一种检测FGFR2融合的FISH探针组及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测fgfr2融合的fish探针组及其应用。

背景技术：

肝内胆管细胞癌(intrahepaticcholangiocarcinomaicc)是起源于二级胆管及其分支上皮的腺癌，恶性程度比较高，约占肝脏原发性恶性肿瘤的10-15％，发病率仅次于肝细胞肝癌(rizviandgores，gastroenterology2013)。在全球范围内，icc属于较为罕见的肿瘤，但在中国、韩国、泰国等东南亚国家，icc属于常见肿瘤，并且近年来发病率呈上升趋势，我国icc的发病率约为7.5/10万(cardinaleetal.hepatomares2018；4：20)。

icc早期无明显临床症状，多数患者发现时已处于晚期，预后极差，5年生存率仅为5％。随着基因检测技术的发展，通过对icc基因谱和表达谱的分析，发现～70％icc患者存在相关基因突变，如fgfr2融合、kras突变、braf突变、idh突变(siadetal.naturecomm2014)，同时越来越多的靶向药物被开发出来，并用于icc的临床研究，取得了不错的治疗效果，给icc患者带来了新的希望(mazzaferrovetal.britishjournalofcancer2018；javlemetal.esmo2018)。

fgfr2(fibroblastgrowthfactorreceptor2)是成纤维生长因子受体家族成员，在胚胎发育、组织创伤修复、血管生成等生理过程中发挥重要作用，近年的研究表明，fgfr2通过诱导分裂、促进肿瘤细胞转移、促进血管生成等方式参与肿瘤发生、发展，是icc等肿瘤的驱动基因，也是新的治疗靶点。fgfr2在icc中的主要变异形式是基因融合，已发现fgfr2的融合伙伴基因有30多种，融合方式多种多样，因此，针对fgfr2融合的检测有一定的挑战。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种检测fgfr2融合的fish探针组。

本发明的另一目的在于提供一种检测fgfr2融合的fish试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种检测fgfr2融合的fish探针组，包括

5′端探针组，以fgfr2基因端粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第一报告基团；

3′端探针组，以fgfr2基因着丝粒一侧的核苷酸序列的不同的二bac克隆为模板，用随机引物扩增而得，其中每一探针均修饰有第二报告基团；

上述随机引物由9个核苷酸构成，每一核苷酸为a、t、c或g，且从5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通过spacer9连接修饰有荧光基团。

在本发明的一个优选实施方案中，所述5′端探针组的模板由rp11-78a18和rp11-436e17组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述3′端探针组的模板由rp11-7p17和rp11-984i17组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一报告基团为第一荧光报告基团。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第二报告基团为第二荧光报告基团。

本发明的另一技术方案如下：

一种检测fgfr2融合的fish试剂盒，包括上述fish探针组。

在本发明的一个优选实施方案中，包括fgfr2基因断裂探针体系，该fgfr2基因断裂探针体系由所述fish探针组、cot-1dna、2×杂交液和ddh2o组成，其中2×杂交液的配方中含有50％(v/v)甲酰胺和10％(w/v)硫酸葡聚糖，并以2×ssc溶液为溶剂。

进一步优选的，所述fgfr2基因断裂探针体系的组成如下表所示：

。

本发明的有益效果是：

1、本发明中的fgfr2基因断裂探针体系通过对肝内胆管癌组织切片或其他肿瘤组织切片进行常规处理后，采用双色断裂探针进行荧光原位杂交，根据观察到的荧光信号情况判断是否存在fgfr2基因融合，操作快速、简便，检测结果准确可靠，可准确检测出fgfr2基因所有融合类型(既包括已知的融合类型，也包括未知的融合类型)，为肝内胆管癌患者治疗方案提供参考依据，有利于患者个体化靶向治疗，减少药物副作用，提高患者生存质量，减轻家庭、社会负担，适于大规模推广应用。

2、本发明的fish探针设计巧妙、周全，5′端探针组和3′端探针组分别均由2个bac克隆标记得到，避免了单个bac克隆导致的信号强度弱和3个或以上bac克隆导致的信号背景高的缺点，探针特异性和敏感性高。

3、本发明的fish探针的5′端探针组和3′端探针组均采用了特定设计的随机引物法进行标记，与常规方法不同，本发明所用的随机引物经过了特殊的修饰，特殊的修饰指在随机引物的5′端第一个碱基或第五个碱基修饰一个荧光基团，并且荧光基团与被修饰的碱基之间通过spacer隔开，以避免修饰对标记反应的影响，通过这一修饰，使得标记得到的探针具有更高的荧光标记效率(即探针上每100bp所掺入的荧光染料更多)，常规的随机引物法标记效率在2-4个染料/100bp，本发明探针的标记效率在3-5个染料/100bp，标记效率提高约40％，从而产生更强的荧光信号。

附图说明

图1为本发明实施例3中的fgfr2基因融合检测的阴性结果图，可见细胞内有2个融合信号(或红绿紧邻)。

图2为本发明实施例3中的fgfr2基因融合检测的阳性结果图之一，可见细胞内有1个融合信号(或红绿紧邻)和1对红、绿分离信号。

图3为本发明实施例3中的fgfr2基因融合检测的阳性结果图之二，可见细胞内有1个融合信号(或红绿紧邻)和1个单独的5′端绿色信号。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

fgfr25′端探针组以2个bac克隆(rp11-78a18和rp11-436e17)为模板，3′端探针组以2个bac克隆(rp11-7p17和rp11-984i17)为模板，上述bac克隆均购自美国奥克兰儿童医院研究所。探针组的制作和标记步骤如下：

(1)在2个200μlpcr反应管中，分别按如下体系加入反应原料进行5′端探针组和3′端探针组的制作和标记：

上述随机引物由9个核苷酸构成，每一核苷酸为a、t、c或g，且从5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通过spacer9连接修饰有荧光基团；上述5×buffer的配方为：10mmtris-hcl、25mmmgcl2(氯化镁)，用ddh2o配制。

吹打混匀后，于pcr仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。

(2)避光环境下，在步骤(1)所得的物料中加入如下体系反应原料：

注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。5′端所用荧光基团与3′端所用荧光基团可以互换，相应的随机引物修饰的荧光基团也需要互换。

吹打混匀后，于pcr仪上37℃反应3.5h，加入2.5μl0.5medta，ph7.4终止反应。

(3)沉淀探针：向(2)加入2.75μl(1/10体积)3m乙酸钠(ph5.2)，再加入70μl-20℃预冷冻的无水乙醇(约2.5倍体积)，充分混匀后，用锡箔纸包住，-20℃沉淀2h或沉淀过夜(12-16h)。

(4)从-20℃取出探针，4℃、13000rpm离心20min，用移液枪小心吸弃上清，再加入200μl75％乙醇(-20℃预冷冻)，混匀，4℃、13000rpm离心20min，用移液枪小心吸弃乙醇，避光、室温通风橱中吹干10min。

(5)重悬探针组：加入5μlddh2o重悬探针沉淀(视沉淀量而定，若沉淀量较多，也可用10μlddh2o溶解)，分别得到5′端探针组和3′端探针组。

(6)标记效率和浓度测定：使用紫外分光光度分别检测5′端探针组和3′端探针组的标记效率和浓度。

(7)fgfr2基因断裂探针体系配制体系如下：

-20℃避光保存。

上述2×杂交液的配方中含有50％(v/v)甲酰胺和10％(w/v)硫酸葡聚糖，并以2×ssc溶液为溶剂。

实施例2

使用紫外分光光度计测定上述探针组中的探针的标记效率和浓度的步骤如下：

(1)打开紫外分光光度计(nanodrop)，选择全波长模式，并选择对应的波长，在空白校准后，分别测定5′端探针组的a260nm、adye(fitc：a494nm)和3′端探针组的a260nm、adyc(tetramethyl-rhodamine：a560nm)。

(2)由于荧光染料在260nm处也有一定的吸光值，为使探针在260nm处的吸光值更准确，使用以下公式校正a260的值：abase＝a260-(adye×cf260)，cf260指校正因子，是一个常数，每种荧光染料都有确定的cf260值，如tetramethyl-rhodamine的cf260值是0.06、fitc是0.32。(3)通过以下公式计算探针标记效率和浓度：探针标记效率＝100×(adye×εbase)÷(abase×εdye)，探针浓度＝(abase×mwbase)/(εbase×光径)×50ng/μl，其中ε指摩尔消光系数，如dsdna的值为6600(cm^-1·m^-1)、tetramethyl-rhodamine为89000(cm^-1·m^-1)、fitc为78000(cm^-1·m^-1)，dsdnamwbase为330，本实施例中，光径为0.1cm。

使用本实施例的标记方法和常规随机引物标记方法标记得到的5′端探针组和3′端探针组的标记效率和浓度如下表所示：

由上表可以看出，使用本实施例的标记的探针浓度与常规随机引物标记法没有明显差别，但探针的标记效率更高，平均可提高42％，因此可以产生更强的荧光信号。

实施例3

使用实施例1制得的fgfr2基因断裂探针体系对由医院提供的50例已知fgfr2基因融合结果的肝内胆管癌样本进行检测，检测步骤如下：

(1)样本脱蜡、复水：将组织切片样本依次浸入3缸二甲苯中脱蜡，每次10min，然后依次在100％、100％、100％、85％和70％乙醇中浸泡3min，最后浸入去离子水中3min。

(2)样本预处理和消化：将组织切片样本在100℃水中煮20min，取出样本用胃蛋白酶消化10min，转移到2×ssc溶液中浸泡3min，取出样本依次浸入70％、85％和100％乙醇脱水，每次3min，取出样本自然晾干。

(3)样本与探针杂交：用移液枪取10μlfgfr2基因断裂探针体系加到样本上，盖上盖玻片，注意避免产生气泡，用封片胶封住盖玻片。置于原位杂交仪中，85℃变性5min，37℃杂交过夜(12-16h)。

(4)洗涤：取出样本，用镊子小心移去盖玻片，将样本浸入2×ssc溶液中浸泡5min，再浸入46℃的0.1％np-40洗涤液中洗涤7min，然后将样本依次浸入70％、85％和100％乙醇脱水，每次3min，取出样本自然晾干。

(5)复染：取10μldapi复染液加到样本上，盖上盖玻片，复染15min。

(6)镜下分析：在荧光显微镜下，分别用fitc滤光块和罗丹明滤光块观察绿色信号和红色信号，利用双通道滤光块观察红绿信号分离情况。选择细胞轮廓清晰、背景良好、杂交信号强的区域的50个肿瘤细胞进行结果判读，并记录和拍照。

(7)结果判读：如图1至3所示，在正常的细胞中，可见两个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，在异常的细胞中，有三种信号模式，第一种是可见零个或一个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，以及一对或多对红、绿分离信号(红绿信号距离≥2个信号直径视为分离，否则视为融合信号)，第二种是可见一个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，以及单独的5′端信号，第三种是可见零个或一个或多个融合信号(或红绿信号紧邻)，以及单独的5′端信号伴一对或多对红、绿分离信号。当异常细胞比例≥15％时判为阳性。

检测结果加下表所示：

使用实施例1制得的fgfr2基因断裂探针体系检测了50例已知fgfr2基因融合结果的肝内胆管癌样本，结果均一致，说明本发明的特异性和灵敏性均为100％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。