方面所述的转化体的步骤。有利效果应对大气二氧化碳增加的措施需要减少二氧化碳排放量并固定排放的二氧化碳。为了减少二氧化碳排放量，利用太阳能、风能、地热能和类似能源代替化石能源。然而，此类能量的利用还不够广泛，无法抑制大气二氧化碳的积累。因此，需要增强大气中的碳的固定或排放的二氧化碳的回收利用。二氧化碳的碳固定可以通过物理或化学方式进行，但是利用活细胞进行固定可获得有机物质，由此获得的有机物质可用作食品、饲料和燃料。这样一来，二氧化碳本身就变成一种可直接转化成有价值的化学产品的资源。因此，可以解决由大气二氧化碳增加造成的全球变暖以及食品、饲料和燃料缺乏的双重问题。此外，可以在抑制因二氧化碳排放增加而引起的全球变暖的同时生产有需求的化学产品。化学产品中的生物可降解塑料因其环境益处而备受关注。通过固定二氧化碳而生产的生物可降解塑料被环境中的微生物分解成水和二氧化碳。也就是说，生物可降解塑料是碳中性的，并且能够同时解决因二氧化碳排放增加造成的全球变暖、获得生活所需的塑料产品的困难以及诸如海洋污染之类的环境问题。氢氧化细菌可以利用由氢与氧的反应产生的化学能并使用二氧化碳作为唯一碳源来生长。由于氢氧化细菌可以从作为原材料的氧气、氢气和二氧化碳气体的混合物生产化学产品，因此所述细胞可以高效地从二氧化碳同化碳并在简单培养基中培养。典型的氢氧化细菌的生长通常是缓慢的，但嗜氢菌属细菌的生长速率格外高。thejournalofmitsubishiresearchinstitute第34期1999如下描述嗜氢菌属细菌：“它们的增殖能力如此之高，以至于它们对二氧化碳的碳固定能力不能与植物相比，这真正表明了所述微生物的高二氧化碳固定能力”。当使用在嗜氢菌属细菌中有功能的载体将异源基因引入到所述嗜氢菌属细菌中时，通常不产生有功能的蛋白质。然而，根据本发明，通过将乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到嗜氢菌属细菌中，所述基因在所述嗜氢菌属细菌中有功能，并且可以生产乳酸。如上所述，在具有二氧化碳固定能力的生物体中，嗜氢菌属细菌对二氧化碳具有非典型的显著的碳固定能力，因此，通过使用本发明的转化体，可以将源自于二氧化碳的碳固定，并且可以以工业规模生产乳酸。由于乳酸被用作生产聚乳酸这种典型的生物可降解塑料的原材料，因此本发明为在工业上生产聚乳酸开辟了道路。具体实施方式下面详细描述本发明。(1)具有乳酸生产能力的转化体本发明涵盖通过将乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到嗜氢菌属宿主细菌中而获得的转化体。换句话说，该转化体具有外源乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因。苹果酸/乳酸脱氢酶是一种具有乳酸脱氢酶活性的酶。可以引入乳酸脱氢酶基因或苹果酸/乳酸脱氢酶基因，可选地，可以引入乳酸脱氢酶基因和苹果酸/乳酸脱氢酶基因。此外，可以引入两种或更多种乳酸脱氢酶基因和/或两种或更多种苹果酸/乳酸脱氢酶基因。嗜氢菌属细菌不以可在工业上利用的量产生乳酸。当将异源微生物的乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到嗜氢菌属细菌中时，所述基因在所述嗜氢菌属细菌中起作用，并产生高度有活性的乳酸脱氢酶和/或苹果酸/乳酸脱氢酶，因此，所述获得的转化体利用二氧化碳作为唯一碳源高效生产乳酸。转入基因所述乳酸脱氢酶基因的实例包括parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因和嗜热栖热菌ldh基因，它们因其具有良好的乳酸生产效率而是优选的。parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因的碱基序列是seqidno：1，嗜热地芽孢杆菌ldh基因的碱基序列是seqidno：2，并且嗜热栖热菌ldh基因的碱基序列是seqidno：3。优选地，也可以使用由与seqidno：1、2或3具有90％或更高、特别是95％或更高、更特别是98％或更高、更特别是99％或更高同一性的碱基序列构成的dna，所述dna编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽。在本发明中，碱基序列的同一性使用genetyx第17版(由genetyxcorporation制造)来计算。优选地，也可以使用在严紧条件下与由互补于seqidno：1、2或3的碱基序列构成的dna杂交的dna，所述dna编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽。在本发明中，“严紧条件”意味着使用6xssc溶液在50至60℃的温度下杂交16小时，然后用0.1xssc溶液清洗。此外，优选地也使用编码由seqidno：4、5或6的氨基酸序列构成的多肽的dna。seqidno：4是parageobacillusthermoglucosidasius乳酸脱氢酶的氨基酸序列，seqidno：5是嗜热地芽孢杆菌乳酸脱氢酶的氨基酸序列，seqidno：6是嗜热栖热菌乳酸脱氢酶的氨基酸序列。此外，也可以使用编码由与seqidno：4、5或6具有90％或更高、优选为95％或更高、更优选为98％或更高、甚至更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性。在本发明中，氨基酸序列的同一性使用genetyx第17版(由genetyxcorporation制造)来计算。优选地，也可以使用编码由在seqidno：4、5或6的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性。在本发明中，所述多个的实例包括1个至5个，特别是1个至3个，特别是1个至2个，特别是1个。所述苹果酸/乳酸脱氢酶基因的实例包括嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1和mldh-2基因，它们因其具有良好的乳酸生产效率而是优选的。嗜热栖热菌mldh基因的碱基序列是seqidno：7，红色亚栖热菌(mldh-1基因的碱基序列是seqidno：8，而红色亚栖热菌mldh-2基因的碱基序列是seqidno：9。优选地，也可以使用由与seqidno：7、8或9具有90％或更高、特别是95％或更高、更特别是98％或更高、更特别是99％或更高同一性的碱基序列构成的dna，所述dna编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽，以及在严紧条件下与由互补于seqidno：7、8或9的碱基序列构成的dna杂交的dna，所述dna编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽。此外，优选地也可以使用编码由seqidno：10、11或12的氨基酸序列构成的多肽的dna。seqidno：10是由嗜热栖热菌苹果酸/乳酸脱氢酶(mldh)基因编码的氨基酸序列，seqidno：11是由红色亚栖热菌苹果酸/乳酸脱氢酶(mldh-1)基因编码的氨基酸序列，并且seqidno：12是由红色亚栖热菌苹果酸/乳酸脱氢酶(mldh-2)基因编码的氨基酸序列。此外，优选地也可以使用编码由与seqidno：10、11或12具有90％或更高、特别是95％或更高、更特别是98％或更高、更特别是99％或更高同一性的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性，以及编码由在seqidno：10、11或12的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的多肽的dna，所述多肽具有乳酸脱氢酶活性。在本发明中，为了验证待测试的多肽具有乳酸脱氢酶活性，将所述多肽与丙酮酸在nadh的共存下反应，并检测在340nm处的吸收值。乳酸脱氢酶从丙酮酸产生乳酸。当从丙酮酸产生乳酸时乳酸脱氢酶消耗nadh，因此使用340nm处吸收值的减少作为指标来检测nadh量的减少。具体来说，执行在“实施例”项中描述的方法。如果所述待测试的多肽在340nm处的吸收值即使只是轻微程度降低，所述多肽也被确定为具有乳酸脱氢酶活性。(2)产生转化体的方法接下来，描述通过将上述用于乳酸生产的基因引入到嗜氢菌属细菌中以获得转化体的方法，宿主嗜氢菌属细菌的实例包括热淡黄嗜氢菌、hydrogenophilushalorhabdus、脱氮嗜氢菌(hydrogenophilusdenitrificans)、hydrogenophilushirschii、hydrogenophilusislandicus和嗜氢菌属菌株mar3(hydrogenophilussp.mar3)。具体来说，热淡黄嗜氢菌是优选的，因为它的优越生长速率使其在固定二氧化碳的微生物中能够对二氧化碳实现最高水平的碳固定。嗜氢菌属细菌已从世界各地多种多样的区域容易地分离。热淡黄嗜氢菌的优选菌株是菌株th-1(nbrc14978)。在固定二氧化碳的微生物中，热淡黄嗜氢菌菌株th-1(nbrc14978)表现出相对快的生长速率(agriculturalandbiologicalchemistry,41,685-690(1977))。在国际上，热淡黄嗜氢菌菌株nbrc14978在布达佩斯公约下保藏，因此可以被普通公众获得。转化用于将上述dna引入到宿主中的质粒载体应含有在嗜氢菌属细菌中控制自主复制功能的dna，其实例包括广宿主载体prk415(genbank：ef437940.1)、pbhr1(genbank：y14439.1)、pmmb67eh(atcc37622)、pcar1(ncbi参考序列：nc_004444.1)、pc194(ncbi参考序列：nc_002013.1)、pk18mobsacb(genbank：fj437239.1)、pub110(ncbi参考序列：nc_001384.1)等。优选的启动子的实例包括tac启动子、lac启动子、trc启动子或来自于oxfordgeneticsltd的启动子oxb1和oxb11至oxb20中的每一者。优选的终止子的实例包括大肠杆菌rrna操纵子rrnb的t1t2终止子、噬菌体λ的t0转录终止子等。转录可以通过公知的方法来进行，例如氯化钙法、磷酸钙法、deae-葡聚糖转染法和电脉冲法。嗜氢菌属细菌在自养条件下生长。然而，由于它们也可以在异养条件下生长，因此用于培养宿主或嗜氢菌属细菌重组体的培养基可以是无机培养基或有机培养基。可以使用包含糖、有机酸、氨基酸等的有机培养基。所述培养基的ph可以被调整到大约6.2至8。在任何情况下，培养可以在供应含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物、优选为由氢气、氧气和二氧化碳构成的气体混合物的同时进行。当使用有机培养基时，可以将含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物例如空气用于通气。当不供应二氧化碳时，可以使用含有碳酸盐作为碳源的培养基。可以将混合气体截留在或连续供应到气密培养容器中，并且可以利用振摇培养使所述气体溶解在培养基中。或者，所述培养容器可以是气密或开放类型的，并且可以通过鼓泡使混合气体溶解在所述培养基中。所述供应的气体中氢气、氧气和二氧化碳(氢气：氧气：二氧化碳)的体积比优选为1.75至7.5:1:0.25至3，更优选为5至7.5:1:1至2，更优选为6.25至7.5:1:1.5。嗜氢菌属细菌是嗜热细菌，因此培养温度优选为35至55℃，更优选为37至52℃，甚至更优选为50至52℃。(3)生产乳酸的方法当使用上述嗜氢菌属细菌的转化体生产乳酸时，所述转化体可以使用无机或有机培养基，在供应含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物的同时进行培养。所述供应的气体优选为由氢气、氧气和二氧化碳构成的气体混合物。然而，不同种类的气体可以以能够高效生产乳酸的程度混合在其中。嗜氢菌属细菌可以使用氢气作为能源并使用二氧化碳作为唯一碳源生长，因此，通过基本上只使用二氧化碳(特别是通过只使用二氧化碳)作为碳源生产上述化合物，可以特别高效地固定二氧化碳。因此，使用不含碳源例如有机物质和碳酸盐的无机培养基，即基本上只使用二氧化碳(特别是只使用二氧化碳)作为碳源进行培养，是优选的。“基本上只使用二氧化碳作为碳源”涵盖了不可避免量的其他碳源被混合在其中的情况。此外，也可以使用含有有机物质例如糖、有机酸和氨基酸以及碳酸盐的培养基，而不供应二氧化碳。所述培养基的ph优选为6.2至8，更优选为6.4至7.4，更优选为6.6至7。当ph在这一范围内时，细菌生长良好并且混合气体良好地溶解在所述培养基中，可以高效地生产乳酸。当使用分批培养时，可以将混合气体截留在气密培养容器中，并且可以进行静态培养或振摇培养。当使用连续培养时，可以将混合气体连续供应到气密培养容器中并且可以进行振摇培养，或者可以使用气密培养容器并同时通过鼓泡将混合气体引入到培养基中来培养所述转化体。振摇培养是优选的，因为可以获得混合气体在培养基中更好的溶解。所述供应的气体混合物中氢气、氧气和二氧化碳(氢气：氧气：二氧化碳)的体积比优选为1.75至7.5:1:0.25至3，更优选为5至7.5:1:1至2，甚至更优选为6.25至7.5:1:1.5。当体积比在这一范围内时，细菌生长良好，并且可以高效地生产目标化合物。混合气体或原料气体的供应速率可以是每1l培养基10.5至60l/小时，特别是10.5至40l/小时，特别是10.5至21l/小时。当供应速率在这一范围内时，转化体生长良好，可以高效地生产目标化合物，并且可以减少废混合气体的量。培养温度优选为35至55℃，更优选为37至52℃，甚至更优选为50至52℃。当温度在这一范围内时，转化体生长良好，并且可以高效地生产乳酸。通过以上述方式培养，在反应溶液中产生所述目标化合物乳酸。收集所述反应溶液能够回收乳酸，然而，也可以通过公知的方法从所述反应溶液分离乳酸。此类公知的方法包括沉淀法、分级分馏和电渗析。实施例(1)质粒载体的构建下面描述常用于引入提供乳酸生产能力的基因的质粒载体的构建方法。首先，将广宿主范围载体prk415(genbank：ef437940.1)(gene,70,191-197(1998))用作模板并进行pcr。为了扩增不包括四环素基因区的质粒区的dna片段，合成并使用了下述引物对。pcr按照常规方法，使用由lifetechnologiesinc.制造的“dna热循环仪”并使用kodfxneo(由toyoboco.,ltd.制造)作为反应试剂来进行。用于扩增prk415质粒序列的引物：(a-1)5’-cgtggccaactaggcccagccagatactcccgatc-3’(seqidno：13)(b-1)5’-tgaggcctcattggccggagcgcaacccactcact-3’(seqidno：14)sfii限制性位点已被添加到引物(a-1)和(b-1)中。将含有新霉素/卡那霉素抗性基因(在后文中，所述基因可能被称为“nptii”)的质粒pk18mobsacb(genbank：fj437239.1)(gene,145,69-73(1994))用作模板，并按照常规方法进行pcr。在所述pcr中，为了扩增含有nptii基因序列的dna片段，合成并使用了下述引物对。pcr按照常规方法，使用由lifetechnologiesinc.制造的“dna热循环仪”并使用kodfxneo(由toyoboco.,ltd.制造)作为反应试剂来进行。用于扩增nptii基因序列的引物：(a-2)5’-ctgggcctagttggccacgtagaaagccagtccgc-3’(seqidno：15)(b-2)5’-tccggccaatgaggcctcagaagaactcgtcaaga-3’(seqidno：16)sfii限制性位点已被添加到引物(a-2)和(b-2)中。使用1％琼脂糖凝胶对通过每个上述pcr产生的反应溶液进行电泳，作为结果，当使用prk415质粒作为模板时检测到大约8.7-kb的dna片段，并且当使用nptii基因作为模板时检测到大约1.1-kb的dna片段。将由此制备的dna片段各自用限制性酶sfii切割并与t4dna连接酶(由takarabioinc.制造)反应，获得连接溶液。通过氯化钙法(journalofmolecularbiology,53,159-162(1970))用所述获得的连接溶液转化大肠杆菌jm109，并将转化体施加到含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上。将所述培养基上的活菌株通过常规方法在液体培养基中培养，并从得到的培养液提取质粒dna。将该质粒dna用限制性酶sfii切割并确认插入的片段。作为结果，除了源自于prk415质粒的大约2.0-kb、3.0-kb和3.7-kb的dna片段之外，还观察到大约1.1-kb的nptii基因序列的dna片段。所构建的质粒被命名为pcyk01。(2)用于基因表达的克隆载体的构建(2-1)λt0终止子序列的dna片段的制备为了制备具有λt0终止子序列的dna，合成并在pcr中使用了下述引物对。pcr使用由lifetechnologiesinc.制造的“dna热循环仪”并使用kodfxneo(由toyoboco.,ltd.制造)作为反应试剂来进行。所述反应试剂不包含模板dna，因为使用每个引物作为另一个引物的模板来进行延伸。用于扩增λt0终止子序列的引物：(a-3)5’-gcattaatccttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccg-3’(seqidno：17)(b-3)5’-caccgtgcagtcgatggatctggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggag-3’(seqidno：18)引物(a-3)和(b-3)的3’末端的碱基序列彼此互补。使用1％琼脂糖凝胶对所述产生的反应溶液进行电泳，作为结果，检测到对应于λt0终止子序列的大约0.13-kb的dna片段。(2-2)tac启动子序列的dna片段的制备pcr使用含有tac启动子的质粒pmal-c5x(由newenglandbiolabsinc.制造)作为模板来进行。在所述pcr中，为了扩增tac启动子序列，合成并使用了下述引物对。pcr按照常规方法，使用由lifetechnologiesinc.制造的“dna热循环仪”并使用kodfxneo(由toyoboco.,ltd.制造)作为反应试剂来进行。用于扩增tac启动子序列的引物：(a-4)5’-ttattggtgagaatccagatccatcgactgcacggtgcaccaatgcttct-3’(seqidno：19)(b-4)5’-gcaagcttggagtgatcatcgtatgcatatgcgtttctcctccagatccctgtttcctgtgtgaaattgt-3’(seqidno：20)使用1％琼脂糖凝胶对所述产生的反应溶液进行电泳，作为结果，检测到对应于tac启动子序列的大约0.3-kb的dna片段。(2-3)λt0终止子和tac启动子序列的引入从琼脂糖凝胶中切下在上述(2-1)和(2-2)中制备的dna片段，并通过冻融所述凝胶从凝胶回收dna。将回收的对应于λt0终止子序列和tac启动子序列的dna片段混合并用作模板，进行重叠延伸pcr。在所述重叠延伸pcr中，为了制备其中tac启动子连接到λt0终止子下游的dna，使用了上述引物(a-3)和(b-4)的组合。用于扩增模板dna片段的引物(b-3)和(a-4)的5’末端的碱基序列彼此互补。pshbi和hindiii限制性位点已被分别添加到引物(a-3)和(b-4)。使用1％琼脂糖凝胶对所述产生的反应溶液进行电泳，作为结果，检测到对应于其中tac启动子连接到λt0终止子下游的dna的大约0.4-kb的dna片段。将所述通过pcr扩增的其中tac启动子连接到λt0终止子下游的大约0.4-kb的dna片段和上述克隆载体pcyk01的大约9.8-kb的dna片段用限制性酶pshbi和hindiii切割。使用t4dna连接酶(由takarabioinc.制造)将所述切割的dna片段彼此相连。通过氯化钙法，使用所述得到的连接溶液转化大肠杆菌jm109，并将转化体施加到含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上。将所述培养基上的活菌株通过常规方法在液体培养基中培养，并从得到的培养液提取质粒dna。将该质粒dna用限制性酶pshbi和hindiii切割并确认插入的片段。作为结果，除了来自于质粒pcyk01的大约9.6-kb的dna片段之外，还观察到其中tac启动子连接到λt0终止子下游的大约0.4-kb的dna片段。(2-4)rrnbt1t2双向终止子(在后文中可能被称为“rrnb终止子”)的引入pcr使用含有rrnb终止子序列的质粒pmal-c5x(由newenglandbiolabsinc.制造)作为模板来进行。在所述pcr中，为了扩增rrnb终止子序列，合成并使用了下述引物对。pcr按照常规方法，使用由lifetechnologiesinc.制造的“dna热循环仪”并使用kodfxneo(由toyoboco.,ltd.制造)作为反应试剂来进行。用于扩增rrnb终止子序列的引物：(a-5)5’-ctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtg-3’(seqidno：21)(b-5)5’-cgcaattgagtttgtagaaacgcaaaaaggccatc-3’(seqidno：22)ecori和muni限制性位点已被分别添加到引物(a-5)和(b-5)中。使用1％琼脂糖凝胶对所述产生的反应溶液进行电泳，作为结果，检测到对应于rrnb终止子序列的大约0.6-kb的dna片段。将通过上述pcr扩增的含有rrnb终止子序列的大约0.6-kb的dna片段用限制性酶ecori和muni切割，并将在上述(2-3)中构建的质粒的大约10.0-kb的dna片段用限制性酶ecori切割。使用t4dna连接酶(由takarabioinc.制造)将所述切割的dna片段彼此相连。通过氯化钙法，使用所述得到的连接溶液转化大肠杆菌jm109，并将得到的转化体施加到含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上。将所述培养基上的活菌株通过常规方法在液体培养基中培养，并从得到的培养液提取质粒dna。将该质粒dna用限制性酶ecori和muni切割并确认插入的片段。作为结果，除了来自于上述(2-3)的质粒的大约10.0-kb的dna片段之外，还观察到对应于rrnb终止子序列的大约0.6-kb的dna片段。所构建的用于基因表达的克隆载体被命名为pcyk21。(3)能够产生乳酸的转化体(3-1)乳酸脱氢酶基因的克隆按照常规方法从parageobacillusthermoglucosidasiusnbrc107763、嗜热地芽孢杆菌nbrc102445和红色亚栖热菌nbrc106122提取基因组dna。嗜热栖热菌hb8菌株(atcc27634)的基因组dna购自takarabioinc。将上述四种基因组dna各自用作模板，通过pcr方法分别扩增含有parageobacillusthermoglucosidasius、嗜热地芽孢杆菌和嗜热栖热菌中的每一者的乳酸脱氢酶ldh基因的dna片段和含有嗜热栖热菌和红色亚栖热菌中的每一者的苹果酸/乳酸脱氢酶mldh基因的dna片段。将下述引物用于pcr。pcr按照常规方法，使用由lifetechnologiesinc.制造的“dna热循环仪”并使用kodfxneo(由toyoboco.,ltd.制造)作为反应试剂来进行。用于扩增parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因的引物：(a-6)5’-ttacatatgaaacaacaaggcatgaatcgagtagc-3’(seqidno：23)(b-6)5’-ttagaattcttattttacatcatcaaaataacggg-3’(seqidno：24)ndei限制性位点已被添加到引物(a-6)中，ecori限制性位点已被添加到引物(b-6)中。用于扩增嗜热地芽孢杆菌ldh基因的引物：(a-7)5’-ttacatatgaaaaacgggagaggaaatcgggtagc-3’(seqidno：25)(b-7)5’-ttagaattcttactgagcaaaatagcgcgccaata-3’(seqidno：26)ndei限制性位点已被添加到引物(a-7)中，ecori限制性位点已被添加到引物(b-7)中。用于扩增嗜热栖热菌ldh基因的引物：(a-8)5’-ttacatatgaaggtcggcatcgtgggaagcggcat-3’(seqidno：27)(b-8)5’-ttagaattcctaaaaccccagggcgaaggccgcct-3’(seqidno：28)ndei限制性位点已被添加到引物(a-8)中，ecori限制性位点已被添加到引物(b-8)中。用于扩增嗜热栖热菌mldh基因的引物：(a-9)5’-ttacatatgaggtggcgggcggacttcctctcggc-3’(seqidno：29)(b-9)5’-ttagaattctcaagcatcgtccctccaaggcacgc-3’(seqidno：30)ndei限制性位点已被添加到引物(a-9)中，ecori限制性位点已被添加到引物(b-9)中。用于扩增红色亚栖热菌mldh-1基因的引物：(a-10)5’-ttacatatgcaaggcattcctgtgcaacaactgcg-3’(seqidno：31)(b-10)5’-ttagaattcttaaaggcccaccgctttagcggcct-3’(seqidno：32)ndei限制性位点已被添加到引物(a-10)中，ecori限制性位点已被添加到引物(b-10)中。用于扩增红色亚栖热菌mldh-2基因的引物：(a-11)5’-ttacatatgagggttccttatcccgtactcaagca-3’(seqidno：33)(b-11)5’-tttgaattctcatcttgtccctcctccttgtagat-3’(seqidno：34)ndei限制性位点已被添加到引物(a-11)中，ecori限制性位点已被添加到引物(b-11)中。使用1％琼脂糖凝胶对所述产生的反应溶液进行电泳，并且对于parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因中的每一者来说，检测到大约1.0-kb的dna片段。将通过上述pcr扩增的含有parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因中的每一者的大约1.0-kb的dna片段用限制性酶ndei和ecori切割。将上述克隆载体pcyk21的大约10.6-kb的dna片段也用限制性酶ndei和ecori切割。用t4dna连接酶(由takarabioinc.制造)将所述每个切割的1.0-kbdna片段和10.6-kbdna片段彼此相连。将所述得到的连接液用于通过电脉冲法转化热淡黄嗜氢菌(hydrogenophilusthermoluteolus)菌株th-1(nbrc14978)，并将得到的转化体施加到含有50μg/ml卡那霉素的a-固体培养基[(nh4)2so43.0g，kh2po41.0g，k2hpo42.0g，nacl0.25g，feso4·7h2o0.014g，mgso4·7h2o0.5g，cacl20.03g，moo34.0mg，znso4·7h2o28mg，cuso4·5h2o2.0mg，h3bo34.0mg，mnso4·5h2o4.0mg，cocl2·6h2o4.0mg，琼脂15g，溶解在1l蒸馏水中(ph7.0)]上，并在充满h2:o2:co2＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃温育60小时。使用铂环将所述a-固体培养基上的每个活的菌株接种到含有5ml含50μg/ml卡那霉素的a-液体培养基[(nh4)2so43.0g，kh2po41.0g，k2hpo42.0g，nacl0.25g，feso4·7h2o0.014g，mgso4·7h2o0.5g，cacl20.03g，moo34.0mg，znso4·7h2o28mg，cuso4·5h2o2.0mg，h3bo34.0mg，mnso4·5h2o4.0mg，cocl2·6h2o4.0mg，溶解在1l蒸馏水中(ph7.0)]的试管中。所述试管充满h2:o2:co2＝7.5:1:1.5的混合气体，在50℃下进行振摇培养，并从所述培养液提取质粒dna。将分别包含parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因的质粒用限制性酶ndei和ecori切割并确认所述插入的片段。作为结果，除了质粒pcyk21的大约10.6-kbdna片段之外，还观察到长度约为1.0-kb的片段，它们分别是插入的parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因的片段。含有parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因的质粒被命名为pc-pth-ldh，含有嗜热地芽孢杆菌ldh基因的质粒被命名为pc-gka-ldh，含有嗜热栖热菌ldh基因的质粒被命名为pc-tth-ldh，含有嗜热栖热菌mldh基因的质粒被命名为pc-tth-mldh，含有红色亚栖热菌mldh-1基因的质粒被命名为pc-mru-mldh-1，含有红色亚栖热菌mldh-2基因的质粒被命名为pc-mru-mldh-2。热淡黄嗜氢菌重组菌株所带有的质粒示出在表1中。[表1]菌株质粒转入基因ldh03pc-pth-ldhldh(parageobacillusthermoglucosidasius)ldh04pc-gka-ldhldh(嗜热地芽孢杆菌)ldh05pc-tth-ldhldh(嗜热栖热菌)mldh01pc-tth-mldhmldh(嗜热栖热菌)mldh02pc-mru-mldh1mldh-1(红色亚栖热菌)mldh03pc-mru-mldh2mldh-2(红色亚栖热菌)(3-2)确认转入基因在已引入产乳酸基因的热淡黄嗜氢菌菌株中的表达使用铂环将如上所述获得的每个引入了乳酸脱氢酶基因或苹果酸/乳酸脱氢酶基因的菌株接种到含有5ml含50μg/ml卡那霉素的a-液体培养基的试管中。所述试管充满h2:o2:co2＝7.5:1:1.5的混合气体，并在50℃下进行振摇培养20小时。通过离心(4℃，15,000rpm，1分钟)收集由此培养并增殖的细菌细胞。通过超声处理破碎所述细菌细胞，随后离心(4℃，15,000rpm，5分钟)以获得细胞破碎上清液。将所述细胞破碎上清液用作粗酶液，通过下述方法测量乳酸脱氢酶活性。将粗酶液、50mm乙酸钠(ph5.0)、0.5mmnadh、0.2mm果糖1,6-二磷酸和5mm丙酮酸钠混合，在50℃下反应，跟踪来自于nadh的340nm处吸收值的减少，并分析反应的初始速率。从反应的初始速率和蛋白质浓度计算比活性。每分钟产生1μmol乳酸的酶水平被定义为1u(单位)。作为结果，在其中引入了parageobacillusthermoglucosidasiusldh基因的菌株ldh03、其中引入了嗜热地芽孢杆菌ldh基因的菌株ldh04、其中引入了嗜热栖热菌ldh基因的菌株ldh05、其中引入了嗜热栖热菌mldh基因的菌株mldh01、其中引入了红色亚栖热菌mldh-1基因的菌株mldh02和其中引入了红色亚栖热菌mldh-2基因的菌株mldh03中的每一者中，都检测到了感兴趣的乳酸脱氢酶活性。[表2]通过引入ldh或mldh基因而获得的热淡黄嗜氢菌菌株的乳酸脱氢酶活性(3-3)乳酸的生产使用铂环将其中引入有乳酸脱氢酶基因的热淡黄嗜氢菌菌株接种到含有50μg/ml卡那霉素的a-液体培养基中，并在50℃下振摇培养30小时，同时在温育期间供应h2:o2:co2＝7.5:1:1.5的混合气体。在温育后，通过离心(4℃，15,000rpm，1分钟)获得培养上清液，并对培养上清液中的乳酸进行定量。作为结果，如表3中所示，在所述培养上清液中产生了乳酸。[表3](4)保藏菌株热淡黄嗜氢菌ldh05菌株和热淡黄嗜氢菌mldh02菌株保藏于日本国立技术与评估研究院nite专利微生物保藏所(日本千叶县木更津市kazusakamatari2-5-8(邮政编码292-0818))。对于热淡黄嗜氢菌ldh05菌株来说，登记号为bp-02822，接收时期为2018年11月14日。对于热淡黄嗜氢菌mldh02菌株来说，登记号为bp-02828，接收时期为2018年11月21日。因此，这些菌株可供公众使用。此外，在本说明书中描述的所有菌株(包括atcc菌株和nbrc菌株)均根据《布达佩斯公约》国际保藏，或由无任何条款或条件提供所述菌株的组织拥有，或者被销售，因此，这些菌株均可供普通公众使用。工业实用性本发明的转化体使用二氧化碳作为唯一碳源高效生产乳酸，因此，它能够高效生产生物可降解塑料，同时解决由二氧化碳排放量增加引起的全球变暖。序列表<110>株式会社co2资源化研究所（utilizationofcarbondioxideinstituteco.,ltd.）<120>产乳酸的嗜氢菌属细菌转化体<130>fpr0013wo<160>34<170>patentinversion3.5<210>1<211>960<212>dna<213>parageobacillusthermoglucosidasius<400>1atgaaacaacaaggcatgaatcgagtagcacttataggaacggggttcgttggggccagc60tatgcatttgcccttatgaaccaaggaatagcagatgagttagtattgattgatgtaaat120aagaataaggcagagggcgatgtgatggatttaaatcacggaaaagtattcgcgccgaag180ccgatgaatatttggtttggagattatcaagattgccaagacgccgatttggtggtgatt240tgtgcaggggctaaccaaaagccgggagaaacaagactggatcttgttgacaaaaatatt300aatatcttcaaaacgattgtcgattctgtgatgaaatccggatttgatggcgtttttctt360gtggcaacgaacccagtggatattttaacgtatgctacttggaaatttagcgggttaccg420aaagagcgggtaatcggctcaggaacgattcttgatacagcaagattccgcttcttgcta480agtgaatattttcaagtggctccgaccaatgtacatgcgtatattattggcgagcatggg540gatacagagctgcctgtttggagccatgcggaaattggaagcattccagttgagcaaata600ttgatgcaaaacgataactatagaaaagaggatttagacaatatctttgttaatgttcgt660gatgcggcatatcaaatcattgagaaaaaaggggcaacgtattacggcattgcaatggga720ttagtccgtatcactcgtgctattttgcacaatgaaaatgccatcttaaccgtttctgct780catttggacggccaatatggcgaacgaaatgtttatattggcgtgcctgccattatcaac840cgaaacggtattcgtgaagtgatggaattgacgctaaatgaaacagaacaacaacaattc900catcatagtgtaactgtattaaaagacattctttcccgttattttgatgatgtaaaataa960<210>2<211>954<212>dna<213>嗜热地芽孢杆菌（geobacilluskaustophilus）<400>2atgaaaaacgggagaggaaatcgggtagcggtcgtcggcaccgggtttgtcggcgccagt60tatgcgtttgccttaatgaatcaagggattgccgatgagatcgtgctcatcgatgcaaat120gaaaacaaggctgagggcgatgcgatggacttcaaccatgggaaagtatttgcgccgaag180ccggctgacatttggcacggcgattacgatgattgccgcgatgccgatttggttgtcatt240tgcgccggcgccaaccaaaaaccgggcgagacgcggcttgatcttgtggacaaaaacatt300gccattttccgctcgatcgttgagtcggtcatggcatccggatttcaaggactgtttctc360gtcgccaccaatccggtcgacattttaacgtacgcgacgtggaaattcagcggcctgccg420caagagcgagtaatcggatcgggcacgattttggacacggcgcggttccgcttcttgttg480ggcgactatttcgccgtcgccccgacgaacgtgcacgcctatattatcggcgaacatggc540gacactgaactcccggtctggagccaggctgatatcggcggcgtgccgatccgcaagctg600gtcgagtctaaaggggaagaagcgcaaaaagagctcgagcgcatttttgtcaatgtgcgc660gatgccgcctaccaaattattgagaaaaaaggagcgacgtactacgggattgctatgggg720cttgcccgcgtgacgcgcgccattttgcatcatgaaaatgccattttgaccgtttccgct780tacttggacggcccatacggcgaacgcgatgtctacatcggtgtgcctgctgtgatcaac840cgaaatggc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