基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及结合高分辨率熔解曲线分析(hrm)、多元统计及环介导等温核酸扩增(lamp)技术同时检测多个dna片段的方法，具体涉及利用高分辨熔解曲线对多重lamp中的多个扩增子进行区分鉴定的方法。

背景技术：

环介导等温核酸扩增(lamp)由于其高灵敏度和特异性，及高速扩增和对实际样品中存在的各种抑制剂的耐受性，是最广泛使用和研究的等温扩增技术。然而，由于lamp扩增产物不像聚合酶链式反应(pcr)的产物那样具有已知特定大小的片段，其凝胶电泳为阶梯状结构，不能通过传统凝胶电泳观察扩增产物条带大小和数量来进行多重的检测。

核酸的多重等温扩增和检测在临床检验、食品安全和环境分析在内的多个领域可以节省成本和时间，具有十分重要的意义。为了实现lamp技术的多重检测，前人通过空间并行的多个单反应检测予以实现，例如，dna结合染料、浊度法和焦磷酸盐离子指示剂。但是，这些与序列无关的检测手段可能产生假阳性结果，并且需要将样品分成几个单重反应。相比之下，可以在单一体系中同时检测多个靶标才真正意义上实现了多重lamp。为了一次区分不同的扩增子，有文献报导利用在lamp扩增后增加限制性消化，然后进行凝胶电泳或焦磷酸测序(iseki,h.,etal.journalofmicrobiologicalmethods,2007.71.281.liang,c.,etal.analyticalchemistry,2012.84.3758.)的处理步骤，可以实现多个目标的检测，但由于需要开管，因此有生成气溶胶污染的风险且操作复杂、费时费力。多色荧光检测能够在闭管中实现多个目标的序列特异性检测，但是所采用的dna链置换检测容易抑制lamp反应，并且多色荧光标记和多通道光学元件导致检测成本较高。

熔解曲线分析提供了一种实现多重lamp检测的方法，它具有操作简便、检测迅速、密封无污染、成本低的优点。由于dna解链温度(即，熔解温度，tm)主要取决于不同的扩增子序列长度和gc含量，使得多重lamp扩增的熔解曲线分析可以在一管内同时检测多个dna序列。然而，传统多重熔解曲线分析需要体系内的扩增子在熔解温度上具有3～5℃的差异(姜侃,etal.现代食品科技,2016.32.246；姜侃,etal.食品与机械,2015.31.87.)，因此，要求多重lamp引物设计需要确保其特异性，避免引物之间的相互作用，并产生具有足够tm差异的扩增子。但引物设计的复杂性以及后续的优化步骤限制了这一类多重lamp检测的广泛应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法，包括以下步骤：

1)靶序列单重lamp扩增

根据各目标检测物样品中待检测目的基因的不同选取靶序列并针对各个靶序列设计对应的引物(标准lamp特异性引物)，提取目标检测物样品内的dna，将该dna作为模板；将模板及对应引物进行单重lamp扩增反应，根据反应结果确定lamp扩增反应的反应体系(主要是确定针对靶序列的引物的有效性)；

2)多重lamp反应条件优化

将步骤1)涉及的目标检测物样品两两进行组合，然后针对组合后对应的两个模板同时进行lamp扩增反应，扩增反应后获取高分辨率熔解曲线，然后根据对应两个扩增产物的解链峰的差异程度优化所述扩增反应的反应条件；将不同目标检测物样品组合对应的反应条件的优化结果进行合并(取交集)，得到多重lamp扩增反应的反应条件；

3)多重扩增检测

经过步骤2)后，提取待测样品中的dna，并以该dna为模板进行多重lamp扩增反应，扩增反应后获取高分辨率熔解曲线，然后对高分辨率熔解曲线进行归一化或对高分辨率熔解曲线进行主成分分析，然后与同样采用归一化或主成分分析构建得到的标准高分辨率熔解曲线模型(曲线集)进行比对，根据比对结果，鉴别待测样品所含单个靶序列或多个靶序列，从而可以鉴别样品中所含的目标检测物种类。

优选的，所述dna的提取采用试剂盒法。

优选的，所述反应条件的优化主要针对反应温度(lamp实时荧光扩增所需的扩增温度)。

优选的，所述步骤2)中，优化所述扩增反应的反应条件具体包括以下步骤：确定两个模板同时扩增所得扩增产物的熔解温度差异，若所述熔解温度差异>3℃，选取使该两个模板的扩增产物对应解链峰面积相等时的反应温度为优化的反应温度，若所述熔解温度差异≤3℃，选取使该两个模板的扩增产物的归一化高分辨率熔解曲线位于对应单个模板扩增产物的归一化高分辨率熔解曲线之间时的反应温度为优化的反应温度。

优选的，所述标准高分辨率熔解曲线模型的构建方法具体包括以下步骤：经过步骤2)后，对步骤1)涉及的目标检测物样品中的任意一种或任意数量的组合所对应的模板，分别使用针对全部靶序列的引物进行多重lamp扩增反应，然后获取高分辨率熔解曲线，并分别采用归一化或主成分分析对对应高分辨率熔解曲线轮廓进行特征提取。

优选的，所述靶序列选自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的fem基因、单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)的virr基因、沙门氏菌属的inva基因中的一种或多种。

优选的，所述步骤3)中，多重lamp扩增反应选自三重以上lamp扩增反应。

一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测试剂盒，该试剂盒包括用于构建lamp扩增反应的反应体系的试剂以及用于比对的针对多种目的基因的靶序列扩增产物的标准高分辨率熔解曲线模型，所述模型是通过对不同靶序列中的一种或任意数量的组合的扩增产物的高分辨率熔解曲线进行归一化或主成分分析而得到的；所述试剂包括用于扩增对应靶序列的标准lamp特异性引物以及用于lamp实时荧光扩增的单一核酸染料(例如，evagreen)。

优选的，所述试剂还包括缓冲液(例如，10×isothermalamplificationbuffer)、dntp、甜菜碱、硫酸镁、bstdna聚合酶等分开包装的组分和超纯水。

优选的，上述试剂盒的扩增反应体系及反应条件的确定参照上述步骤1)和步骤2)，试剂盒的使用方法参考上述步骤3)，模型构建参照上述标准高分辨率熔解曲线模型的构建方法。

本发明的有益效果体现在：

本发明将多重lamp与hrm技术结合，采用高分辨率的熔解并从整个熔解曲线轮廓提取熔解特性而不是仅依靠tm数值，使微小的tm差异也可以在两个lamp扩增子之间进行明确的区分。并且可以通过将样品熔解特征与所建立的标准hrm模型进行比对来直观地鉴别lamp反应中的多个靶标来源。本发明具有检测方法序列特异性、闭管和成本较低、易操作的优点，简便的实现多重lamp检测。

附图说明

图1为单重lamp扩增曲线(a)、原始高分辨率熔解曲线(b)、解链峰(c)及扩增产物凝胶电泳(d)图；图1d中m表示marker。

图2为双重lamp扩增解链峰(a)及归一化高分辨率熔解曲线(b)图。

图3为三重lamp扩增的归一化高分辨率熔解曲线(a)及(d)、原始高分辨率熔解曲线聚类分析(b)及解链峰(c)图；图3a针对不同靶序列或靶序列的组合具有七条独立的归一化hrm熔解曲线，可实现对所有靶序列或靶序列组合的区分；图3b中：factor1、factor2分别表示第一主成分和第二主成分，利用主成分分析(pca)对hrm曲线轮廓进行分析获得的七个聚类圈对应于每个特定样品，在每个样品间不会观察到重叠，与图3a比较表现出更清晰的可视化差异；图3d中：不同比例金黄色葡萄球菌与单核细胞增生李斯特氏菌混合样品具有各自独立的归一化hrm熔解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明基于三种扩增靶标片段(即靶序列)的tm值差异，建立了基于高分辨率熔解曲线分析(hrm)鉴定的多重lamp检测技术。

(一)多重环介导等温核酸扩增高分辨率熔解检测的可行性

1、设计lamp引物

1.1采用金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的fem基因保守序列为靶序列s1，扩增s1的特异性引物为：

s.aur-f3(5’-3’)：tttaacagctaaagagtttggt

s.aur-b3(5’-3’)：tttcataatcgatcactggac

s.aur-fip(5’-3’)：ccttcagcaaagctttaactcatagtttttcagatagcatgccatacagtc

s.aur-bip(5’-3’)：acaataataacgaggtcattgcagcttttcttgaacactttcataacaggtac

1.2采用单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)特有的virr基因的部分片段为靶序列s2，扩增s2的特异性引物为：

l.mon-f3(5’-3’)：gtcttttaagtggagtaaacctt

l.mon-b3(5’-3’)：acaagacttcaccaatcca

l.mon-fip(5’-3’)：cctgtgccaaagcatttttacattttttaggcaagtcatcttgttcg

l.mon-bip(5’-3’)：taagtctctttgcaattgaccgacttttacgtgtacacagaaaagcg

1.3伤寒沙门氏菌(salmonellaspp)，采用沙门氏菌属特有的inva基因的部分片段为靶序列s3，扩增s3的特异性引物为：

s.spp-f3(5’-3’)：cggcccgattttctctgg

s.spp-b3(5’-3’)：cggcaatagcgtcacctt

s.spp-fip(5’-3’)：gcgcggcatccgcatcaatatgcccggtaaacagatgagt

s.spp-bip(5’-3’)：gcgaacggcgaagcgtactgtcgcaccgtcaaaggaac

上述引物均在2018年5月完成设计，并由上海生工生物工程有限公司合成并纯化。

上述细菌的菌株(staphylococcusaureusatcc6538、listeriamonocytogenesatcc19115、salmonellasppcmcc50071，分别简称为金葡、李斯特、沙门)均在2017年5月购买得到。

2、提取模板及靶序列单重lamp扩增

(1)细菌dna的提取

无菌操作下，利用lb培养基对上述不同种属的细菌分别进行增菌处理，参照tguide细菌基因组dna提取试剂盒(osr-m502)说明书对增菌处理所得菌体分别进行基因组dna的提取和纯化。

(2)无菌操作下进行单重lamp扩增的反应体系的配制

采用10μl反应体系进行扩增，反应体系包括10×isothermalamplificationbuffer1μl、扩增以上任意一种菌的靶序列的内引物fip和bip各1.6μm、外引物f3和b3各0.2μm、dntp1.4mm、甜菜碱0.8m、硫酸镁5mm、bst2.0dna聚合酶3.2u、步骤(1)提取的dna(模板，10⁶copies/μl)1μl及0.25μlevagreen(20×)荧光染料，剩余用超纯水补齐。设置金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、无模板对照四个样品组，无模板对照为ntc，每个样品组做6次重复。

(3)在高分辨实时荧光pcr仪上进行反应：67℃下进行扩增，每1min收集一次信号，利用sbgrgreeni通道进行信号采集，反应50分钟，在75℃至95℃的温度区间进行高分辨熔解曲线分析，熔解速率为0.05℃/s。

(4)实验结果

按照步骤(3)用提取的dna作为模板，分别加入特异性内、外引物，进行lamp实时荧光扩增实验。实验可得到扩增曲线(图1a)，对扩增产物进行hrm分析后得到扩增产物的熔解曲线(图1b)，并进一步根据熔解曲线得到特征解链峰(图1c)，用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行验证，阳性样品(图1d中标记为“+”，即对应细菌dna模板的扩增)均有lamp扩增产物梯形条带产生(图1d中“-”标记泳道为ntc)。以上结果证明，选取的三段靶序列均可进行有效的lamp扩增，并通过hrm分析生成其特征熔解曲线(包括由熔解曲线原始数据可分析得到的熔解曲线峰和归一化熔解曲线)；同时，具有相近gc比例的金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的靶序列所对应的解链峰之间有部分重叠，熔解温度差异较小(1.3℃)，但传统的熔解曲线分析要求熔解温度具有3～5℃的差异，且一般无法定性鉴别，因此，无法实现通过一次多重lamp扩增同时对上述三段靶序列进行检测。

(二)双重环介导等温核酸扩增的高分辨熔解曲线分析

(1)增菌培养、dna提取同单重lamp扩增。

(2)引物设计、合成同单重lamp扩增。

(3)无菌操作下，进行双重lamp扩增的反应体系的配制：采用10μl反应体系进行扩增，反应体系包括10×isothermalamplificationbuffer1μl、同时扩增以上任意两种菌的靶序列的内引物fip和bip各0.8μm、外引物f3和b3各0.1μm、dntp1.4mm、甜菜碱0.8m、硫酸镁5mm、bst2.0dna聚合酶3.2u、dna模板1μl(10⁶copies/μl)及0.25μlevagreen(20×)荧光染料，剩余用超纯水补齐。设置金黄色葡萄球菌+单核细胞增生李斯特氏菌(模板等比混合)、单核细胞增生李斯特氏菌+沙门氏菌(模板等比混合)、金黄色葡萄球菌+沙门氏菌(模板等比混合)及无模板对照四个样品组，无模板对照为ntc，每个样品组做6次重复，且对应于每个混合模板组，均设置使用与其扩增引物相同但仅包括对应单个模板(金黄色葡萄球菌模板、沙门氏菌模板、单核细胞增生李斯特氏菌模板)的扩增对照。

(4)各个样品组的扩增检测程序(实时荧光扩增反应、高分辨熔解曲线分析)设置中，扩增反应温度是根据以下原则优化的结果：

同时扩增两个不同的dna靶标，当观察两个扩增子(即扩增产物)解链峰具有较大tm差异(>3℃)，选取使该两解链峰面积相等时的反应温度为最佳扩增温度，此时两种扩增子含量接近，扩增效率接近；当tm值差异较小时(≤3℃)，仅产生单一解链峰，可从归一化hrm曲线轮廓中观察差异，当混合模板样品归一化高分辨率熔解曲线位于对应两个单模板样品对照正中间时，则两靶标都实现了扩增，且扩增效率接近；

(5)实验结果

如图2a所示，当两种lamp扩增产物熔解温度差异较大时，解链峰图中在相应温度处有特征峰产生，以此可作为双重lamp扩增中扩增子的识别检测依据。但当熔解温度差异较小时，例如金黄色葡萄球菌与单核细胞增生李斯特氏菌的样品组(1.3℃)，双重扩增子只产生一个解链峰，无法用观测特征峰的方法进行鉴别。而在归一化的高分辨曲线图(图2b)中，具有较小熔解温度差异的金黄色葡萄球菌与单核细胞增生李斯特氏菌则可以很容易的明确鉴别出来(各归一化曲线整体位置是相互区分的)。以上结果表明以上的高分辨熔解分析可以应用于准确区分采用传统熔解曲线分析无法区分的lamp扩增产物；并且对于熔解温度相近的lamp扩增产物的鉴别，利用高分辨熔解曲线整体所包含信息是明显优于仅单独依据tm值的。根据不同情况下(样品组)优化的扩增反应温度，即可确定用于三重环介导等温核酸扩增实验的优化的反应温度(本例为66.5～67.5℃)。

(三)三重环介导等温核酸扩增的高分辨率熔解检测

(1)增菌培养、dna提取同单重lamp扩增。

(2)引物设计、合成同单重lamp扩增。

(3)无菌操作下，进行三重lamp扩增的反应体系的配制：采用10μl反应体系进行扩增，包括10×isothermalamplificationbuffer1μl、扩增单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌的靶序列的内引物fip和bip各0.8μm、外引物f3和b3各0.1μm、dntp1.4mm、甜菜碱0.8m、硫酸镁5mm、bst2.0dna聚合酶3.2u、dna模板1μl(10⁶copies/μl)及0.25μlevagreen(20×)荧光染料，剩余部分用超纯水补齐。设置金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌+单核细胞增生李斯特氏菌(模板等比混合)、金黄色葡萄球菌+沙门氏菌(模板等比混合)、沙门氏菌+单核细胞增生李斯特氏菌(模板等比混合)、金黄色葡萄球菌+沙门氏菌+单核细胞增生李斯特氏菌(模板等比混合)以及无模板对照共8个样品组，无模板对照为ntc，每个样品组做6次重复。

(4)各个样品组的扩增检测程序(实时荧光扩增反应、高分辨熔解曲线分析)设置中，反应温度参考二重环介导等温核酸扩增实验的优化结果，具体取为67℃。

(5)实验结果

对来自三种不同靶标的七种样品，lamp扩增后进行高分辨熔解曲线分析。如图3a所示，七条归一化高分辨率熔解曲线分别对应七个不同样品，从而对不同样本实现区分(可作为标准hrm模型)；如图3b所示，进一步利用主成分分析(pca)对样品的hrm原始曲线进行分析，可以获得对应于七个样品的对应七个明确聚类，在每个样品间没有重叠，观察到清晰的可视化差异(可作为标准hrm模型)。证明归一化高分辨率熔解曲线可对以上3种细菌的dna及其混合样品进行有效扩增检测。

与之对应的是，利用传统熔解曲线峰的tm值来检测以上3种细菌的dna及其混合物时，包含有tm值差值较小的金黄色葡萄球菌与单核细胞增生李斯特氏菌的dna的混合样品难以准确鉴别(图3c)，如金黄色葡萄球菌+单核细胞增生李斯特氏菌样品仅出现一个解链峰，金黄色葡萄球菌+单核细胞增生李斯特氏菌+沙门氏菌仅出现两个解链峰；再次说明了使用整个熔解曲线信息而非仅参考tm值进行鉴别的优越性和必要性。

(四)多重lamp的灵敏度及实际应用

通过对模拟样本进行盲测，以评估此方法(三重)的检测性能。分析显示其识别准确率为100％，表明多重lamp具有良好的重现性。

对不同浓度的dna模板进行多重lamp扩增。由于多重lamp可以单独扩增具有不同初始浓度的靶序列，在lamp的扩增终点达到类似的平台浓度，故可对低至10个拷贝的靶序列进行有效检出，有较高的灵敏度。

在检测体系(指扩增体系)中加入血清(10％)或牛奶(10％)时，仍可进行清晰的聚类分析(归一化曲线同样可用于鉴别)，表明在实际样品检测中稳健的适用性。

在实际样品中存在的细菌所含比例常常不同，需要对不同比例的细菌进行分析，如图3d所示，当存在不同比例的细菌时，归一化熔解曲线可对不同比例细菌的样品进行分析。

(五)多重lamp高分辨熔解曲线检测试剂盒的制备

将10×isothermalamplificationbuffer、dntp、甜菜碱、硫酸镁、bstdna聚合酶及饱和荧光染料evagreen共同包装，得到高分辨lamp检测试剂盒。

使用时根据样品检测目的需要加入多重lamp的内、外引物和模板，扩增(参照获得标准hrm模型的条件)后，在hrm荧光仪上进行检测，然后参照试剂盒内附的标准hrm模型进行比对，对样品所含特定目标检测物(例如细菌)进行定性鉴别。

总之，本发明融合了环介导恒温扩增(lamp)与高分辨率熔解两者的优势，建立了一种简单、快速、闭管、高通量、低成本的单色多重核酸恒温扩增检测技术。其优势在于：

(1)相比传统的熔解曲线分析需要tm相差3～5℃，hrm可分辨的tm差异降低至0.2℃，这将显著降低多重lamp引物的设计难度，使得具有微小tm差异的多个lamp扩增产物也能够被同时检测；并且在同一反应管内可同时检测的目标dna数量显著增加，在75～95℃熔解范围内，理论上的检测目标(不同靶序列)数达到100个。

(2)hrm的信号收集仅需要单通道的荧光dna结合染料，避免了多色荧光标记或者在空间分隔平行进行多个单重扩增反应，且用标准lamp引物(不用额外修饰)，降低了检测成本。通过分析不同lamp扩增产物的解链温度，进行多重lamp检测，实现节省试剂、快速简便和提高样品通量的目的。

(3)本发明鉴别能力不受dna模板初始浓度的影响，灵敏度可达10个拷贝；在复杂的样品基质中显现出优良的检测性能，具有较强实际应用价值。

(4)本发明在扩增前添加染料，扩增后在闭管状态下熔化扩增子产生熔解曲线。每个扩增子之间独特的gc含量和序列的不同，其熔解曲线是特异性的。通过归一化或主成分分析等统计学手段进行分析，即可利用熔解曲线作为特定目标识别的唯一指纹。

<110>陕西科技大学

<120>基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒

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