一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法与流程

文档序号:18145663发布日期:2019-07-10 11:47

技术特征:

1.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法,其特征在于,按照如下步骤:

S1步骤:以逆转录得到的红螯螯虾性腺组织cDNA为模板,利用引物通过PCR反应扩增得到dsx基因的部分ORF序列,该序列作为dsx基因mRNA特异的探针序列;

S2步骤:构建dsx基因mRNA原位杂交的探针质粒,将探针质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序;

S3步骤:制备dsx基因mRNA原位杂交探针。

2.根据权利要求1所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法,其特征在于:所述dsx基因在精巢中表达,而在卵巢中不表达。

3.根据权利要求1所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法,其特征在于:所述引物的

正向引物为:5’-GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGA-3’;

反向引物为:5’-CCTATAGTGAGTCGTATTAAAGCTT-3’。

4.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针,其特征在于:采用权利要求1或2或3所述的方法制得。

5.根据权利要求4所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针,其特征在于:所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示。

6.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法,包括性腺组织包埋、石蜡切片、原位杂交和拍照记录,其特征在于:所述原位杂交采用权利要求4所述的探针。

7.根据权利要求6所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法,其特征在于:所述的原位杂交包括如下步骤:

1)石蜡切片脱蜡:将切片依次用二甲苯、无水乙醇、85%酒精、75%酒精、DEPC水洗进行脱蜡;

2)消化:将水洗后切片于修复液中煮沸,自然冷却后基因笔画圈,根据不同组织不同指标特性,滴加蛋白酶K消化,冲洗;

3)预杂交:将消化后切片上滴加预杂交液,孵育;

4)杂交:倾去预杂交液,滴加含探针杂交液,杂交过夜后洗涤;

3)封闭:滴加封闭血清BSA,倾去封闭液,然后滴加anti-DIG-HRP,孵育;

4)DAB显色:切片稍甩干后,在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,纯水冲洗切片终止显色;

5)复染细胞核:用苏木素染液复染,水洗后经1%盐酸酒精分化,水洗,氨水返蓝,冲洗;

6)封片:中性树胶封片。

8.根据权利要求7所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法,其特征在于:所述二甲苯中含有0.03-0.06%三氯乙醛和2.8-3.0%苯芴醇。

9.根据权利要求7所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法,其特征在于:所述探针杂交液的浓度为50ng/ul。

10.根据权利要求6所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法,其特征在于:所述性腺组织包埋包括如下步骤:

将组织取出洗净后立即放入固定液中固定2-12h,固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡,包埋。

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