羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用与流程

文档序号:17814252发布日期:2019-06-05 21:25来源:国知局
羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用与流程

本发明涉及一种永生化细胞系及其建立方法和应用,特别涉及一种羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和在增殖培养羊痘病毒中的应用。本发明属于细胞工程技术领域。



背景技术:

睾丸支持细胞(sertolicell,sc)是生精小管基膜上的上皮细胞,为生精细胞的分化、成熟提供支持、能量和营养,被称为生精细胞的“保姆细胞”。在精子的分化成熟过程中,支持细胞不但向生精上皮传递促性腺激素,控制生精细胞的有丝分裂、减数分裂及后续分化一系列动态过程,而且对精细胞具有支持、营养、吞噬、释放、分泌等多种功能。研究表明睾丸支持细胞能分泌雄激素结合蛋白(androgenbindingprotein,abp)、苗勒氏管抑制物质(mullerianinhibitingsubstance,mis)、抑制素(inhibin)、激活素(activin)、转化生长因子β(tgfβ)、胰岛素样生长因子1(igf1)、白介素1和6(il1,il6)、生精生长因子(spermatogenicgrowthfactor,sgf)、神经营养素3(neurotrophin3,nt3)、神经生长因子(nervegrowthfactor,ngf)、纤溶酶原激活等十多种营养和生长因子,以支持精原细胞的增殖和分化。

羊痘病毒(capripoxvirus,cpv)是最重要的动物痘病毒,在分类地位上属于痘病毒科(poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxrinae)中的羊痘病毒属(capripoxvirus)成员,包括山羊痘病毒(goatpoxvirus,gtpv)、绵羊痘病毒(sheeppoxvirus,sppv)和牛结节疹病毒(lumpyskindiseasevirus,lsdv)。羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、接触性传染病,被世界动物卫生组织(fao/oie)列为93种必须报告的动物疫病之一,我国将其列为一类传染病。其发病率可达75%以上,死亡率可达50%以上,羔羊死亡率可达100%,同时还可导致母羊流产。羊痘是古老的疾病之一,1879年hansen首次报道了挪威的山羊痘。后来,陆续在世界其他地区报道了该病。该病广泛分布于非洲、中东、印度次大陆、北欧、地中海各国及德国、澳大利亚、美国等,特别是非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。与我国接壤的周边国家,如印度、孟加拉、尼伯尔、巴基斯坦、俄罗斯、蒙古等不少国家均有本病的流行。近几年我国的江苏、广东、贵州、山东、浙江、广西、甘肃、黑龙江等地均有本病流行。该病的爆发和流行使家畜的生产力下降,活畜及畜产品贸易停滞,给养羊业的发展造成极大的经济损失。

对于病毒性传染病快速、有效的分离病原是诊断和疫病防控工作的关键。可以高效扩繁该病毒的细胞(系、株)是病毒诊断和后续研究最重要的工具之一。要预防羊痘在国内泛滥和流行,免疫接种羊痘疫苗是预防羊痘唯一行之有效的措施。羊痘病毒(gtpv、sppv)可在羊睾丸原代细胞、肾细胞、bhk21和vero细胞上生长,并产生细胞病变(cpe),但是病毒滴度较低,尤其传代细胞(如bhk21、vero细胞)制备的病毒液达不到制备疫苗所需的病毒滴度。在国内,羊痘弱毒苗都采用新生羊睾丸原代细胞生产,其制造工艺复杂、落后,繁殖羊痘弱毒抗原必须用新生羊睾丸原代细胞,但制备这种细胞程序复杂,生产成本过高,生产效率较低下,这就给疫苗厂规模化生产羊痘疫苗带来不便,企业也难以获得丰厚的利润。同时,每次繁殖羊痘弱毒抗原所用的新生羊睾丸品种不一,这就很难使所生产的弱毒疫苗的质量保持稳定,此外,新生羊睾丸还有携带其他病原的潜在危险。因此,研发一种适于羊痘病毒增殖的传代细胞系,对疫苗企业具有一定的现实意义。



技术实现要素:

为了解决现有技术中的不足,本发明提出了从羔羊睾丸原代细胞进行分离和纯化获得羔羊睾丸支持细胞(lsc),采用脂质体转染法,将编码htert和neo基因的真核表达质粒pci-neo-htert导入羔羊睾丸支持细胞(lsc),对lsc细胞进行永生化改造,获得羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系。

在本发明中,优选的,所述的羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系,命名为羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系htert-lsc,分类命名为羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系htert-lsc,该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心,地址在中国.武汉,其保藏编号为cctccno:c2018202,保藏时间为2018年10月12日。

本发明的一种羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系是通过以下步骤制备得到的:

(1)选健康母羊所生的健康公羔羊,屠宰后,无菌采集睾丸实质,利用胶原酶和胰酶混合酶(0.1wt%iv型胶原酶(gibco)、0.25wt%胰酶(gibco))消化法,制备羔羊睾丸原代细胞。采用6h差速贴壁,50mmol/ltris_hcl对培养的羔羊睾丸原代细胞进行低渗处理、38.5℃高温培养分离、纯化、鉴定获得纯度达到95%以上的羔羊睾丸支持细胞(lsc)。

(2)采用脂质体转染法,将编码htert和neo基因的真核表达质粒pci-neo-htert分别导入分离、纯化的羔羊睾丸支持细胞(lsc)中,350μg/ml浓度g418进行筛选。得到抗g418阳性克隆,从筛选的抗g418阳性细胞克隆(htert-lsc)细胞中提取rna,利用rt-pcr方法检测发现,检测代次的抗g418阳性细胞克隆均表达了htert基因。表明htert基因成功的转入lsc细胞中。并得到有效表达,该筛选得到的抗g418阳性细胞命名为htert-lsc。

(3)通过有限稀释法将htert-lsc细胞传至96孔板中,挑取其中只有单个细胞长成的克隆孔,再扩大培养到获得单克隆的htert-lsc细胞株。

(4)将筛选获得的单克隆htert-lsc细胞株进行细胞生物学特性测定。

其中,将筛选获得的htert-lsc单克隆细胞株分别接种6孔板,观察细胞分种率,细胞长满单层时间;接种gtpv细胞强毒,观察各单克隆细胞株产生cpe情况。试验证实,htert-lsc单克隆细胞株,分种率为1:3,长满单层时间48小时左右,接种gtpv细胞强毒75%产生cpe所需时间均为72小时左右。

其中,将筛选获得的htert-lsc单克隆细胞1#、2#,进行连续传代,记录每一代次细胞长满单层的时间。htert-lsc单克隆细胞株每传5代,接种同一代次的gtpv细胞强毒(lgtcid50≥5.0),观察gtpv对htert-lsc单克隆细胞株的cpe,并测定其tcid50。试验证实,htert-lsc单克隆细胞1#、2#在传代至60代时,细胞株仍保持旺盛的活力。且对gtpv病毒保持很高的增殖能力,细胞产生cpe比较规律,病毒滴度(lgtcid50)均在5.0以上。由此证明,htert-lsc永生化细胞系已建立成功,且该细胞系能够高效增殖羊痘病毒。

其中,将筛选获得的htert-lsc单克隆细胞株,用mtt法检测细胞血清依赖性发现,htert-lsc1#,2#和lsc细胞均不能在无血清培养基中生长,换液后第2d开始有细胞变圆、漂浮、死亡。50ml/lfbs的促增殖作用较弱,而100ml/l和200ml/lfbs则可显著促进两种细胞的增殖(p<0.05),其中200ml/lfbs对htert-lsc的促增殖作用较100ml/lfbs的更为明显,两者间差异显著(p<0.05)。这提示htert-lsc和lsc相比对血清依赖性无明显改变。

其中,取对数生长期的lsc和htert-lsc细胞,加秋水仙素至浓度0.1μg/ml继续培养4~6h。2.5g/l胰蛋白酶消化细胞,1000r/min离心5min,弃上清。50mmol/lkcl重悬细胞沉淀,室温低渗处理60min。然后加入甲醇/冰醋酸(3:1)固定液30min,重悬后4℃离心,弃上清。继续加入固定液,重悬混匀后将细胞悬液滴加在4℃预冷的洁净玻片上,空气干燥。姬姆萨染色10min左右,常规脱水封片,油镜下观察染色体带型。htert-lsc和lsc两种细胞均有42条染色体;且仍为二倍体细胞,染色体形态结构正常。

其中,将第60代htert-lsc1#,2#永生化单克隆细胞株和第17代lsc细胞,作为试验细胞组,同时,以hela细胞为阳性对照组,cef(鸡胚成纤维细胞)为阴性对照组,进行裸鼠接种试验。试验证实,htert-lsc1#,2#永生化单克隆细胞株和第17代lsc细胞接种裸鼠后,试验期内裸鼠无不良症状,背部无肿物形成。接种后2月取材,组织学观察表明接种区组织结构与未接种部位无明显区别。接种hela细胞的活细胞组裸鼠,在接种后7天,在接种部位出现肿块,在接种后30天时肿块大小约10mm。组织病理切片检查发现,细胞排列紊乱,极性消失,可见大量核分裂相。证明htert-lsc1和lsc细胞均无致瘤性。

进一步的,本发明还提出了所述的羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系在培养、增殖羊痘病毒(capripoxvirus,cpv)中的应用。

相较于现有技术,本发明的有益效果是:

本发明成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入lsc细胞中,激活了其端粒酶活性,延长了细胞在体外培养的寿命。本发明通过试验发现,本发明的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系htert-lsc可以连续传代60代以上,且生长增殖特性保持不变。该细胞系对接种羊痘病毒较为敏感,可以高效增殖gtpv病毒,且可以保证病毒的均一、稳定。用该细胞系所增殖的病毒滴度与羔羊睾丸支持细胞lsc相当,且细胞分种率高于lsc,分种率可达1:3。同时利用该永生化细胞系来制备疫苗,简化了生产工艺、缩短了生产周期,降低了生产成本,同时还保证了制备得到的羊痘病毒疫苗的质量稳定。因此,本发明的提出对羊痘病毒疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。

附图说明

图1为分离纯化培养的羔羊睾丸支持细胞(lsc);

其中,a:培养0小时的支持细胞;b:培养2h的支持细胞;c:培养12h的支持细胞;d:培养72h的支持细胞;

图2为羔羊睾丸支持细胞的鉴定;

其中,a:第三代支持细胞he染色;b:第三代支持细胞fasl蛋白检测;c:第三代支持细胞fasl蛋白检测overlay;d:mdbk细胞fasl蛋白检测阴性对照;

图3为支持细胞内标志基因rt-pcr检测;

其中,1.scf;2.gdnf;3.dl2000marker;

图4为pci-neo-htert表达载体图谱;

图5为htert-lsc阳性克隆细胞;

图6为htert-lsc细胞阳性克隆htert基因rt-pcr检测;

其中,m:dl2000marker;1:htert基因阳性对照;

图7a-f为筛选的部分htert-lsc单克隆细胞;

图8为htert-lsc和lsc细胞对血清依赖性;

图9a和b为hela细胞接种裸鼠肿瘤组织病理切片(he染色400×)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[实施例1]分离、纯化培养羔羊睾丸支持细胞(lsc)

1.1羔羊睾丸支持细胞(lsc)分离、纯化培养

选健康母羊(体质健康且口蹄疫、布氏杆菌、结核检测为阴性)所生的健康公羔羊,屠宰后采集阴囊(阴囊根部结扎,阴囊外部用75%酒精消毒),恒温箱内,2小时内送回实验室。无菌采集睾丸实质,利用胶原酶和胰酶混合酶(0.1wt%iv型胶原酶(gibco)、0.25wt%胰酶(gibco))消化法,制备羔羊睾丸原代细胞。

采用6h差速贴壁,50mmol/ltris_hcl对培养的羔羊睾丸原代细胞进行低渗处理、38.5℃高温培养分离、纯化获得羔羊睾丸支持细胞(图1)。

1.2羔羊睾丸支持细胞(lsc)鉴定

将1.1节中分离、纯化培养的羔羊睾丸支持细胞细胞系进行he染色观察细胞形态,同时,采用fasl蛋白进行羔羊睾丸支持细胞的免疫组化鉴定。

免疫组化方法如下:将培养3d的羔羊睾丸支持细胞用4%多聚甲醛溶液固定10min,pbs漂洗3次×5min,山羊血清室温下封闭孵育20min,加入兔抗大鼠fasl多克隆抗体(abcam公司,1∶100稀释)一抗混合工作液,37℃孵育3h,pbs漂洗3次,加入fitc标记山羊抗兔igg(abcam公司,1∶50稀释)二抗混合工作液37℃孵育30min,pbs漂洗3次,荧光显微镜下随机选择10个视野,绿色荧光下观察fasl染色结果。计算每视野中fasl阳性细胞和细胞总数,计算阳性细胞百分比,得到羔羊睾丸支持细胞的纯度。

提取羔羊睾丸支持细胞的总rna,反转录后,检测支持细胞的标志基因scf和gdnf的表达情况(引物序列见表1),反应条件:94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃20s,30个循环;72℃7min。引物由大连宝生物(takara)有限公司合成。

表1引物序列信息

经he染色,可以看出获得的羔羊睾丸支持细胞形态不规则,胞质完全铺开,染色较淡,而细胞核染色较深,呈圆形或椭圆形位于细胞质中央或偏位,核仁明显(图2a);间接免疫荧光检测睾丸支持细胞表达fasl蛋白,结果分离纯化培养的支持细胞,几乎都看到绿色荧光(图2c、d),支持细胞阳性率达到95%以上。mdbk细胞阴性对照细胞没有检测到绿色荧光(图2b)。rt-pcr结果表明:支持细胞内显著表达其标志基因gdnf和scf(图3)。

[实施例2]羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系(htert-lsc)的建立

2.1pci-neo-htert质粒转染lsc细胞

将实施例1从羔羊睾丸原代细胞中分离、纯化得到羔羊睾丸支持细胞,按invitrogen公司的lipofectamine2000regent转染说明书要求,将编码htert和neo基因的真核表达质粒pci-neo-htert(载体图谱如图4所示)导入lsc(第17代)中,对lsc限传代细胞系进行永生化改造。

2.2新霉素(g418)最佳筛选浓度的确定

将lsc(第17代)细胞制备成细胞悬液以1×105个/ml接种到24孔板内。将g418在100μg/ml~1000μg/ml范围内按每50μg/ml一个梯度,每孔中加入不同浓度的筛选培养液。每个梯度作4个重复孔。根据细胞生长情况,每2d更液一次。筛选10d内能够杀死所有细胞的最小g418浓度即为最佳筛选浓度。

试验证明,发现接种的lsc细胞全部死亡的最低浓度是350μg/ml。选用该浓度作为本实验中永生化细胞:htert-lsc的最佳筛选浓度。

2.3htert-lsc阳性细胞的获得

将转染pci-neo-htert质粒的lsc细胞汇合80%时,弃去培养上清,更换新的细胞培养液并加入g418,使其终浓度为300μg/ml,连续培养两周,每2d换相同浓度g418细胞培养液;同时设lsc未转染细胞为空白对照,逐日观察细胞生长及死亡情况。直到阳性克隆可见为止。将抗g418阳性克隆细胞扩大培养,得到抗g418阳性克隆(图5)。从筛选的抗g418阳性克隆细胞中提取rna,利用rt-pcr方法检测转染细胞中外源性htert的表达。

检测结果如图6显示,在抗g418阳性克隆细胞两个不同代次的细胞中均能扩增出约为400bp的特异性片段,片段长度与预期一致。筛选出阳性细胞表达了htert基因,表明htert基因成功的转入lsc细胞中,并得到有效表达,该筛选得到的抗g418阳性细胞命名为htert-lsc。

2.4htert-lsc单克隆细胞筛选

通过有限稀释法将htert-lsc(16代)细胞传至96孔板中,挑取其中只有单个细胞长成的克隆孔,再扩大培养到24孔板、6孔板。共获得16株htert-lsc单克隆细胞株(图7),将其依次命名为htert-lsc1#~16#。

[实施例3]htert-lsc生物学特性测定

3.1htert-lsc单克隆细胞生长特性及病毒增殖情况

将实施例2筛选的htert-lsc单克隆细胞株1#~16#分别接种6孔板,观察其分种率(指将1瓶细胞瓶内的原代细胞可接种到多少个相同体积的细胞瓶内进行传代培养),细胞长满单层时间;再将长满单层的htert-lsc单克隆细胞株1#~16#接种gtpv细胞强毒(lgtcid50≥6.0),观察病毒对细胞产生cpe情况,结果见表2。

表2htert-lsc单克隆细胞生长特性及病毒增殖情况

由表2可见htert-lsc各单克隆细胞株生长特性稳定,生长速度及细胞分种率都很一致,48h长满单层,对gtpv细胞强毒产生cpe比较规律,细胞产生75%cpe时间维持在72左右。

3.2htert-lsc细胞的传代及其对gtpv的增殖试验

将实施例1筛选的htert-lsc单克隆细胞1#、2#,进行连续传代,记录每一代次细胞长满单层的时间。htert-lsc单克隆细胞株每传5代,接种同一代次的gtpv细胞强毒(lgtcid50≥5.0),观察gtpv对htert-lsc单克隆细胞株的cpe,并测定其tcid50。

试验证实,htert-lsc单克隆细胞1#、2#在传代至60代时,细胞株仍保持旺盛的活力,且对gtpv病毒保持很高的增殖能力,细胞产生cpe比较规律,病毒滴度(lgtcid50)均在5.0以上,htert-lsc单克隆细胞1#的传代及其对gtpv的增殖情况结果见表3。由此证明,htert-lsc永生化细胞系已建立成功。

表3htert-lsc单克隆细胞1#的传代及其对gtpv的增殖情况

3.3htert-lsc单克隆细胞血清依赖性

用mtt法检测细胞血清依赖性,具体如下:

(1)第58代的htert-lsc1#,2#和第17代lsc细胞按1×104个细胞/孔接种于96孔培养板。

(2)接种后24h,分别用50ml/lfbs、100ml/lfbs、200ml/lfbs的dmem/f12培养液更换细胞液。每个梯度做3个重复孔,同时设3个空白孔。

(3)置37℃、条件分数比为5%co2饱和湿度培养箱中孵育14h。

(4)加入10μlmtt(10mg/ml)反应液,37℃继续孵育2~4h,直至在显微镜下可见明显的针尖状的紫色结晶。

(5)加100μldmso至各孔中,包括空白孔,轻轻混匀。

(6)避光作用2~4h,在酶联免疫检测仪上测定光吸收值,测定波长为490nm。以空白孔调零,并绘制曲线图。

htert-lsc1#,2#和lsc细胞均不能在无血清培养基中生长,换液后第2d开始有细胞变圆、漂浮、死亡。50ml/lfbs的促增殖作用较弱,而100ml/l和200ml/lfbs则可显著促进两种细胞的增殖(p<0.05),其中200ml/lfbs对htert-lsc的促增殖作用较100ml/lfbs的更为明显,两者间差异显著(p<0.05)。这提示htert-lsc和lsc相比对血清依赖性无明显改变(图8)。

3.4htert-lsc和lsc细胞染色体核型分析

取对数生长期的htert-lsc和lsc细胞,加秋水仙素至浓度0.1μg/ml继续培养4~6h。2.5g/l胰蛋白酶消化细胞,1000r/min离心5min,弃上清。50mmol/lkcl重悬细胞沉淀,室温低渗处理60min。然后加入甲醇/冰醋酸(3:1)固定液30min,重悬后4℃离心,弃上清。继续加入固定液,重悬混匀后将细胞悬液滴加在4℃预冷的洁净玻片上,空气干燥。姬姆萨染色10min左右,常规脱水封片,油镜下观察染色体带型。htert-lsc和lsc两种细胞均有42条染色体;且仍为二倍体细胞,染色体形态结构正常。

3.5裸鼠致瘤试验

将第58代htert-lsc1#,2#永生化单克隆细胞株和第17代lsc细胞,作为试验细胞组,同时,以hela细胞为阳性对照组,cef(鸡胚成纤维细胞)为阴性对照组,进行裸鼠接种试验。所有试验用细胞均同代次制备两份,将其分为活细胞组和细胞冻融裂解组(细胞冻融裂解组,在试验前反复冻融3次,以保证所有细胞彻底裂解)。每组样品各接种10只裸鼠,雌雄各半,每个样品各接种裸鼠2组,其中活细胞1组,冻融细胞1组,每只裸鼠颈后或背部前1/3处皮下接种细胞悬液,接种剂量0.2ml/只,细胞浓度106~107/0.2ml。

接种细胞悬液(活细胞和冻融破碎细胞)后,逐日观察并详细记录裸鼠的精神、饮食、排便以及肿瘤生长情况,用游标卡尺测量肿块、结节的长度、宽度。观察14天后,检查有无结节或肿瘤形成。如有结节或可疑病灶,应继续观察1-2周后断颈处死、剖检,进行病理组织学观察。对未发现结节或可疑病灶的裸鼠,对其中的一半裸鼠观察12周后剖检,对另一半裸鼠观察12周断颈处死后、剖检,采集裸鼠各个脏器和淋巴结,经10%戊二醛固定后,做病理切片,并进行病理组织学观察。

htert-lsc1#,2#永生化单克隆细胞株和第17代lsc细胞接种裸鼠后,试验期内裸鼠无不良症状,背部无肿物形成。接种后2月取材,组织学观察表明接种区组织结构与未接种部位无明显区别(表4)。接种hela细胞的活细胞组裸鼠,在接种后7天,在接种部位出现肿块,在接种后30天时肿块大小约10mm。组织病理切片检查发现,细胞排列紊乱,极性消失,可见大量核分裂相(图9)。证明htert-lsc和lsc细胞系均无为致瘤性。

表4htert-lsc和lsc对裸鼠的致瘤性试验结果

综上所述,本发明成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入lsc细胞中,激活了其端粒酶活性,延长了细胞在体外培养的寿命。羔羊睾丸支持永生化细胞系(htert-lsc)仍保持其父本细胞(lsc)正常的生物学特性,且可以高效增殖gtpv病毒。该细胞系已于2018年10月12日送交武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏,其保藏号cctccno:c2018202。

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