一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法与流程

文档序号:17188772发布日期:2019-03-22 21:45阅读:469来源:国知局
一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法与流程
本发明属于天然蛋白酶提取
技术领域
,具体涉及一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法。
背景技术
:随着酶工程在食品工业中得到了越来越广泛的应用,蛋白酶资源的需求量也越来越大。尽管可以通过基因工程、人工合成或微生物发酵等手段获得蛋白酶,但对天然动植物蛋白酶资源依然需求量较大,特别是一些具有水解活性的蛋白酶存在严重短缺的问题。辣木树是多年生热带、亚热带落叶乔木,属被子门辣木科辣木属植物,拉丁学名为moringaoleiferalam.,英文名称为moringa,另外还有多种别名,根据其豆荚形状(细长、呈三角形),称为鼓槌树(drumsticktree),根据其根部具有辛辣味,称为辣根树(horseradishtree);根据其籽实可榨油,称为奔油树(benoiltree或者benzoiltree)。辣木是云南特色优势产业,资源丰富,辣木籽的种子和叶子中含有丰富的营养成分,但辣木籽本身含有生物碱、辣木黄酮,高血压、糖尿病患者及孕妇等最好经医师指示后酌量食用。目前,有关辣木及其附属品的食用或药用价值报道较多,然而对蛋白酶及其生物活性的研究却鲜有报道,更没有一种关于如何提取高含量、高水解活性的蛋白酶的方法。技术实现要素:有鉴于此,本发明的目的在于提供一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法,采用所述方法提取的蛋白酶不仅含量高,而且水解活性强。本发明提供的一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法,包括以下步骤:1)从发芽辣木籽和干辣木籽中分别进行蛋白质非标记相对定量分析,筛选干辣木籽总蛋白和发芽辣木籽总蛋白之间的差异蛋白;发芽辣木籽的芽长为10~15cm,发芽辣木籽的质量为12.57~13.09g/15粒;干辣木籽的质量为4.31-4.53g/15粒;2)统计步骤1)所述差异蛋白中上调表达的蛋白质,将得到的上调表达的蛋白质进行go功能注释,得到具有水解活性的蛋白酶;3)采用盐法提取发芽辣木籽蛋白酶,得到辣木籽蛋白酶盐提液;4)根据步骤2)中筛选得到具有水解活性的蛋白酶的pi值,调整步骤4)中辣木籽蛋白酶盐提液的ph值至所述pi值,收集蛋白酶沉淀,复溶,脱盐,得到辣木籽蛋白酶粗提液;5)根据步骤2)中筛选得到具有水解活性的蛋白酶的分子量,选择超滤膜对所述辣木籽蛋白酶粗提液中的蛋白进行超滤截留,收集目标分子量的蛋白酶,得到具有水解活性蛋白酶。优选的,步骤1)中所述发芽辣木籽的培养方法将辣木籽用4~10℃水浸润,再在20~25℃的水中浸泡24~26h,得到的浸泡辣木籽在恒温恒湿的环境中培养;培养第1~3天,培养温度为25~30℃、湿度为70%~75%;培养第4~6天,培养温度为22~25℃、湿度控制在60%~65%。优选的,步骤2)中具有水解活性的蛋白酶包括8种蛋白酶;8种蛋白酶的氨基酸序列分别为序列表中seqidno.1~8所示;所述seqidno.1所示的蛋白酶的pi为10.10;所述seqidno.1所示的蛋白酶的分子量为11789.27;所述seqidno.2所示的蛋白酶的pi为7.55;所述seqidno.2所示的蛋白酶的分子量为18459.82;所述seqidno.3所示的蛋白酶的pi为7.15;所述seqidno.3所示的蛋白酶的分子量为18811.2;所述seqidno.4所示的蛋白酶的pi为6.23;所述seqidno.4所示的蛋白酶的分子量为52880.49;所述seqidno.5所示的蛋白酶的pi为10.63;所述seqidno.5所示的蛋白酶的分子量为6802.67;所述seqidno.6所示的蛋白酶的pi为5.24;所述seqidno.6所示的蛋白酶的分子量为31591.8;所述seqidno.7所示的蛋白酶的pi为10.36;所述seqidno.7所示的蛋白酶的分子量为9427.98;所述seqidno.8所示的蛋白酶的pi为7.75;所述seqidno.8所示的蛋白酶的分子量为18756.12。优选的,步骤2)中盐法提取发芽辣木籽蛋白酶的方法包括所述发芽辣木籽粉碎,过筛,得到的筛下物和氯化钠溶液混合,提取,固液分离,得到辣木籽蛋白酶盐提液。优选的,所述过筛的筛孔不小于60目;所述筛下物的质量和氯化钠溶液的体积为1g:5ml;所述氯化钠溶液的浓度为0.25~0.30mol/l。优选的,提取的温度为30℃;提取的时间为0.5~1h;提取时料液的ph值为7.15。优选的,收集蛋白酶沉淀的方法包括离心;所述离心的转速为4500-5000r/min;所述离心的时间为20~30min。优选的,复溶的方法为将收集的蛋白酶沉淀和水混合,得到的混合液进行超声溶解得到蛋白酶溶液;所述蛋白酶沉淀的质量和水的体积比为5g:5~10ml;所述超声的功率为200hz;所述超声的时间为2~5min。优选的,所述脱盐前还依次包括对所述蛋白酶溶液调整ph值和预分离;蛋白酶溶液的ph值调整至7.0;所述预分离包括透析;所述透析用透析袋的截留分子量为3500da;所述透析的时间为50~56h。优选的,所述蛋白质非标记相对定量分析包括tca/丙酮沉淀和sdt裂解法、sds-page凝胶电泳、fasp酶解、高效液相色谱和q-exactive质谱仪的质谱分析,质谱分析原始数据并采用maxquant软件进行查库鉴定和定量分析。本发明提供的一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法,首先通过发芽技术提高辣木籽的蛋白酶种类和含量;然后根据辣木籽蛋白质组学解析,得到上调表达且具有水解活性的蛋白酶的信息,从而指导后续分离。本发明提供的提取方法不仅能够提取得到多种具有水解活性的蛋白酶,并且提取得到的蛋白酶具有含量高、酶活性强的特点。实验表明:提取得到的8种辣木籽蛋白酶相比干辣木籽中提取的蛋白酶含量相应提高了10%~21%,筛选出其中2种蛋白酶相比干辣木籽中的蛋白酶相应水解活力提高了8.0%~9.9%。同时本发明提供的方法,采用蛋白质组学分析和提取手段相结合,避免了传统分离方法的盲目性、繁琐性和工作量大的问题,使提取方法更加简便快捷和高效。采用本发明的方法提取的2种蛋白酶不仅具有较高的水解酶活性还同时兼具凝乳活力,实验证明:采用本发明提供的方法提取的2种酶比干辣木籽中提取的蛋白酶在凝乳活力方面提高了8.3%~9.1%。因此,采用所述方法分离提取到的辣木籽蛋白酶都具有较好的蛋白水解活力、凝乳活力,有利于扩大规模进行批量生产,有望实现后续辣木籽蛋白酶的工业化应用。附图说明图1为本发明中鉴定辣木籽蛋白质相对分子质量分布图;图2为本发明中干辣木籽组内三次重复鉴定到的蛋白质venn图;图3为本发明中发芽辣木籽组内三次重复鉴定到的蛋白质venn图;图4为本发明中发芽辣木籽和干辣木籽样本组鉴定到的蛋白质venn图;图5为本发明中发芽辣木籽和干辣木籽火山图示例。具体实施方式本发明提供的一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法,包括以下步骤:1)从发芽辣木籽和干辣木籽中分别进行蛋白质非标记相对定量分析,筛选干辣木籽总蛋白和发芽辣木籽总蛋白之间的差异蛋白;发芽辣木籽的芽长为10~15cm,发芽辣木籽的质量为12.57~13.09g/15粒;干辣木籽的质量为4.31-4.53g/15粒;2)统计步骤1)所述差异蛋白中上调表达的蛋白质,将得到的上调表达的蛋白质进行go功能注释,得到具有水解活性的蛋白酶;3)采用盐法提取发芽辣木籽蛋白酶,得到辣木籽蛋白酶盐提液;4)根据步骤2)中筛选得到具有水解活性的蛋白酶的pi值,调整步骤4)中辣木籽蛋白酶盐提液的ph值至所述pi值,收集蛋白酶沉淀,复溶,脱盐,得到辣木籽蛋白酶粗提液;5)根据步骤2)中筛选得到具有水解活性的蛋白酶的分子量,选择超滤膜对所述辣木籽蛋白酶粗提液中的蛋白进行超滤截留,收集目标分子量的蛋白酶,得到具有水解活性蛋白酶。本发明从发芽辣木籽和干辣木籽中分别进行蛋白质非标记相对定量分析,筛选干辣木籽总蛋白和发芽辣木籽总蛋白之间的差异蛋白;发芽辣木籽的芽长为10~15cm,发芽辣木籽的质量为12.57~13.09g/15粒;干辣木籽的质量为4.31-4.53g/15粒。在本发明中,所述发芽辣木籽的培养方法优选将辣木籽用4~10℃水浸润,再在20~25℃的水中浸泡24~26h,得到的浸泡辣木籽在恒温恒湿的环境中培养。所述培养第1~3天,培养温度优选为25~30℃,更优选为28℃。培养的湿度优选为70%~75%,更优选为73%。所述培养第4~6天,培养温度优选为22~25℃,更优选为23℃。所述培养湿度优选为60%~65%,更优选为63%。发芽辣木籽的芽长优选为12~14cm,更优选为13cm。发芽辣木籽的质量优选为12.57~13.09g/15粒;干辣木籽的质量优选为4.48g/15粒。采用发芽辣木籽作为原料提取,有利于提高辣木籽的蛋白酶种类、含量和酶活性。在本发明中,所述蛋白质非标记相对定量分析优选包括tca/丙酮沉淀和sdt裂解法、sds-page凝胶电泳、fasp酶解、高效液相色谱和q-exactive质谱仪的质谱分析,质谱分析原始数据并采用maxquant软件进行查库鉴定和定量分析。蛋白质非标记相对定量分析的具体步骤见如下参考文献:[1]cox,j.andm.mann(2008)."maxquantenableshighpeptideidentificationrates,individualizedp.p.b.-rangemassaccuraciesandproteome-wideproteinquantification."natbiotechnol26(12):1367-1372.[2]cox,j.,m.y.hein,etal.(2014)."accurateproteome-widelabel-freequantificationbydelayednormalizationandmaximalpeptideratioextraction,termedmaxlfq."molcellproteomics13(9):2513-2526.[3]cox,j.,n.neuhauser,etal.(2011)."andromeda:apeptidesearchengineintegratedintothemaxquantenvironment."jproteomeres10(4):1794-1805.得到差异蛋白,本发明统计所述差异蛋白中上调表达的蛋白质,将得到的上调表达的蛋白质进行go功能注释,得到具有水解活性的蛋白酶。在本发明中,所述差异蛋白的数量为43个,其中上调表达的差异蛋白质的数量为26个。本发明对所述go功能注释的方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的go功能注释方案即可。在本发明中,具有水解活性的蛋白酶优选包括8种蛋白酶;8种蛋白酶的氨基酸序列分别为序列表中seqidno.1~8所示;所述seqidno.1所示的蛋白酶的pi为10.10;所述seqidno.1所示的蛋白酶的分子量为11789.27;经检索seqidno.1所示的蛋白酶的名称为chitin-bindingprotein2。所述seqidno.2所示的蛋白酶的pi为7.55;所述seqidno.2所示的蛋白酶的分子量为18459.82;经检索seqidno.2所示的蛋白酶的名称为2salbumin。所述seqidno.3所示的蛋白酶的pi为7.15;所述seqidno.3所示的蛋白酶的分子量为18811.2;经检索seqidno.3所示的蛋白酶的名称为2salbumin所述seqidno.4所示的蛋白酶的pi为6.23;所述seqidno.4所示的蛋白酶的分子量为52880.49;经检索seqidno.4所示的蛋白酶的名称为ribulosebisphosphatecarboxylaselargechain(rbcl)。所述seqidno.5所示的蛋白酶的pi为10.63;所述seqidno.5所示的蛋白酶的分子量为6802.67;经检索seqidno.5所示的蛋白酶的名称为2.1protein。所述seqidno.6所示的蛋白酶的pi为5.24;所述seqidno.6所示的蛋白酶的分子量为31591.8;经检索seqidno.6所示的蛋白酶的名称为actin。所述seqidno.7所示的蛋白酶的pi为10.36;所述seqidno.7所示的蛋白酶的分子量为9427.98;经检索seqidno.7所示的蛋白酶的名称为photosystemip700apoproteina1。所述seqidno.8所示的蛋白酶的pi为7.75;所述seqidno.8所示的蛋白酶的分子量为18756.12。经检索seqidno.8所示的蛋白酶的名称为2salbumin。本发明采用盐法提取发芽辣木籽蛋白酶,得到辣木籽蛋白酶盐提液。在本发明中,所述盐法提取发芽辣木籽蛋白酶的方法优选包括所述发芽辣木籽粉碎,过筛,得到的筛下物和氯化钠溶液混合,提取,固液分离,得到辣木籽蛋白酶盐提液。所述过筛的筛孔优选不小于60目。所述筛下物的质量和氯化钠溶液的体积优选为1g:5ml;所述氯化钠溶液的浓度优选为0.25~0.30mol/l。提取的温度优选为30℃;提取的时间优选为0.5~1h;提取时料液的ph值优选为7.15。得到辣木籽蛋白酶盐提液后,本发明根据筛选得到具有水解活性的蛋白酶的pi值,调整步骤4)中辣木籽蛋白酶盐提液的ph值至所述pi值,收集蛋白酶沉淀,复溶,脱盐,得到辣木籽蛋白酶粗提液。在本发明中,所述调整辣木籽蛋白酶盐提液的ph值的方法优选用0.1mol/l的氢氧化钠溶液和0.1mol/l的氯化氢溶液以0.5~1.0ml/s的速度滴入辣木籽蛋白酶盐提液中,使盐提液的ph值分别达到上述蛋白质组学技术筛选得到的8种蛋白酶的pi。在本发明中,收集蛋白酶沉淀的方法优选包括离心;所述离心的转速优选为4500~5000r/min;所述离心的时间优选为20~30min。离心后收集沉淀。在本发明中,复溶的方法优选为将收集的蛋白酶沉淀和水混合,得到的混合液进行超声溶解得到蛋白酶溶液。所述蛋白酶沉淀的质量和水的体积比优选为5g:5~10ml。所述超声的功率优选为200hz;所述超声的时间优选为2~5min。在本发明中,所述脱盐前还优选依次包括对所述蛋白酶溶液调整ph值和预分离。蛋白酶溶液的ph值优选调整至7.0。所述预分离优选包括透析;所述透析用透析袋的截留分子量优选为3500da;所述透析的时间优选为50~56h。本发明根据筛选得到具有水解活性的蛋白酶的分子量,选择超滤膜对所述辣木籽蛋白酶粗提液中的蛋白进行超滤截留,收集目标分子量的蛋白酶,得到具有水解活性蛋白酶。在本发明中,还优选包括超滤截留得到的下层截留液置于-80℃速冻5h后放入真空低温冷冻干燥机冻干处理48h,得到蛋白酶粉末。本发明提取得到的蛋白酶具有较高的含量和生物活性,其中,seqidno.6所示的蛋白酶的actin和seqidno.4所示的ribulosebisphosphatecarboxylaselargechain(rbcl)具有水解酶活性和凝乳活性,应用于奶酪、啤酒、饮料食品的加工。下面结合实施例对本发明提供的一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1100g干辣木籽的发芽及特定蛋白酶的分离1)干辣木籽温水浸泡:将100g干辣木籽先用冷水喷洒湿润,再将其放入25℃温水中浸泡24h,浸泡过程需用滤网覆盖,保证辣木籽完全浸入温水中;2)辣木籽发芽:将浸泡好的辣木籽放入铺有3层经水润湿滤纸的育苗盘中每两颗辣木籽间隔1cm,然后将育苗盘放入人工气候箱中,发芽1~3天期间箱内温度控制在25℃、湿度控制在70%,发芽4~6天期间箱内温度控制在22℃、湿度控制在60%;3)干辣木籽与发芽辣木籽的蛋白质组学解析:发芽第6天的辣木籽,选取芽长10cm、质量12.57g/15粒的发芽辣木籽以及质量4.31g/15粒的干辣木籽分别进行蛋白质label-free相对定量分析,通过tca/丙酮沉淀和sdt裂解法、sds-page凝胶电泳、fasp酶解、高效液相色谱和q-exactive质谱仪的质谱分析,质谱分析原始数据并采用maxquant软件进行查库鉴定及定量分析(图1),比较分析干辣木籽(图2中a-1)与发芽辣木籽(图3中b-1)出现43种差异蛋白,其中发芽辣木籽出现26种蛋白含量的上调,go功能注释筛选出8种上调蛋白质是具有水解活性的蛋白酶,uniprot数据库显示该8种蛋白酶的分子量范围和等电点pi范围见表1。表18种蛋白酶信息一览表序列编号蛋白酶名称分子量(kda)等电点seqidno.1chitin-bindingprotein211789.2710.10seqidno.22salbumin18459.827.55seqidno.32salbumin18811.27.15seqidno.4ribulosebisphosphatecarboxylaselargechain52880.496.23seqidno.52.1protein6802.6710.63seqidno.6actin31591.85.24seqidno.7photosystemip700apoproteina19427.9810.36seqidno.82salbumin18756.127.754)干辣木籽与发芽辣木籽蛋白酶的盐法提取:干辣木籽与发芽辣木籽用高速粉碎机打碎2min,过60目筛除去大部分辣木籽壳,分别按照干辣木籽筛下物和氯化钠溶液按照1:10(g/ml)的比例混合,发芽辣木籽筛下物和氯化钠溶液按照1:5g/ml的质量体积比混合,在提取温度30℃、ph7.15、提取时间1.0h的条件下得到辣木籽提取液,提取液放入抽滤杯中用2层中速定性滤纸进行处理得到辣木籽蛋白酶盐提液;5)干辣木籽与发芽辣木籽中特定蛋白酶的分离:分别用0.1mol/l的氢氧化钠溶液和0.1mol/l的氯化氢溶液以0.5ml/s的速度滴入辣木籽蛋白酶盐提液中,使盐提液的ph值分别达到上述蛋白质组学技术筛选得到的8种蛋白酶的pi5.24~10.63,依次以4500r/min离心20min后获得蛋白质沉淀,不同蛋白酶pi下得到的蛋白质沉淀用5ml的去离子水进行超声溶解2min使沉淀完全溶解,再用0.1mol/l的氢氧化钠溶液或0.1mol/l的氯化氢溶液滴入使各蛋白质溶液ph值调为7.0,各蛋白质溶液接着分别放入截留分子量3500da的透析袋透析50h进行脱盐处理,然后各透析液选用截留分子量6kda-60kda的不同超滤膜进行超滤截留,下层截留液置于-80℃速冻5h后放入真空低温冷冻干燥机冻干处理48h,得到发芽辣木籽8种蛋白酶含量和干辣木籽8种蛋白酶含量。结果见表2。表2发芽辣木籽8种蛋白酶含量和干辣木籽8种蛋白酶含量(mg)序列表编号发芽辣木籽蛋白酶含量干辣木籽蛋白酶含量seqidno.1568501seqidno.2578511seqidno.3608523seqidno.4830703seqidno.5523475seqidno.6659556seqidno.7544489seqidno.8604513得到发芽辣木籽8种蛋白酶含量分相比干辣木籽相应提高了10.0%(seqidno.5)、11.2%(seqidno.7)、13.4%(seqidno.1)、15.3%(seqidno.2)、16.2%(seqidno.3)、17.7%(seqidno.8)、18.1%(seqidno.4)、18.5%(seqidno.6);6)干辣木籽与发芽辣木籽特定蛋白酶的水解活性分析:将上述得到的8种辣木籽蛋白酶冻干粉用去离子水配制成质量浓度为10mg/l的溶液分别进行凝乳活力和蛋白质分解活力测定,首先称取3g脱脂奶粉加入到30ml蒸馏水制成质量体积比1:10g/ml的复溶乳,加热至沸腾后静置冷却5min后放入60℃恒温水浴锅中,待复溶乳中心温度达到60℃,加入10ml酶液,充分混均后继续水浴,准确记录从酶液加入到乳蛋白完全凝固的时间(t)计算凝乳活力=(3*2400)/(t*10)su/mg,其次取2ml、1.5%酪蛋白溶液在60℃保温5min,加入1ml预热的待测酶液,混匀反应30min,加入4ml、8%三氯乙酸终止反应,过滤后测定滤液在280nm的吸光度(a280),以先将预热的酶液同三氯乙酸混合使酶液失活后加入2ml酪蛋白溶液在60℃保温5min、过滤后测定滤液在280nm的吸光度(a′280)为空白对照,计算1ml酶液的蛋白分解活力=(a280-a′280)/1,通过凝乳活力和蛋白分解活力测定筛选出2种蛋白酶,分别为seqidno.6和seqidno.4所示的蛋白酶。结果见表3。表32种蛋白酶的凝乳活力和蛋白分解活力序列编号凝乳活力(su/mg)水解活力seqidno.612.45168seqidno.415.87199发芽辣木籽2种蛋白酶相比干辣木籽相应水解活力提高了7.6%(seqidno.6)、9.5%(seqidno.4),凝乳活力提高了7.3%(seqidno.6)、8.1%(seqidno.4)。实施例2500g干辣木籽的发芽及特定蛋白酶的分离实施过程基本同实施例1,仅以下几点不同:1)干辣木籽温水浸泡:将500g干辣木籽先用冷水喷洒湿润,再将其放入22℃温水中浸泡24h;2)辣木籽发芽:将浸泡好的辣木籽放入铺有3层经水润湿滤纸的育苗盘中每两颗辣木籽间隔1.2cm,然后将育苗盘放入人工气候箱中,发芽1-3天期间箱内温度控制在28℃、湿度控制在72%,发芽4~6天期间箱内温度控制在23℃、湿度控制在63%;3)干辣木籽与发芽辣木籽的蛋白质组学解析:发芽第6天的辣木籽,选取芽长12cm、质量12.76g/15粒的发芽辣木籽以及质量4.41g/15粒的干辣木籽分别进行蛋白质label-free相对定量分析,搜库结果见图2中a-2和图3中b-2;4)干辣木籽与发芽辣木籽蛋白酶的盐法提取:干辣木籽与发芽辣木籽用高速粉碎机打碎3min,过60目筛除去大部分辣木籽壳,分别按照1:10和1:5g/ml的质量体积比加入0.25mol/l的氯化钠溶液,在提取温度30℃、ph7.15、提取时间1.2h的条件下得到辣木籽提取液;5)干辣木籽与发芽辣木籽中特定蛋白酶的分离:分别用0.1mol/l的氢氧化钠溶液和0.1mol/l的氯化氢溶液以0.8ml/s的速度滴入辣木籽蛋白酶盐提液中,使盐提液的ph值分别达到上述蛋白质组学技术筛选得到的8种蛋白酶的pi5.24~10.63,依次以4800r/min离心25min后获得蛋白质沉淀,不同蛋白酶pi下得到的蛋白质沉淀用8ml的去离子水进行超声溶解3min使沉淀完全溶解,再用0.1mol/l的氢氧化钠溶液或0.1mol/l的氯化氢溶液滴入使各蛋白质溶液ph值调为7.0,各蛋白质溶液接着分别放入截留分子量3500da的透析袋透析52h进行脱盐处理,然后各透析液选用截留分子量6kda~60kda的不同超滤膜进行超滤截留,下层截留液置于-80℃速冻5.5h后放入真空低温冷冻干燥机冻干处理60h,得到发芽辣木籽8种蛋白酶含量和干辣木籽8种蛋白酶含量。结果见表4。表4发芽辣木籽8种蛋白酶含量和干辣木籽8种蛋白酶含量(mg)序列表编号发芽辣木籽蛋白酶含量干辣木籽蛋白酶含量seqidno.128392497seqidno.229582561seqidno.330482625seqidno.441833536seqidno.526502381seqidno.633492803seqidno.727212443seqidno.829982554由表4可知,发芽辣木籽8种蛋白酶含量相比干辣木籽相应提高了11.3%(seqidno.5)、11.4%(seqidno.7)、13.7%(seqidno.1)、15.5%(seqidno.2)、16.1%(seqidno.3)、17.4%(seqidno.8)、18.3%(seqidno.4)、19.5%(seqidno.6)。6)干辣木籽与发芽辣木籽特定蛋白酶的水解活性分析:通过凝乳活力和蛋白分解活力测定筛选出2种蛋白酶,分别为seqidno.6和seqidno.4所示的蛋白酶。采用实施例1中的酶活性分析方法,得到蛋白酶的水解活力和凝乳活力,结果见表5。表52种蛋白酶的凝乳活力和蛋白分解活力序列编号凝乳活力(su/mg)水解活力seqidno.612.38171seqidno.415.79195由表5可知,发芽辣木籽2种蛋白酶相比干辣木籽相应水解活力提高了8.0%(seqidno.6)、9.9%(seqidno.4),凝乳活力提高了8.3%(seqidno.6)、9.1%(seqidno.4)。实施例31000g干辣木籽的发芽及特定蛋白酶的分离实施过程基本同实施例1,仅以下几点不同:1)干辣木籽温水浸泡:将1000g干辣木籽先用冷水喷洒湿润,再将其放入20℃温水中浸泡24h;2)辣木籽发芽:将浸泡好的辣木籽放入铺有3层经水润湿滤纸的育苗盘中每两颗辣木籽间隔1.5cm,然后将育苗盘放入人工气候箱中,发芽1~3天期间箱内温度控制在30℃、湿度控制在75%,发芽4~6天期间箱内温度控制在23℃、湿度控制在65%;3)干辣木籽与发芽辣木籽的蛋白质组学解析:发芽第6天的辣木籽,选取芽长15cm、质量13.09g/15粒的发芽辣木籽以及质量4.53g/15粒的干辣木籽分别进行蛋白质label-free相对定量分析,搜库结果见图2中a-3和图3中b-3;4)干辣木籽与发芽辣木籽蛋白酶的盐法提取:干辣木籽与发芽辣木籽用高速粉碎机打碎5min,过60目筛除去大部分辣木籽壳,分别按照1:10和1:5g/ml的质量体积比加入0.30mol/l的氯化钠溶液,在提取温度30℃、ph7.15、提取时间1.5h的条件下得到辣木籽提取液;5)干辣木籽与发芽辣木籽中特定蛋白酶的分离:分别用0.1mol/l的氢氧化钠溶液和0.1mol/l的氯化氢溶液以1.0ml/s的速度滴入辣木籽蛋白酶盐提液中,使盐提液的ph值分别达到上述蛋白质组学技术筛选得到的8种蛋白酶的pi5.24~10.63,依次以5000r/min离心30min后获得蛋白质沉淀,不同蛋白酶pi下得到的蛋白质沉淀用10ml的去离子水进行超声溶解3min使沉淀完全溶解,再用0.1mol/l的氢氧化钠溶液或0.1mol/l的氯化氢溶液滴入使各蛋白质溶液ph值调为7.0,各蛋白质溶液接着分别放入截留分子量3500da的透析袋透析56h进行脱盐处理,然后各透析液选用截留分子量6kda~60kda的不同超滤膜进行超滤截留,下层截留液置于-80℃速冻6h后放入真空低温冷冻干燥机冻干处理72h,得到发芽辣木籽8种蛋白酶含量和干辣木籽8种蛋白酶含量。结果见表6。表6发芽辣木籽8种蛋白酶含量和干辣木籽8种蛋白酶含量(mg)序列表编号发芽辣木籽蛋白酶含量干辣木籽蛋白酶含量seqidno.156635003seqidno.259095112seqidno.360455198seqidno.485037127seqidno.553874801seqidno.667895611seqidno.754154788seqidno.860625142由表6可知,发芽辣木籽8种蛋白酶含量相比干辣木籽相应提高了12.2%(seqidno.5)、13.1%(seqidno.7)、13.2%(seqidno.1)、15.6%(seqidno.2)、16.3%(seqidno.3)、17.9%(seqidno.8)、19.3%(seqidno.4)、21.0%(seqidno.6)。6)干辣木籽与发芽辣木籽特定蛋白酶的水解活性分析:通过凝乳活力和蛋白分解活力测定筛选出2种蛋白酶,分别为seqidno.6和seqidno.4所示的蛋白酶。采用实施例1中的酶活性分析方法,得到蛋白酶的水解活力和凝乳活力,结果见表7。表72种蛋白酶的凝乳活力和蛋白分解活力序列编号凝乳活力(su/mg)水解活力seqidno.612.41165seqidno.415.84203由表7可知,发芽辣木籽2种蛋白酶相比干辣木籽相应水解活力提高了8.2%(seqidno.6)、10.1%(seqidno.4),凝乳活力提高了8.5%(seqidno.6)、9.7%(seqidno.4)。实施例4将实施例1~3中发芽辣木籽组提取的蛋白质和干辣木籽提取的蛋白质做比对,绘制venn图(图4,其中a表示发芽辣木籽种子组提取的蛋白质,b表示干辣木籽提取的蛋白质)。由图4可知,两组共同表达的蛋白质有650个,发芽辣木籽组特有的蛋白质有119种,干辣木籽组特有的蛋白质有110种。采用发芽辣木籽和干辣木籽两组样本间的蛋白质表达差异倍数(foldchange)和t检验得到的p-value两个因素共同绘制火山图(图5),用于显示两组样本数据的显著性差异。横坐标表示差异倍数(以2为底的对数变换),纵坐标表示差异的显著性p-value(以10为底的对数变换)。由图5所示火山图形式展示适用于采用t检验算法获得的数据,说明两组样本间的蛋白质表达存在差异性。以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本
技术领域
的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>云南农业大学<120>一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>104<212>prt<213>moringaoleiferalam.<400>1glnproasppheglnargcysproserleuargcyscysglnglnleu151015argglnalavalglnleuthrhisglnglnglnglyglnvalglypro202530glnglnvalargglnglnpheglnthrhisglnargileproalaile354045cysasnleuglnprometargglnalavalglnleualahisglngln505560glnglnglyglnvalglyproglnglnvalargcyscysglnglnleu65707580argglnalavalglnserglnalaalaalaalaglyglnvalglypro859095glnglnvalglyhismettyrarg100<210>2<211>160<212>prt<213>moringaoleiferalam.<400>2metalalysphethrleuleuleualailephealaleupheleuile151015leualaasnalaasnvaltyrargthrthrvalgluleuaspgluglu202530proaspaspasnglnglnglyglnglnglnglnglncysargglngln354045pheleuthrhisglnargleuargalacysglnargpheileargarg505560glnthrglnglyglyglyalaleugluaspvalgluaspaspvalglu65707580gluileglugluvalvalgluproaspglnalaargargproalaile859095glnargcyscysglnglnleuargasnileglnproargcysargcys100105110proserleuargglnalavalglnleualahisglnglnglnglygln115120125valglyproglnglnvalargglnmettyrargleualaserasnile130135140proalailecysasnleuargprometsercyspropheglyglngln145150155160<210>3<211>163<212>prt<213>moringaoleiferalam.<400>3metalalysilethrleuleuleualathrpheglyleuleuleuleu151015leuthrasnalaseriletyrargthrthrvalgluleuaspgluglu202530alaaspgluasnglnglnglnargcysargglnglnpheglnthrhis354045glnargleuargalacysglnargpheileargargargthrglngly505560glyglyproleuaspgluvalgluaspgluvalaspgluilegluglu65707580valvalgluproaspglnglyproglyargglnproalapheglnarg859095cyscysglnglnleuargasnileserproprocysargcysproser100105110leuargglnalavalglnleuthrhisglnglnglnglyglnvalgly115120125proglnglnvalargglnmettyrargvalalaserasnileproser130135140metcysasnleuglnprometsercysleupheargglnglnglnser145150155160sertrpleu<210>4<211>477<212>prt<213>moringaoleiferalam.<400>4metserphearggluglyleumetserproglnthrgluthrlysala151015servalglyphelysalaglyvallysasptyrlysleuthrtyrtyr202530thrproasptyrgluthrlysaspthraspileleualaalaphearg354045valthrproglnproglyvalproprogluglualaglyalaalaval505560alaalagluserserthrglythrtrpthrthrvaltrpthraspgly65707580leuthrserleuaspargtyrlysglyargcystyrhisileglupro859095ilealaglyglugluasnglnpheilealatyrvalalatyrproleu100105110aspleupheglugluglyservalthrasnmetphethrserileval115120125glyasnvalpheglyphelysalaleuargalaleuargleugluasp130135140leuargileproproalatyrserlysthrpheglnglyproprohis145150155160glyileglnvalgluargasplysleuasnlystyrglyargproleu165170175leuglycysthrilelysprolysleuglyleuseralalysasntyr180185190glyargalavaltyrglucysleuargglyglyleuaspphethrlys195200205aspaspgluasnvalasnserglnprophemetargtrpargasparg210215220pheleuphecysalaglualailetyrlysalaglnalagluthrgly225230235240gluilelysglyhistyrleuasnalathralaglythrcysgluglu245250255metilelysargalavalphealaarggluleuglyalaproileile260265270methisasptyrleuthrglyglyphethralaasnthrserleuala275280285histyrcysargaspasnglyleuleuleuhisilehisargalamet290295300hisalavalileaspargglnlysasnhisglymethispheargval305310315320leualalysalaleuargleuserglyglyasphisilehisalagly325330335thrvalvalglylysleugluglygluarggluilethrleuglyphe340345350valaspleuleuargaspaspphevalglulysaspargserarggly355360365ilephephethrglnasptrpvalserleuproglyvalleuproval370375380alaserglyglyilehisvaltrphismetproalaleuthrgluile385390395400pheglyaspaspservalleuglnpheglyglyglythrleuglyhis405410415protrpglyasnalaproglyalavalalaasnargvalalaleuglu420425430alacysvalglnalaargasngluglyargaspleualaargglugly435440445asngluileileargglualaserlystrpserprogluleualaala450455460alacysgluvaltrplysgluilelysphegluphepro465470475<210>5<211>160<212>prt<213>moringaoleiferalam.<400>5metalalysphethrleuleuleualailephealaleupheleuile151015leualaasnalaasnvaltyrargthrthrvalgluleuaspgluglu202530proaspaspasnglnglnglyglnglnglnglnglncysargglngln354045pheleuthrhisglnargleuargalacysglnargpheileargarg505560glnthrglnglyglyglyalaleugluaspvalgluaspaspvalglu65707580gluileglugluvalvalgluproaspglnalaargargproalaile859095glnargcyscysglnglnleuargasnileglnproargcysargcys100105110proserleuargglnalavalglnleualahisglnglnglnglygln115120125valglyproglnglnvalargglnmettyrargleualaserasnile130135140proalailecysasnleuargprometsercyspropheglyglngln145150155160<210>6<211>283<212>prt<213>moringaoleiferalam.<400>6valpheproserilevalglyargproarghisthrglyvalmetval151015glymetglyglnlysaspalatyrvalglyaspglualaglnserlys202530argglyileleuthrleulystyrproilegluhisglyilevalser354045asntrpaspaspmetglulysiletrphishisthrphetyrasnglu505560leuargvalalaproglugluhisprovalleuleuthrglualapro65707580leuasnprolysalaasnargglulysmetthrglnilemetpheglu859095thrpheasnvalproalamettyrvalalaileglnalavalleuser100105110leutyralaserglyargthrthrglyilevalleuaspserglyasp115120125glyvalserhisthrvalproiletyrgluglytyralaleuprohis130135140alaileleuargleuaspleualaglyargaspleuthraspalaleu145150155160metlysileleuthrgluargglytyrmetphethrthrthralaglu165170175arggluilevalargaspmetlysglulysleualatyrvalalaleu180185190asptyrgluglngluleugluthralalysserserserservalglu195200205lysasntyrgluleuproaspglyglnvalilethrileglyalaglu210215220argpheargcysprogluvalleupheglnproserleuileg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