小花清风藤中七种黄酮类化学成分的提取分离方法与流程

本发明涉及小花清风藤中化学成分的提取分离方法，具体涉及小花清风藤中七种黄酮类化学成分的提取分离方法。

背景技术：

小花清风藤(sabiaparviflorawall.ex.roxb.)属于清风藤科(sabiaceae)清风藤属(sabia)植物，为贵州省2003年版《中药材、民族药材质量标准》收载品种。国内主要分布于贵州西南部、云南东南部至西南部、广西西部及西南部；在贵州西南地区，苗族、布依族用小花清风藤的茎藤治疗风湿关节痛，跌打损伤痛，以及肝炎等疾病。现代研究表明，小花清风藤含有黄酮类、生物碱类、三萜类、皂苷类等成分。其中黄酮类化合物具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、抑菌抗病毒等药理作用，而对该植物中的黄酮类化学成分研究鲜有报道，限制了对小花清风藤药材及其制剂的开发和质量控制。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种小花清风藤中七种黄酮类化学成分的分离提取方法。对小花清风藤地上部分提取物进行了化学成分研究，采用d-101大孔树脂层析柱、硅胶层析柱、ods-a-hg反相层析柱以及半制备型高效液相色谱等分离技术，从中分离得到7个黄酮类成分，分别鉴定为：槲皮素-3-o-龙胆双糖苷(ⅰ)，camellianoside(ⅱ)，芦丁(ⅲ)，tsubakiosidea(ⅳ)，山奈酚-3-o-芸香糖苷(ⅴ)，异鼠李素-3-o-芸香糖苷(ⅵ)，山奈酚(ⅶ)。分离得到的7个化合物中，有5个(ⅰ，ⅱ，ⅳ，ⅴ，ⅵ)是首次在小花清风藤(sabiaparviflora)中分离得到，也均是首次从清风藤属(sabia)植物中分离得到。有利于对小花清风藤药材及其制剂的开发和质量控制。

本发明采用如下技术方案实现：小花清风藤中七种黄酮类化学成分的分离提取方法，是采用多种色谱方法对小花清风藤的甲醇提取物进行脱色、分离纯化；应用tlc与hplc法跟踪监测，分离得到。

前述的小花清风藤中七种黄酮类化学成分的提取分离方法，具体包括以下步骤：

(1)将干燥的小花清风藤茎和叶粉碎成粗粉10.8kg；

(2)粗粉用甲醇回流提取3次，每次2h，合并滤液，减压浓缩致无醇味；

(3)将步骤(2)中浓缩后的滤液，加水溶解，上样于d-101大孔树脂，依次用25％、70％、100％甲醇溶液洗脱，浓缩，干燥，得浸膏，浸膏中包括25％甲醇洗脱部位0.75kg、70％甲醇洗脱部位1.67kg和100％甲醇洗脱部位1.17kg；

(4)取70％甲醇洗脱部位浸膏经硅胶色谱柱分离，二氯甲烷-甲醇(10:1)洗脱得2个组份，组份1-1和组份1-2；

(5)组份1-1过硅胶色谱柱，二氯甲烷-甲醇(20:1～4)梯度洗脱，再经过制备液相色谱，甲醇-水＝60:40洗脱，得化合物ⅴ46mg、ⅵ62mg和ⅶ41mg；

(6)组份1-2经ods-a-hg反相色谱柱，以甲醇-水(3:7)洗脱，得组分1-2-1和1-2-2；

(7)组份1-2-1经制备液相色谱，甲醇-水(60:40)洗脱，得化合物ⅲ137mg和ⅳ89mg；

(8)组份1-2-2经制备液相色谱，甲醇-水(50:50)洗脱，得化合物ⅰ59mg和ⅱ153mg。

前述的小花清风藤中七种黄酮类化学成分的分离提取方法中，所述的化合物ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ和ⅶ为黄酮类化合物。

申请人对本发明进行了大量的实验研究，部分如下：

实验例。

为了阐明小花清风藤的药效物质基础，发现结构新颖且具有生物活性的天然产物，发明人对小花清风藤地上部分提取物进行了化学成分研究，采用d-101大孔树脂层析柱、硅胶层析柱、ods-a-hg反相层析柱以及半制备型高效液相色谱等分离技术，从中分离得到7个黄酮类成分，分别鉴定为：槲皮素-3-o-龙胆双糖苷(ⅰ)，camellianoside(ⅱ)，芦丁(ⅲ)，tsubakiosidea(ⅳ)，山奈酚-3-o-芸香糖苷(ⅴ)，异鼠李素-3-o-芸香糖苷(ⅵ)，山奈酚(ⅶ)。分离得到的7个化合物中，有5个(ⅰ，ⅱ，ⅳ，ⅴ，ⅵ)是首次在小花清风藤(sabiaparviflora)中分离得到，也均是首次从清风藤属(sabia)植物中分离得到，化合物ⅰ-ⅶ的结构见图1，各化合物的紫外吸收光谱图见图2。

1仪器与材料

brukeravanceneo600mhz核磁共振波谱仪(瑞士bruker公司)；超高压液相色谱三重四级杆串联质谱仪(美国waters公司)；theromultimate-3000型高效液相色谱仪(美国thermofisher公司)；分析和半制备型高效液相色谱仪为agilent1100型(美国agilent公司)；re-5210型旋转蒸发仪(上海亚荣生化有限公司)；buchir-215型旋转蒸发仪(瑞士buchi有限公司)；ag135电子分析天平(瑞士mettler-toledo公司)；gel-ods-a-hg(50μm，12nm)；d-101大孔树脂；薄层层析硅胶h；柱层析用硅胶(200～300目)等；其他试剂均为分析纯。实验药材于2017年6月采自贵州省镇宁县，原植物经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为清风藤科清风藤属植物小花清风藤sabiaparviflorawall.ex.roxb.，植物凭证标本(p-201708001)保存于贵州中医药大学生药实验室。

2提取与分离

将自然干燥的小花清风藤茎和叶(11.22kg)经粉碎机粉碎，得粗粉(10.8kg)，用甲醇回流提取3次(2h/次)，合并滤液，减压浓缩致无醇味，加水溶解，上样于d-101大孔树脂，依次用25％、70％、100％甲醇溶液洗脱，浓缩，干燥，得浸膏(25％甲醇洗脱部位0.75kg、70％甲醇洗脱部位1.67kg和100％甲醇洗脱部位1.17kg)。取适量70％甲醇洗脱部位浸膏经硅胶色谱柱分离，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得2个组份fr.1-1～1-2。fr.1-1过硅胶色谱柱，二氯甲烷-甲醇(20:1～4)梯度洗脱，再经过制备液相色谱，以流动相为甲醇-水(60:40)洗脱，得化合物ⅴ(46mg)、ⅵ(62mg)和ⅶ(41mg)；fr.1-2经ods-a-hg反相色谱柱，甲醇-水(3:7)洗脱得组分fr.1-2-1和fr.1-2-2。fr.1-2-1经制备液相色谱，以流动相为甲醇-水(60:40)洗脱，得化合物ⅲ(137mg)和ⅳ(89mg)，fr.1-2-2经制备液相色谱，以流动相为甲醇-水(50:50)洗脱，得化合物ⅰ(59mg)和ⅱ(153mg)。

3结构鉴定

化合物ⅰ：黄色粉末，盐酸镁粉反应阳性，molish反应阳性；esi-msm/z：649[m+na]⁺、625[m-h]^－，uvmax(λnm)：256nm(带ⅱ)，355nm(带ⅰ)。结合nmr数据，确定其相对分子量为626，分子式为c27h30o17。¹h-nmr(600mhz，dmso-d6)δ:7.57(1h，d，j＝2.0hz，h-2′)，7.56(1h，dd，j＝8.8，2.0hz，h-6′)，6.84(1h，d，j＝8.8hz，h-5′)，6.37(1h，d，j＝2.1hz，h-8)，6.17(1h，d，j＝2.0hz，h-6)，5.40(¹h，d，j＝7.2hz，h-1″)，4.06(¹h，d，j＝7.8hz，glu-h-1)；¹³c-nmr(151mhz，dmso-d6)δ：156.4(c-2)，133.3(c-3)，177.3(c-4)，161.2(c-5)，98.8(c-6)，164.5(c-7)，93.7(c-8)，156.3(c-9)，104.0(c-10)，121.1(c-1′)，115.3(c-2′)，144.8(c-3′)，148.6(c-4′)，116.2(c-5′)，121.7(c-6′)，100.9(c-1″)，73.4(c-2″)，76.5(c-3″)，69.8(c-4″)，76.4(c-5″)，68.1(c-6″)，103.1(gluc-1)，74.0(gluc-2)，76.5(gluc-3')，69.7(gluc-4)，76.4(gluc-5)，60.7(glu5-me)。上述数据与文献(曲功霖,张海鸣,邓志威,等.胭脂花化学成分的研究ⅲ[j].中国中药杂志,2011,46(2):93-97.和jun-xiliu,duo-longdi,yan-pingshi.diversityofchemicalconstituentsfromsaxifragamontanah.journalofthechemicalsociety[j].journalofthechemicalsociety,2008,55,863-870.)报道基本一致，故鉴定化合物ⅰ为槲皮素-3-o-龙胆双糖苷，其碳谱、氢谱图见附图3～4。

化合物ⅱ：黄色粉末，盐酸镁粉反应阳性，molish反应阳性；esi-msm/z：765[m+na]⁺、741[m-h]^－，uvmax(λnm)：256nm(带ⅱ)，355nm(带ⅰ)；结合nmr数据，确定其相对分子量为742，分子式为c32h37o20。¹h-nmr(600mhz，methanol-d4)δ：7.70(1h，d，j＝2.0hz,h-2′)，6.87(1h，d，j＝8.5hz,h-5′)，7.62(1h，dd，j＝12.0,2hz,h-6′)，6.36(1h，d，j＝2.0hz,h-8)，6.18(1h，d，j＝2.0hz,h-6)，4.55(1h,d,j＝1.0hz,rhah-1)，4.38(1h,d,j＝7.5hz，xylh-1)，1.13(3h,d,j＝5.9hz，rha5-me)；¹³c-nmr(151mhz，methanol-d4)δ:159.2(c-2)，135.5(c-3)，179.1(c-4)，162.7(c-5)，100.3(c-6)，166.6(c-7)，95.2(c-8)，158.5(c-9)，105.3(c-10)，123.1(c-1′)，117.8(c-2′)，145.7(c-3′)，149.7(c-4′)，116.1(c-5′)，123.5(c-6′)，104.7(c-1″)，75.7(c-2″)，78.1(c-3″)，71.6(c-4″)，77.1(c-5″)，68.9(c-6″)，102.3(rhac-1)，71.5(rhac-2)，82.4(rhac-3)，72.7(rhac-4)，69.4(rhac-5)，17.9(rha5-me)，106.4(xylc-1)，75.2(xylc-2)，77.5(xylc-3)，71.0(xylc-4)，66.8(xylc-5)。上述数据与文献(ken-ichionodera,kaoruhanashiro,takeshiyasumoto.camellianoside,anovelantioxidantglycosidefromtheleavesofcamelliajaponica[j].bioscibiotechbiochem,2006,70(8):1995-1998.)报道基本一致，故鉴定化合物ⅱ为camellianoside，其碳谱、氢谱图见附图5～6。

化合物ⅲ：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，molish反应阳性；esi-msm/z：633[m+na]⁺、609[m-h]^－，uvmax(λnm)：256nm(带ⅱ)，355nm(带ⅰ)；结合nmr数据，确定其相对分子量为610，分子式为c27h30o16。¹h-nmr(600mhz，methanol-d4)δ：7.62(1h，d，j＝8.5hz，h-6′)，6.87(1h，d，j＝8.5hz，h-5′)，6.35(1h，s，h-8)，6.17(1h，s，h-6)，5.11(1h，d，j＝7.4hz，h-1″)，4.55(1h，rhah-1)，1.14(3h，d，j＝6.3hz，rha5-me)；¹³c-nmr(151mhz，methanol-d4)δ:158.3(c-2)，135.6(c-3)，179.2(c-4)，162.7(c-5)，99.9(c-6)，165.8(c-7)，94.9(c-8)，159.2(c-9)，105.5(c-10)，123.6(c-1′)，117.7(c-2′)，145.6(c-3′)，149.7(c-4′)，116.0(c-5′)，123.1(c-6′)，104.7(c-1″)，73.9(c-2″)，78.1(c-3″)，69.6(c-4″)，77.1(c-5″)，68.5(c-6″)，102.3(rhac-1)，72.2(rhac-2)，72.0(rhac-3)，75.7(rhac-4)，71.3(rhac-5)，17.9(rha5-me)。上述数据与文献(周英,杨峻山,王立为,等.铁箍散化学成分的研究ⅰ[j].中国药学杂志,2002,37(4):260-261)报道基本一致，故鉴定化合物ⅲ为芦丁，其碳谱、氢谱图见附图7～8。

化合物ⅳ：棕色结晶，盐酸-镁粉反应呈阳性，molish反应阳性；esi-msm/z：749[m+na]⁺、725[m-h]^－，uvmax(λnm)：265nm(带ⅱ)，346nm(带ⅰ)；结合nmr数据，确定其相对分子量为726，分子式为c32h37o19，¹h-nmr(600mhz，methanol-d4)δ:8.07(1h，s，h-6′)，8.04(1h，s，h-2′)，6.89(1h，d，j＝2.0hz，h-3′)，6.89(1h，d，j＝2.0hz，h-5′)，6.37(1h，d，j＝2.0hz，h-8)，6.19(1h，d，j＝2.0hz，h-6)，5.11(1h，d，j＝7.1hz，glch-1)，4.52(1h，d，j＝1.6hz，rhah-1)，4.34(1h，d，j＝7.4hz，xylh-1)，1.11(3h，d，j＝6.0hz，rha5-me)；¹³c-nmr(151mhz，methanol-d4)δ:159.4(c-2)，135.4(c-3)，179.2(c-4)，162.9(c-5)，100.1(c-6)，166.1(c-7)，95.1(c-8)，158.5(c-9)，105.6(c-10)，122.7(c-1′)，132.4(c-2′)，116.1(c-3′)，161.4(c-4′)，116.1(c-5′)，132.4(c-6′)，104.5(glcc-1)，75.7(glcc-2)，78.1(glcc-3)，71.7(glcc-4)，77.1(glcc-5)，69.0，(glc5-me)，102.2(rhac-1)，71.7(rhac-2)，82.4(rhac-3)，72.7(rhac-4)，69.5(rhac-5)17.9(rha5-me)，106.3(xylc-1)，75.3(xylc-2)，77.5(xylc-3)，71.0(xylc-4)，66.8(xylc-5)。上述数据与文献(naokosato,weili,masatotsubaki,etal.flavonoidglycosidesfromjapanesecamelliaoilcakesandtheirinhibitoryactivityagainstadvancedglycationend-productsformation[j].journaloffunctionalfoods,2017,35(2017):159-169.)报道基本一致，故鉴定化合物ⅳ为tsubakiosidea，其碳谱、氢谱图见附图9～10。

化合物ⅴ：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，molish反应阳性；esi-msm/z：617[m+na]⁺、593[m-h]^－，uvmax(λnm)：265nm(带ⅱ)，346nm(带ⅰ)；结合nmr数据，确定其相对分子量为594，分子式为c27h30o15。¹h-nmr(600mhz，dmso-d6)δ：12.56(1h,s,5-oh)10，10.85(1h,s,7-oh)，10.13(1h,s,4′-oh)，7.98(1h，m，h-2′，6′)，6.88(1h，m，h-3′，5′)，6.88(1h，d，j＝8.9hz，)，6.41(1h，d，j＝2.1hz，h-8)，6.20(1h，d，j＝2.1hz，h-6)，5.31(1h，d，j＝7.6hz，gluh-1)，4.,37(1h，d，j＝1.5hz，rhah-1)，0.98(3h，d，j＝6.2hz，rha5-ch3)；¹³c-nmr(151mhz，dmso-d6)δ：156.9(c-2)，133.3(c-3)，177.4(c-4)，161.2(c-5)，98.8(c-6)，164.1(c-7)，93.8(c-8)，156.5(c-9)，104.0(c-10)，120.9(c-1′)，130.9(c-2′)，115.1(c-3′)，159.9(c-4′)，115.1(c-5′)，130.9(c-6′)，101.4(gluc-1)，74.2(gluc-2)，75.8(gluc-3)，71.8(gluc-4)，76.4(gluc-5)，66.9(glu5-ch2)，100.8(rhac-1)，70.6(rhac-2)，70.4(rhac-3)，71.8(rhac-4)，68.3(rhac-5)，17.8(rha5-ch3)。上述数据与文献(王鸣,刘培,冯煦,等.北柴胡茎叶化学成分研究(ⅱ)[j].中药材,2009,32(3):367-369.)报道基本一致，故鉴定化合物ⅴ为山奈酚-3-o-芸香糖苷，其氢谱附图11～12。

化合物ⅵ：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，molish反应阳性；esi-msm/z：647[m+na]⁺、623[m-h]^－，uvmax(λnm)：257nm(带ⅱ)，357nm(带ⅰ)；结合nmr数据，确定其相对分子量为624，分子式为c28h32o16。¹h-nmr(600mhz，dmso-d6)δ：7.57(1h，d，j＝2.4hz，h-2′)，6.85(1h，d，j＝8.1hz，h-5′)，6.66(1h，d，j＝2.3hz，h-8)，6.35(1h，d，j＝2.3hz，h-6)，5.35(1h，d，j＝7.1hz，h-1″)，4.37(1h，d，j＝1.2hz，rhah-1)，3.85(3h，s，3′-och3)，0.97(3h，d，j＝6.2hz，rha5-me)；¹³c-nmr(151mhz，dmso-d6)δ：157.0(c-2)，133.6(c-3)，177.6(c-4)，160.9(c-5)，98.0(c-6)，165.2(c-7)，92.3(c-8)，156.5(c-9)，105.1(c-10)，121.2(c-1′)，115.3(c-2′)，144.9(c-3′)，148.6(c-4′)，116.5(c-5′)，121.8(c-6′)，101.2(c-1″)，74.1(c-2″)，76.1(c-3″)，70.2(c-4″)，76.5(c-5″)，67.1(c-6″)，100.8(rhac-1)，70.5(rhac-2)，70.7(rhac-3)，71.9(rhac-4)，68.3(rhac-5)，56.2(1′-ome)，17.83(rha5-me)。通过二维谱排除杂质峰后，以上数据与文献(沈涛茂,张晶,李广志,等.一点红地上部分的化学成分研究[j].中国中药杂志,2013,48(21):1815-1819.)报道一致，故鉴定化合物ⅵ为异鼠李素-3-o-芸香糖苷，其氢谱、碳谱、dept谱、cosy谱、hmqc谱、hmbc谱图见附图13～18。

化合物ⅶ：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，molish反应阳性；esi-msm/z：309[m+na]⁺、285[m-h]^－，uvmax(λnm)：266nm(带ⅱ)，366nm(带ⅰ)；结合nmr数据，确定其相对分子量为286，分子式为c15h10o6，¹h-nmr(600mhz，methanol-d4)δ:8.06(2h，dd，j＝3.6，9.9hz，h-2′，h-6′)，6.89(2h，dd，j＝3.6，9.9hz，h-3′，h-5′)，6.42(1h，d，j＝2.1hz，h-8)，6.18(1h，d，j＝2.0hz，h-6)；¹³c-nmr(151mhz，methanol-d4)δ:147.0(c-2)，137.1(c-3)，177.3(c-4)，160.5(c-5)，99.2(c-6)，163.8(c-7)，93.4(c-8)，156.2(c-9)，103.2(c-10)，121.7(c-1′)，130.0(c-2′)，116.3(c-3′)，169.5(c-4′)，116.3(c-5′)，130.0(c-6′)。以上数据与文献(梅文莉,瞿书华,陈昌祥,等.锡兰肉桂中的黄酮类化合物[j].云南植物研究,2001,23(3):394-396.)报道基本一致，故鉴定化合物ⅶ为山奈酚，其碳谱、氢谱图见附图19～20。

本发明为小花清风藤药材综合开发及天然植物药理活性研究提供了化学依据和物质参考。同时也为进一步开展小花清风藤药材的药效物质基础研究，以及完善2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载品种小花清风藤药材的质量标准奠定了物质基础。

与现有技术相比，本发明对小花清风藤地上部分提取物进行了化学成分研究，采用d-101大孔树脂层析柱、硅胶层析柱、ods-a-hg反相层析柱以及半制备型高效液相色谱等分离技术，从中分离得到7个黄酮类成分，分别鉴定为：槲皮素-3-o-龙胆双糖苷(ⅰ)，camellianoside(ⅱ)，芦丁(ⅲ)，tsubakiosidea(ⅳ)，山奈酚-3-o-芸香糖苷(ⅴ)，异鼠李素-3-o-芸香糖苷(ⅵ)，山奈酚(ⅶ)。分离得到的7个化合物中，有5个(ⅰ，ⅱ，ⅳ，ⅴ，ⅵ)是首次在小花清风藤(sabiaparviflora)中分离得到，也均是首次从清风藤属(sabia)植物中分离得到。有利于对小花清风藤药材及其制剂的开发和质量控制。同时本发明为小花清风藤药材综合开发及天然植物药理活性研究提供了化学依据和物质参考。同时也为进一步开展小花清风藤药材的药效物质基础研究，以及完善2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载品种小花清风藤药材的质量标准奠定了物质基础。

附图说明

图1是化合物ⅰ-ⅶ的结构图；

图2是化合物ⅰ-ⅶ的紫外吸收光谱图；

图3是化合物槲皮素-3-o-龙胆双糖苷的碳谱图；

图4是化合物槲皮素-3-o-龙胆双糖苷的氢谱图；

图5是化合物camellianoside的碳谱图；

图6是化合物camellianoside的氢谱谱图；

图7是化合物芦丁的碳谱图；

图8是化合物芦丁的氢谱图；

图9是化合物tsubakiosidea的碳谱图；

图10是化合物tsubakiosidea的氢谱图；

图11是化合物山奈酚-3-o-芸香糖苷的碳谱图；

图12是化合物山奈酚-3-o-芸香糖苷的氢谱图；

图13是化合物异鼠李素-3-o-芸香糖苷的氢谱图；

图14是化合物异鼠李素-3-o-芸香糖苷的碳谱图；

图15是化合物异鼠李素-3-o-芸香糖苷的dept谱图；

图16是化合物异鼠李素-3-o-芸香糖苷的¹h-¹hcosy谱图；

图17是化合物异鼠李素-3-o-芸香糖苷的hsqc谱图；

图18是化合物异鼠李素-3-o-芸香糖苷的hmbc谱图；

图19是化合物山奈酚的碳谱图；

图20是化合物山奈酚的氢碳图。

具体实施方式

实施例1。

将自然干燥的小花清风藤茎和叶(11.22kg)经粉碎机粉碎，得粗粉(10.8kg)，用甲醇回流提取3次(2h/次)，合并滤液，减压浓缩致无醇味，加水溶解，上样于d101大孔树脂，依次用25％、70％、100％甲醇溶液洗脱，浓缩，干燥，得浸膏(25％甲醇洗脱部位0.75kg、70％甲醇洗脱部位1.67kg和100％甲醇洗脱部位1.17kg)。取适量70％甲醇洗脱部位浸膏经硅胶色谱柱分离，二氯甲烷-甲醇洗脱得2个组份fr.1-1～1-2。fr.1-1过硅胶色谱柱，二氯甲烷-甲醇(20:1～4)洗脱，再经过制备液相色谱，以流动相为甲醇-水(60:40)洗脱，得化合物ⅴ(46mg)、ⅵ(62mg)和ⅶ(41mg)；fr.1-2经ods-a-hg反相色谱柱，甲醇-水(3:7)洗脱，得组分fr.1-2-1和fr.1-2-2。fr.1-2-1经制备液相色谱，以流动相为甲醇-水(60:40)洗脱，得化合物ⅲ(137mg)和ⅳ(89mg)，fr.1-2-2经制备液相色谱，以流动相为甲醇-水(50:50)洗脱，得化合物ⅰ(59mg)和ⅱ(153mg)。