一种检测单胺氧化酶B的基于激发态分子内质子转移的荧光探针的制备的制作方法

本发明涉及小分子荧光探针鉴定异常的生物酶活性在细胞中的表达水平，更具体地说是一种基于激发态分子内质子转移的荧光探针对神经系统疾病的重要标志物单胺氧化酶b的检测。

背景技术：

单胺氧化酶是催化单胺类物质氧化脱氨反应的酶。单胺氧化酶催化生物胺的氧化，产生对应的醛和活性氧。单胺氧化酶存在于细胞的线粒体外膜上，在人体内分布极广，尤以肝、脑及肾等组织细胞内的含量最高。人体中的单胺氧化酶分为两种，一种是单胺氧化酶a另一种是单胺氧化酶b。尽管这两种酶具有70％相同的基因编码，但它们具有不同的生理特性和抑制剂特异性。mao-b是人脑中发现的mao的主要类型，主要存在于神经胶质细胞中。据报道，mao-b在维持生物胺平衡方面发挥着重要作用。但是在衰老过程中观察到大脑中异常高的mao-b活性。经过研究发现，在阿尔茨海默氏病（ad），亨廷顿病（hd），帕金森病（pd）和肌萎缩侧索硬化症（als）患者中观察到异常高的mao-b活性。因此，推进mao-b的特异性检测成为重中之重。

现阶段检测生物酶的方法主要包括放射性，酶联免疫测定，分光光度法和荧光分析。与其他生物酶检测技术相比，荧光探针结合激光共聚焦成像技术现已成为检测生物酶的主流方法。荧光成像逐步成为主流方法的原因是具有无创、高分辨率和实时成像等优点。因此，在酶测定过程中荧光探针不仅可以精确评估酶水平而且可以保持酶活性。由于mao-b在神经系统健康和疾病早期检测中的关键作用，研究人员对开发用于监测mao-b活性的选择性，稳定和灵敏的荧光探针非常感兴趣。当前检测的重点主要集中在异构体mao-a或总体mao上，只有少数荧光探针用于特异性检测mao-b。而这些用于特异性检测mao-b的荧光探针却存在生物相容性差、背景荧光强、易扩散等缺点。

为了应对上述挑战，我们选择了一种具有激发态分子内质子转移（esipt）的荧光染料2-（2'-羟基苯基）4（3h）喹唑啉酮（hpq）。hpq与常见的荧光染料不同，在固态下有强烈荧光并且完全不溶于水性介质。hpq具有大的斯托克斯位移，强荧光，良好的光稳定性，并且大的斯托克斯位移使其具有低背景荧光和灵敏度高等优势。其强烈的荧光和完全不溶于水的性质都与酚氢和亚胺氮之间的内部氢键密切相关。为了消除hpq的长波长荧光，我们通过将极性的酶敏感基团连接到氧原子上来实现这一点。我们通过在hpq上修饰n-boc-3-氨基丙基溴，得到了一种可以特异性检测mao-b的荧光探针。它不仅克服了传统检测mao-b荧光探针的生物相容性差、背景荧光强、易扩散等缺点，还具备了hpq的良好的光稳定性、强烈的荧光等优点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题：一是提供一种原料廉价，合成步骤简单快捷，反应条件温和的荧光探针合成方法。二是提供了一种具有大斯托克斯位移、生物相容性好、灵敏度高、背景荧光低、不易扩散、光稳定性好、特异性好、检测速度快、选择性强，检测生物样品、活细胞和动物中的mao-b的基于激发态分子内质子转移的荧光探针。

为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下，一种特异性识别mao-b的基于激发态分子内质子转移的荧光探针，具有如式ⅰ所示hpq-b1分子结构式：

上述单胺氧化酶b荧光探针的制备方法如下：

1）将1eq的2-（2'-羟基苯基）4（3h）喹唑啉酮染料与1eq的n-boc-3-氨基丙基溴，溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入0.1eq的无水碳酸钠和0.05eq的碘化钠，在室温下搅拌后，升温至90°c回流12h。用tcl板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压蒸发，并用洗脱剂为二氯甲烷的硅胶柱进行分离，得到化合物hpq-b0;

2）向1eq的hpq-b0中加入10ml的三氟乙酸，旋蒸蒸干脱去保护基团。使用洗脱剂为二氯甲烷的硅胶柱纯化残余物，得到目标探针化合物hpq-b1。

本发明的优点:

本发明的荧光探针，在紫外灯下可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。

本发明的荧光探针，其本身不发射荧光，在与mao-b作用后，反应体系在475nm处出现荧光峰。

本发明的荧光探针对单胺氧化酶b的检测表现出很高的灵敏度，具有良好的光稳定性。探针溶液荧光强度与mao-b浓度有很好的线性关系。

本发明的荧光探针对mao-b有很好的选择性和很强的抗干扰能力。可能干扰的离子zn²⁺,mg²⁺,k⁺,cr³⁺,na⁺,co²⁺,ca²⁺;活性硫物质s2o3^2-,so3^2-,hso3^-;精氨酸、丝氨酸;活性氧物质h2o2,onoo^-,clo^-的存在不影响探针分子对mao-b的响应。

本发明的荧光探针具有较好的生物相容性、化学稳定性、光稳定性性和mao-b选择性。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。

因此，本发明是一种简单、快速、灵敏的mao-b特异性检测试剂。在化学分析检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是hpq-b1分子结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

1）化合物hpq-b0的合成：

将2-（2'-羟基苯基）4（3h）喹唑啉酮染料（4mmol,1eq），n-boc-3-氨基丙基溴(4mmol,1eq)溶解于20mln,n-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入（0.4mmol,0.1eq）的无水碳酸钠和（0.2mmol,0.05eq）的碘化钠，在室温下搅拌后，升温至90°c回流12h。用tcl板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压蒸发，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，得到化合物hpq-b0，为棕黄色固体，洗脱剂为二氯甲烷。

2）化合物hpq-b1的合成：

向（2mmol,1eq）的hpq-b0中加入10ml的三氟乙酸，旋蒸蒸干以脱去保护基团。通过硅胶柱纯化残余物，硅胶颗粒大小为200-300目，得到目标探针化合物hpq-b1，为棕黄色固体，洗脱剂为二氯甲烷。

3）化合物hpq-b1荧光探针随不同mao-b浓度（0-200μg/ml）在475nm荧光强度的变化

取制备的hpq-b1荧光探针溶于含有（100mmhepes,1mmcacl2,0.5%tritonx-100,ph7.4）5%dmso作为共溶剂的pbs（ph7.4）制备0.5mm储备溶液。从储备液中取出10μl加入到1.5ml的离心管当中，加入不同量（0-200μg/ml）的mao-b标准溶液，用pbs缓冲溶液稀释至0.2ml，并在37°c下孵育2h，测量其荧光性质。以365nm为激发光，随着mao-b加入量的增加，475nm处的荧光强度急剧增长。

4）化合物hpq-b1荧光探针的荧光线性范围测定

配制10份2ml的hpq-b1荧光探针溶液（10μm），分别加入mao-b（0-50μg/ml），进行荧光检测（λex=365nm），计算各体系中荧光强度，通过分析475nm处的荧光强度与mao-b浓度的关系，评估探针对mao-b的响应性能。

5）化合物hpq-b1荧光探针对不同分子或离子的选择性

从实施例1中荧光探针储备液中取出10μl加入到1.5ml的离心管当中，分别加入100eq的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的mao-b标准溶液，在37°c下120min后以365nm为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，可以发现，其他干扰物质对化合物hpq-b1的荧光几乎没有影响，而mao-b的加入使化合物hpq-b1的荧光显著增强。

6）化合物hpq-b1荧光探针对抑制剂的响应

我们将本发明探针与mao-b的特异性抑制剂帕吉林进行酶抑制反应实验。体系a：10μm化合物hpq-b1荧光探针标准溶液；b：在反应体系a中加入10μg/ml的mao-b；c：在反应体系b中加入1μm的帕吉林。测定表明，在加入酶抑制剂后荧光强度会降低，说明探针确实与mao-b发生了反应。体系中未加入mao-b，探针和染料的荧光强度随着帕吉林浓度的增大并未发生明显变化，进一步说明了探针与酶的特异性反应。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，反利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。