本发明涉及一种活性肽的制备方法，具体是一种牡蛎活性肽的制备方法。
背景技术：
牡蛎俗称蚝、海蛎子，是一种高蛋白、低脂肪且营养丰富的食品，含有丰富的生理活性物质，被称为“海牛奶”。我国是牡蛎养殖的大国，牡蛎产量占养殖贝类的40％左右，资源极为丰富。牡蛎养殖在宁波市宁海县西店镇已有700年历史。牡蛎味道鲜美、营养价值丰富，历来受世人推崇。牡蛎是中国卫生部公布的第一批87种药食同源的食品之一。牡蛎肉中含有丰富的蛋白质、功能性多肽、各种人体必需氨基酸、多种不饱和脂肪酸以及丰富的糖原和充足的维生素和矿物质等营养成分，具有巨大的食用价值和药用价值。
随着牡蛎养殖技术的快速发展，牡蛎产量迅速增加，已出现供过于求和价格下跌的趋势。目前，牡蛎主要以直接食用和初加工产品为主，如晒干、盐渍、制罐及提炼蚝油等，而以牡蛎为原料的高附加值产品较少。
牡蛎中含有丰富的蛋白，现代研究表明，人类对蛋白质的利用是将蛋白质酶解成小分子多肽或低聚肽吸收利用。小分子多肽或低聚肽具有不需消化直接吸收、不需消耗人体能量、吸收速度快、优先吸收、在人体中合成蛋白质的速率较氨基酸快等诸多优点。目前，从海洋生物中分离制备的多肽、低聚肽已广泛应用于食品、化妆品、药品等行业，需求量每年以20％的速度在递增。然而，目前市场应用的多肽类产品主要是以膜分离为关键技术的生产工艺，该技术仅仅基于筛分原理按照分子尺寸大小将不同肽段分离制备，制备得到的海洋生物肽类产品中功能肽含量(即纯度)较低、生物活性弱，导致科技含量和市场竞争力低，资源优势没有转化为经济优势。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种纯度高、生物活性强、有利于人体吸收的牡蛎活性肽的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种牡蛎活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1)牡蛎肉的预处理：将牡蛎肉用清水洗净后，以1:5～8g/ml的料液比加至体积分数8～15％的正丁醇水溶液中浸泡18～36小时脱脂，再用质量浓度2～8％的氯化钠水溶液浸泡10～20分钟，之后再次清洗牡蛎肉，洗净后将牡蛎肉加至质量浓度1～3％的碳酸氢钠水溶液中，搅拌，过滤以去除脂类物质，然后冲洗过滤得到的牡蛎肉，沥干水分，备用；
2)蛋白质的提取：提取预处理后的牡蛎肉中的蛋白质，再将得到的蛋白质进行干燥称重；
3)将提取的蛋白质以1:8～15g/ml的料液比加至蒸馏水中，该蒸馏水中含有质量浓度0.5～0.7％的蛋白酶，在45～55℃的恒温水浴锅中酶解3～5小时，酶解过程中保持震摇，之后水浴加热至90℃灭酶，离心，取上清，得到酶解液；
4)用体积浓度70％的乙醇溶液醇沉酶解液，冷冻干燥，即得到牡蛎活性肽。
作为优选，步骤1)中，将牡蛎肉用清水洗净后，先对牡蛎肉粉碎处理，再加至正丁醇水溶液中浸泡脱脂。
作为优选，步骤2)中，所述的蛋白质的提取方法为恒温水浴提取法、热回流提取法或高压提取法。
作为优选，步骤2)中，所述的蛋白质的提取方法为高压提取法，即：将预处理后的牡蛎肉进行高压蒸煮，提取得到蛋白质。通过高压提取法得到的蛋白质的质量和提取率高，对于工业生产来说，高压提取法具有时间短、效率高、能耗少等优点。
作为优选，步骤3)中，所述的蛋白酶为糜蛋白酶、风味蛋白酶或胶原蛋白酶。
作为优选，步骤3)中，所述的蛋白酶为糜蛋白酶。以糜蛋白酶酶解牡蛎蛋白质，结合45～55℃/3～5小时的酶解条件，可使得到的酶解液中分子量分布在5000da以下的多肽的比例在64％以上，确保制备得到的牡蛎活性肽的纯度和生物活性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明牡蛎活性肽的制备方法制备的牡蛎活性肽的纯度高，生物活性强，其分子量5000da以下小分子多肽的占比高达56.51％以上，更有利于人体吸收。该牡蛎活性肽可有效抑制α-淀粉酶和超氧阴离子并有效清除dpph·，具有良好的降糖活性和抗氧化活性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：一种牡蛎活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1)牡蛎肉的预处理：将牡蛎肉用清水洗净后，以1:6g/ml的料液比加至体积分数10％的正丁醇水溶液中浸泡24小时脱脂，再用质量浓度6％的氯化钠水溶液浸泡20分钟，之后再次清洗牡蛎肉，洗净后将牡蛎肉加至质量浓度2％的碳酸氢钠水溶液中，搅拌，过滤以去除脂类物质，然后冲洗过滤得到的牡蛎肉，沥干水分，备用；
2)蛋白质的提取：将预处理后的牡蛎肉进行高压蒸煮，通过高压提取法提取得到蛋白质，再将得到的蛋白质进行干燥称重；
3)将提取的蛋白质以1:10g/ml的料液比加至蒸馏水中，该蒸馏水中含有质量浓度0.5％的糜蛋白酶，在50℃的恒温水浴锅中酶解3小时，酶解过程中保持震摇，之后水浴加热至90℃灭酶，离心，取上清，得到酶解液；
4)用体积浓度70％的乙醇溶液醇沉酶解液，冷冻干燥，即得到牡蛎活性肽。
实施例2：一种牡蛎活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1)牡蛎肉的预处理：将牡蛎肉用清水洗净后，以1:5g/ml的料液比加至体积分数8％的正丁醇水溶液中浸泡36小时脱脂，再用质量浓度3％的氯化钠水溶液浸泡12分钟，之后再次清洗牡蛎肉，洗净后将牡蛎肉加至质量浓度1％的碳酸氢钠水溶液中，搅拌，过滤以去除脂类物质，然后冲洗过滤得到的牡蛎肉，沥干水分，备用；
2)蛋白质的提取：通过热回流提取法提取预处理后的牡蛎肉中的蛋白质，再将得到的蛋白质进行干燥称重；
3)将提取的蛋白质以1:15g/ml的料液比加至蒸馏水中，该蒸馏水中含有质量浓度0.6％的风味蛋白酶，在48℃的恒温水浴锅中酶解5小时，酶解过程中保持震摇，之后水浴加热至90℃灭酶，离心，取上清，得到酶解液；
4)用体积浓度70％的乙醇溶液醇沉酶解液，冷冻干燥，即得到牡蛎活性肽。
实施例3：一种牡蛎活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1)牡蛎肉的预处理：将牡蛎肉用清水洗净后，先对牡蛎肉粉碎处理，然后以1:8g/ml的料液比加至体积分数13％的正丁醇水溶液中浸泡30小时脱脂，再用质量浓度8％的氯化钠水溶液浸泡18分钟，之后再次清洗牡蛎肉，洗净后将牡蛎肉加至质量浓度3％的碳酸氢钠水溶液中，搅拌，过滤以去除脂类物质，然后冲洗过滤得到的牡蛎肉，沥干水分，备用；
2)蛋白质的提取：通过恒温水浴提取法提取预处理后的牡蛎肉中的蛋白质，再将得到的蛋白质进行干燥称重；
3)将提取的蛋白质以1:9g/ml的料液比加至蒸馏水中，该蒸馏水中含有质量浓度0.55％的胶原蛋白酶，在54℃的恒温水浴锅中酶解4小时，酶解过程中保持震摇，之后水浴加热至90℃灭酶，离心，取上清，得到酶解液；
4)用体积浓度70％的乙醇溶液醇沉酶解液，冷冻干燥，即得到牡蛎活性肽。
分别取实施例1～实施例3的步骤3)得到的酶解液，测定其分子量5000da以下多肽的占比，结果见表1。从表1可见，分子量5000da以下小分子多肽的占比高达56.51％以上。
表5不同酶酶解上清液多肽所占比例
分别实验评价实施例1～实施例3制备的牡蛎活性肽的降糖活性和抗氧化活性。以α-淀粉酶抑制率为指标，实施例1～实施例3制备的牡蛎活性肽均可抑制α-淀粉酶，其中实施例2的牡蛎活性肽的活性最高，为67.13％，实施例1和实施例3分别为47.22％和26.89％。以dpph·清除率为指标，实施例1～实施例3制备的牡蛎活性肽均可清除dpph·，其中实施例1的牡蛎活性肽的活性最高，为58.09％，实施例2和实施例3分别为50.00％和51.36％。以抑制超氧阴离子为指标，实施例1～实施例3制备的牡蛎活性肽均可抑制超氧阴离子，其中实施例1的牡蛎活性肽的活性最高，为53.64％，实施例2和实施例3分别为46.53％和47.19％。可见，不同蛋白酶酶解所得牡蛎活性肽的体外降血糖和抗氧化活性不同，这可能与蛋白酶的种类有关，由于不同的蛋白酶作用的肽键位点不同，通过水解得到不同特性的肽类，因此酶是影响牡蛎多肽活性的重要因素之一。综合考虑制备得到的牡蛎活性肽的纯度和生物活性，本发明酶解优选糜蛋白酶。