一种检测NTRK融合的FISH探针组及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测ntrk融合的fish探针组及其应用。

背景技术：

ntrk1、ntrk2、ntrk3属于神经营养受体酪氨酸激酶(ntrk)家族，分别位于1、9、15号染色体，分别负责编码原肌凝蛋白受体激酶(trk)家族蛋白trka、trkb和trkc，当胞外配体神经营养因子与trk蛋白受体结合后，可诱导受体形成二聚体并发生磷酸化，激活ras/mapk/erk、p13k、plcγ等下游信号通路，参与细胞生长、增殖等过程。trk在正常组织表达量低，但在发生融合(伙伴基因作为5’端与ntrk3’端激酶区融合)时，可导致trk的异常表达，造成激酶区持续激活，引发肿瘤。

ntrk融合在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胆管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、黑色素瘤、软组织肉瘤、婴儿纤维瘤、脑胶质瘤等多种肿瘤中都有发现，虽然在常见肿瘤如肺癌、乳腺癌、结直肠癌中ntrk融合比例低于5％，但在某些肿瘤如乳头状甲状腺癌、先天性中胚层肾瘤、桥脑胶质瘤发生比例较高，在部分罕见肿瘤如唾液腺乳腺样分泌癌、先天性婴儿纤维瘤、分泌型乳腺癌中发生比例甚至可大于90％。因此，ntrk融合具有广谱性，成为了肿瘤靶向治疗的热门靶点。

拜耳公司和loxooncology公司联合开发的larotrectinib(拉罗替尼，也称loxo-101，商品名vitrakvi)是一款trk特异性小分子抑制剂，因其具有的广泛而显著的抗肿瘤疗效(临床试验中，其对17种肿瘤均有效，总体客观反应率(orr)高达81％)而于2018年11月26日获得美国fda批准上市，用于治疗无已知耐药突变的，广泛转移或局部手术治疗效果不好的，现有治疗方案进展或无可替代治疗方案的，ntrk基因融合的成人和儿童实体瘤患者，也就是说，只要具有ntrk1、ntrk2或ntrk3基因融合的患者，不限肿瘤类型，均可以使用拉罗替尼治疗。ignyta生物技术公司开发的entrectinib(rxdx-101)是一种口服，具中枢神经系统作用活性的，针对ntrk1/2/3，ros1和alk驱动基因的酪氨酸激酶抑制剂，2017年5月fda授予entrectinib突破性疗法认定，用于治疗ntrk阳性的局部晚期或转移性实体瘤的成人和儿童患者的治疗。临床试验数据显示，entrectinib也是广谱药，对19种肿瘤有效，orr达57.4％，尤其其具有良好的血脑屏障穿透性，对cns患者的颅内有效性令人惊喜，orr为54.5％。因此，检测肿瘤患者ntrk基因融合状态，有助于筛选出larotrectinib/entrectinib的敏感人群，指导临床用药。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测ntrk融合的fish探针组。

本发明的另一目的在于提供一种检测ntrk融合的fish试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种检测ntrk融合的fish探针组，包括

ntrk15′端探针组，以ntrk1基因着丝粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第一报告基团；

ntrk13′端探针组，以ntrk1基因端粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第二报告基团；

ntrk25′端探针组，以ntrk2基因着丝粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第一报告基团；

ntrk23′端探针组，以ntrk2基因端粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第二报告基团；

ntrk35′端探针组，以ntrk3基因着丝粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第一报告基团；

ntrk33′端探针组，以ntrk3基因端粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第二报告基团；

上述随机引物由9个核苷酸构成，每一核苷酸为a、t、c或g，且从5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通过spacer9连接修饰有荧光基团。

在本发明的一个优选实施方案中，所述ntrk15′端探针组的模板由rp11-1054f3和rp11-66d17组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述ntrk13′端探针组的模板由rp11-1038n13和rp11-110j1组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述ntrk25′端探针组的模板由rp11-324l15和ctd-2509d1组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述ntrk23′端探针组的模板由rp11-152d13和ctd-2339e11组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述ntrk35′端探针组的模板由rp11-110o23和rp11-97012组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述ntrk33′端探针组的模板由rp11-113c11和ctd-2526n1组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一报告基团和第二报告基团分别为第一荧光报告基团和第二荧光报告基团。

本发明的另一技术方案如下：

一种检测ntrk融合的fish试剂盒，包括上述fish探针组。

在本发明的一个优选实施方案中，包括

ntrk1基因断裂探针体系，由所述ntrk15′端探针组、ntrk13′端探针组、cot-1dna、2×杂交液和ddh2o组成；

ntrk2基因断裂探针体系，由所述ntrk25′端探针组、ntrk23′端探针组、cot-1dna、2×杂交液和ddh2o组成；

ntrk3基因断裂探针体系，由所述ntrk35′端探针组、ntrk33′端探针组、cot-1dna、2×杂交液和ddh2o组成；

其中，2×杂交液的配方中含有50％(v/v)甲酰胺和10％(w/v)硫酸葡聚糖，并以2×ssc溶液为溶剂。

本发明的有益效果是：

1、本发明中的ntrk基因断裂探针体系通过对肿瘤石蜡组织切片进行常规处理后，分别采用3种断裂探针进行荧光原位杂交，根据观察到的荧光信号情况判断是否存在ntrk1或ntrk2或ntrk3基因融合，操作快速、简便，检测结果准确可靠，可准确检测出ntrk1、ntrk2、ntrk3基因所有融合类型(既包括已知的融合类型，也包括未知的融合类型)，为肿瘤患者治疗方案提供参考依据，有利于患者个体化靶向治疗，减少药物副作用，提高患者生存质量，减轻家庭、社会负担，适于大规模推广应用。

2、本发明的fish探针设计巧妙、周全，5′端探针和3′端探针分别由2个bac克隆标记得到，避免了单个bac克隆导致的信号强度弱和3个或以上bac克隆导致的信号背景高的缺点，探针特异性和敏感性高。同时3种ntrk基因断裂探针的5′端探针均标记为同一报告基团，3′端探针均标记为同一报告基团，使得3种ntrk基因断裂探针的结果判读方法一致，因此整个判读流程特别简洁、方便，利于使用。

3、本发明的fish探针的5′端探针组和3′端探针组均采用了特定设计的随机引物法进行标记，与常规方法不同，本发明所用的随机引物经过了特殊的修饰，特殊的修饰指在随机引物的5′端第一个碱基或第五个碱基修饰一个荧光基团，并且荧光基团与被修饰的碱基之间通过spacer9隔开，以避免修饰对标记反应的影响，通过这一修饰，使得标记得到的探针具有更高的荧光标记效率(即探针上每100bp所掺入的荧光染料更多)，常规的随机引物法标记效率在2-4个染料/100bp，本发明探针的标记效率在3-5个染料/100bp，标记效率提高约40％，从而产生更强的荧光信号。

附图说明

图1为本发明的ntrk1、ntrk2、ntrk3的fish探针的设计原理图。

图2为本发明实施例3中的ntrk1基因断裂探针体系的阴性结果图，可见细胞内有1个或2个融合信号(或红绿紧邻)。

图3为本发明实施例3中的ntrk1基因断裂探针体系的阳性结果图，可见细胞内有1个融合信号(或红绿紧邻)和1对红、绿分离信号。

图4为本发明实施例3中的ntrk2基因断裂探针体系的阳性结果图，可见细胞内有1个融合信号(或红绿紧邻)和1对红、绿分离信号。

图5为本发明实施例3中的ntrk3基因断裂探针体系的阳性结果图之一，可见细胞内有1个融合信号(或红绿紧邻)和1对红、绿分离信号。

图6为本发明实施例3中的ntrk3基因断裂探针体系的阳性结果图之二，可见细胞内有1个融合信号(或红绿紧邻)和1个单独的3′端红色信号。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

如图1所示，ntrk15′端探针组(ntrk1基因着丝粒一侧)以2个bac克隆(rp11-1054f3和rp11-66d17)为模板，ntrk13′端探针组(ntrk1基因端粒一侧)以2个bac克隆(rp11-1038n13和rp11-110j1)为模板；ntrk25′端探针(ntrk2基因着丝粒一侧)以2个bac克隆(rp11-324l15和ctd-2509d1)为模板，ntrk23′端探针(ntrk2基因端粒一侧)以2个bac克隆(rp11-152d13和ctd-2339e11)为模板；ntrk35′端探针(ntrk3基因端粒一侧)以2个bac克隆(rp11-110o23和rp11-97o12)为模板，ntrk33′端探针(ntrk3基因着丝粒一侧)以2个bac克隆(rp11-113c11和ctd-2526n1)为模板。3个基因的5′端探针均使用fitc(第一荧光报告基团)标记为绿色信号，3′端探针均使用tetramethyl-rhodamine(第二荧光报告基团)标记为红色信号，上述bac克隆均购自美国奥克兰儿童医院研究所。

以ntrk1基因断裂探针为例，探针组的制作和标记步骤如下：

(1)在2个200μlpcr反应管中，分别按如下体系加入反应原料进行5′端探针组和3′端探针组的制作和标记：

上述随机引物由9个核苷酸构成，每一核苷酸为a、t、c或g，且从5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通过spacer9连接修饰有荧光基团；上述5×buffer的配方为：10mmtris-hcl、25mmmgcl2(氯化镁)，用ddh2o配制。

吹打混匀后，于pcr仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。

(2)避光环境下，加入如下体系反应原料：

注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。

吹打混匀后，于pcr仪上37℃反应3.5h，加入2.5μl0.5medta，ph7.4)终止反应。

(3)沉淀探针：向(2)加入2.75μl(1/10体积)3m乙酸钠(ph5.2)，再加入70μl-20℃预冷冻的无水乙醇(约2.5倍体积)，充分混匀后，用锡箔纸包住，-20℃沉淀2h或沉淀过夜(12-16h)。

(4)从-20℃取出探针，4℃、13000rpm离心20min，用移液枪小心吸弃上清，再加入200μl75％乙醇(-20℃预冷冻)，混匀，4℃、13000rpm离心20min，用移液枪小心吸弃乙醇，避光、室温通风橱中吹干10min。

(5)重悬探针：加入5μlddh2o重悬探针沉淀(视沉淀量而定，若沉淀量较多，也可用10μlddh2o溶解)，分别得到5′端探针组和3′端探针组。

(6)标记效率和浓度测定：使用紫外分光光度分别检测5′端探针组和3′端探针探针组的标记效率和浓度。

(7)ntrk1基因断裂探针体系配制体系如下：

-20℃避光保存。

上述2×杂交液的配方中含有50％(v/v)甲酰胺和10％(w/v)硫酸葡聚糖，并以2×ssc溶液为溶剂。

使用同样的方法制备ntrk2基因断裂探针体系和ntrk3基因断裂探针体系。

实施例2

使用紫外分光光度计测定上述探针组中的探针的标记效率和浓度的步骤如下：

(1)打开紫外分光光度计(nanodrop)，选择全波长模式，并选择对应的波长，在空白校准后，分别测定5′端探针组的a260nm、adye(fitc：a494nm)和3′端探针组的a260nm、adye(tetramethyl-rhodamine：a560nm)。

(2)由于荧光染料在260nm处也有一定的吸光值，为使探针在260nm处的吸光值更准确，使用以下公式校正a260的值：abase＝a260-(adye×cf260)，cf260指校正因子，是一个常数，每种荧光染料都有确定的cf260值，如tetramethyl-rhodamine的cf260值是0.06、fitc是0.32。(3)通过以下公式计算探针标记效率和浓度：探针标记效率＝100×(adye×εbase)÷(abase×εdye)，探针浓度＝(abase×mwbase)/(εbase×光径)×50ng/μl，其中ε指摩尔消光系数，如dsdna的值为6600(cm^-1·m^-1)、tetramethyl-rhodamine为89000(cm^-1·m^-1)、fitc为78000(cm^-1·m^-1)，dsdnamwbase为330，本实验中，光径为0.1cm。

使用本实施例的标记方法和常规随机引物标记方法标记得到的5′端探针组和3′端探针组的标记效率和浓度如下表所示：

由上表可以看出，使用本实施例标记的探针浓度与常规随机引物标记法没有明显差别，但探针的标记效率更高，平均可提高41.7％，因此可以产生更强的荧光信号。

实施例3

使用实施例1制得的ntrk1基因断裂探针体系和ntrk3基因断裂探针体系检测由医院提供的50例乳头状甲状腺癌样本，ntrk3基因断裂探针体系检测10例唾液腺乳腺样分泌癌样本，ntrk2基因断裂探针体系检测20例桥脑胶质瘤样本，同时使用美国帝国基因公司(empiregenomics)的ntrk探针对这些样本进行检测，检测步骤如下：

(1)样本脱蜡、复水：将组织切片样本依次浸入3缸二甲苯中脱蜡，每次10min，然后依次在100％、100％、100％、85％和70％乙醇中浸泡3min，最后浸入去离子水中3min。

(2)样本预处理和消化：将组织切片样本在100℃水中煮20min，取出样本用胃蛋白酶消化10min，转移到2×ssc溶液中浸泡3min，取出样本依次浸入70％、85％和100％乙醇脱水，每次3min，取出样本自然晾干。

(3)样本与探针杂交：用移液枪取10μl探针加到样本上，盖上盖玻片，注意避免产生气泡，用封片胶封住盖玻片。置于原位杂交仪中，85℃变性5min，37℃杂交过夜(12-16h)。

(4)洗涤：取出样本，用镊子小心移去盖玻片，将样本浸入2×ssc溶液中浸泡5min，再浸入46℃的0.1％np-40洗涤液中洗涤7min，然后将样本依次浸入70％、85％和100％乙醇脱水，每次3min，取出样本自然晾干。

(5)复染：取10μldapi复染液加到样本上，盖上盖玻片，复染15min。

(6)镜下分析：在荧光显微镜下，分别用fitc滤光块和罗丹明滤光块观察绿色信号和红色信号，利用双通道滤光块观察红绿信号分离情况。选择细胞轮廓清晰、背景良好、杂交信号强的区域的50个肿瘤细胞进行结果判读，并记录和拍照。

(7)结果判读：如图2至6所示，在正常的细胞中，可见两个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，在异常的细胞中，有三种信号模式，第一种是可见零个或一个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，以及一对或多对红、绿分离信号(红绿信号距离≥2个信号直径视为分离，否则视为融合信号)，第二种是可见一个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，以及单独的3′端信号，第三种是可见零个或一个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，以及单独的3′端信号伴一对或多对红、绿分离信号。当异常细胞比例≥15％时判为阳性。

本发明探针和帝国基因公司探针的检测结果如下表1-3所示：

表150例乳头状甲状腺癌ntrk1基因断裂探针检测结果

表220例桥脑胶质瘤ntrk1基因断裂探针检测结果

表310例唾液腺乳腺样分泌癌和50例乳头状甲状腺癌ntrk3基因断裂探针检测结果

使用实施例1的ntrk1至3基因断裂探针体系检测这80例样本，以美国帝国基因公司的检测结果作为对照，计算本发明检测结果的符合率。实施例1的ntrk1基因断裂探针检测50例乳头状甲状腺癌样本，检测结果与帝国基因公司检测结果的符合率为100％，实施例1的ntrk2基因断裂探针检测20例桥脑胶质瘤样本，检测结果与帝国基因公司检测结果的符合率为100％，实施例1的ntrk3基因断裂探针检测10例唾液腺乳腺样分泌癌样本和50例乳头状甲状腺癌样本，检测结果与帝国基因公司检测结果的符合率均为100％，说明实施例1的所提供的ntrk1至3基因断裂探针体系可准确地检测出ntrk1、ntrk2和ntrk3基因融合。此外，由于实施例1的ntrk1、ntrk2、ntrk3探针组设计时统一将5′端探针组标记为绿色，3′端探针组标记为红色，因此，实施例1所提供的ntrk1至3基因断裂探针体系的结果判读方法完全一致，具有判读简便的优点，方便使用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。