一种用于科研实验的体外物质的培养方法与流程

本发明涉及精准医疗及细胞生物领域尤其涉及一种用于科研实验的体外物质的培养方法。

背景技术：

乳腺癌是中国女性最常见的癌症。发病率为21.6/10万人，根据《中国肿瘤年报》数据，每年新发乳腺癌病例46600例。虽然目前治疗手段多样，包括手术治疗、靶向治疗等治疗方法都取得了一定的效果，但在治疗方案的选择和临床疗效的预测上仍有一定的盲目性。

主要的原因在于，乳腺癌是一种复杂的异质性疾病，按照特殊基因表达的不同可以归类为不同亚型，在临床表现、治疗预后及对药物的反应上都有显著的差异。例如，乳腺癌的新辅助治疗后未达到临床病理缓解（pcr）的患者，通常占到全部的70%-90%，这些残余肿瘤虽然各有不同的生物学特征，目前却只能一视同仁地开展后续系统治疗，这种一刀切的治疗模式并不符合精准医疗、个体化治疗发展的需要。

临床研究也提示，同一乳腺癌患者的肿瘤在新辅助治疗前后的受体状态和克隆结构发生了变化，一部分配对的乳腺癌原发灶和转移灶的受体状态可能发生改变，提示新辅化疗后hr转阴或者转换为三阴性表型均提示预后较差，称为瘤内异质性。因此，只靠数量有限的样本分析得出的临床方案，无法事先有效预测充和分评估临床治疗方案对个体的疗效。这也是目前肿瘤临床治疗所面临的困境之一。

因此，建立一种能够准确预测患者对肿瘤化疗药物反应的体外模型，在体外进行药物反应的测试，将能够给临床方案的制定带来有价值的参考，同时，也可以减少在患者体内盲目测试所带来的副作用，最大程度保护患者的健康。

传统方法使用乳腺癌患者的肿瘤组织样本中直接进行原代细胞培养的成功率较低，无法满足临床研究和疗效预测的要求。并且传统的二维培养方式与体内环境有很大的不同，不能很好的模拟体内的三维环境，体外模型与患者的实际情况有很大差异，因此缺少更广泛的应用价值。

基于目前现状，非常有必要建立一种全新的乳腺癌样本体外培养系统，为肿瘤基础研究和临床治疗方案评估提供全新的体外模型和评估途径。

在体外利用组织样本在适宜条件下可以培养获得三维结构被称为类器官(organoid)。类器官由组织分化而来，与组织细胞含有相同的遗传信息特征。基于患者自体肿瘤来源的体外类器官模型具有肿瘤遗传稳定性好，与在体肿瘤基因表达完全一致，可以长期培养建库，可以进行高通量筛选，既能准确模拟体内组织结构及生理学过程又能连续传代，可连续培养1年以上稳定传代并保持稳定的表型等等优势，是目前进行体外药敏检测的最佳工具。可以直观的了解肿瘤对药物治疗的敏感性及耐药克隆的产生，为术后辅助治疗提供客观的参考依据。

一般的类器官培养方法对于乳腺癌类器官培养成功率较低、成本高、培养时间长、一致性较低。因此迫切需要开发一种操作简单、成功率高、系统稳定的乳腺癌类器官的体外培养方法。

技术实现要素：

发明的目的：为了提供一种效果更好的用于科研实验的体外物质的培养方法，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。

为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：

一种用于科研实验的体外物质的培养方法，其特征在于，包含如下方法和步骤：

1)对脱离人体的患者来源乳腺癌组织的处理：对乳腺癌新鲜样本组织进行处理；剪碎后进行胶原酶消化；获得乳腺癌原代细胞；

2)乳腺癌原代细胞体外培养：将所述乳腺癌原代细胞与类器官培养基混合；固化后加入乳腺癌类器官培养液进行培养，获得所述乳腺癌类细胞团。

本发明进一步技术方案在于，所述乳腺癌类器官培养液包括有egf、fgf生长因子、alk抑制剂a8301、noggin、hepes缓冲液、y27632、wnt信号通路相关分泌蛋白家族r-spondin1~4中的一种或多种。

本发明进一步技术方案在于，所述乳腺癌类器官培养液为含有0.1~1.0%hepes、0.1~1.0%glutamax、0.1~1%青霉素-链霉素的advanceddmem/f12培养液。

本发明进一步技术方案在于，所述乳腺癌类器官培养液为含有0.1~1%青霉素、0.1~1%链霉素、0.5~50ng/mlegf、0.5~50ng/mlfgf、0.5~50ng/mlnoggin、0.2~20mmhepes、50~500nma8301、0.1~1.0μg/mlr-spondin3、0.5~5μmy-27632、0.5~5μmsb202190、b27、1~3mmglutamax的advanceddmem/f12培养基。

本发明进一步技术方案在于，将所述乳腺癌原代细胞与类器官培养基混合时，细胞的密度为1～5×10⁶细胞/ml；每1μl类器官培养基加入10μl乳腺癌类器官培养液进行培养；还包含如下步骤，培养7-28天后可以进行传代，按1~5×10⁴细胞/微升接种，传代后即获得所述的乳腺癌类器官。

本发明进一步技术方案在于，所述类器官培养基为growthfactorreducedbmetype2培养基；所述胶原酶消化为在所述组织块中加入含有0.2~2mg/ml胶原蛋白酶酶的乳腺癌类器官培养液，在37℃摇床孵育60~120分钟。

本发明进一步技术方案在于，所述胶原酶消化之后，用5~10毫升一次性塑料移液管吹打30次，将细胞团块吹打开，用100μm孔径的过滤网过滤，离心收集乳腺癌原代细胞，并用乳腺癌类器官培养液-1洗涤和重悬。

一种用于科研实验的体外物质的培养方法，其特征在于，

目前为室温操作(20-25℃)，实施例中使用的试剂原料及原料配置如下：

life^òegf：使用pbs溶至100μg/ml浓度原液，-20℃保存；

sigma^òsb202190，2～8℃保存，使用dmso溶至10mg/ml浓度；

r&dsystem^òrecombinanthumanr-spondin3，-20～-70℃保存，使用时用pbs配置浓度0.1mg/ml；

gibco^òadvanceddmem/f12培养液，4℃保存；

gibco^òfbs（胎牛血清），4℃保存，使用前与类器官培养液按比例混合；

1)gibco^òb-27^tmsupplement（50x），4℃保存，使用前加至培养液到终浓度1x；

gibco^òhepes缓冲液，2～8℃保存，终浓度为25mm；

gibco^òglutamax^tm-i（100x），200mm浓度原液，4℃保存；

2)peprotech^ònoggin：使用pbs溶至50μg/ml浓度原液，-20℃保存；

abmole^òy-27632，调整浓度为10mm，-20℃保存；

tocris^òa83-01，-20℃保存，使用dmso调整浓度为50mm；

invitrogen^òpenicillin-streptomycin，1000x浓度原液用时加至培养液到1x；

基于以上物质，乳腺癌类器官的体外培养方法，包括：

1)患者来源乳腺癌组织的处理：

来源于乳腺癌患者的手术切除癌症组织或活检获取的样本组织，使用pbs清洗样本组织，用组织剪剪切成1～3mm³大小的组织块，加入含有2mg/ml胶原蛋白酶酶的乳腺癌类器官培养液-1，在37℃摇床孵育60~120分钟，用10毫升一次性塑料移液管上下吹打30次以上，尽量将细胞团块吹打开；过滤后获得乳腺癌原代细胞，重悬在乳腺癌类器官培养液-1中；

2)乳腺癌原代细胞体外培养；

将乳腺癌原代细胞与bme类器官培养基混合，固化后加入乳腺癌类器官培养液-2进行培养，培养7～28天后进行传代，稳定传代即获得所述的乳腺癌类器官。

利用如上任意一项所述的体外物质在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。

利用如上任意一项所述的体外物质在用于药物测试物质中的用途。

采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：操作简单、成功率高、系统稳定，可以用于广泛的药物测试和科学研究以及模型建立等。

附图说明

为了进一步说明本发明，下面结合附图进一步进行说明：

图1-图2：本发明乳腺癌类器官形态图；

图3-图4：乳腺癌类器官的荧光染色显示，乳腺癌患者类器官具有乳腺癌特异性的蛋白表达。（光学显微镜）；

图5-图6：乳腺癌类器官的荧光染色显示，乳腺癌患者类器官具有乳腺癌特异性的蛋白表达。（荧光显微镜）；

图7：乳腺癌类器官的培养存成功率图；

图8为部分术语的解释。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。。

本专利提供多种并列方案，不同表述之处，属于基于基本方案的改进型方案或者是并列型方案。每种方案都有自己的独特特点。

本发明提供了一种患者来源乳腺癌组织样本类器官的体外培养方法，该方法包括：

患者来源乳腺癌组织的处理：对乳腺癌新鲜样本组织进行处理；剪碎后进行胶原酶消化；获得乳腺癌原代细胞；

乳腺癌原代细胞体外培养：将乳腺癌原代细胞与类器官培养基混合；固化后加入乳腺癌类器官培养液进行培养，获得乳腺癌类器官。

进一步地，在乳腺癌类器官的体外培养方法中，乳腺癌类器官培养液至少包括有egf、fgf生长因子、alk抑制剂a8301、noggin、hepes缓冲液、y27632、wnt信号通路相关分泌蛋白家族r-spondin1~4中的一种或多种。

进一步地，乳腺癌类器官培养液为含有0.1~1%青霉素、0.1~1%链霉素、0.5~50ng/mlegf、0.5~50ng/mlfgf、0.5~50ng/mlnoggin、0.2~20mmhepes、50~500nma8301、0.1~1.0μg/mlr-spondin3、0.5~5μmy-27632、0.5~5μmsb202190、b27、1-3mmglutamax的advanceddmem/f12培养基。

优选的，乳腺癌类器官培养液为含有1%青霉素、1%链霉素、0.5~50ng/mlegf、50ng/mlfgf、50ng/mlnoggin、20mmhepes、500nma8301、1.0μg/mlr-spondin3、5μmy-27632、5μmsb202190、1%b27、1mmglutamax的advanceddmem/f12培养基。

使用上述乳腺癌类器官培养液能够高效、稳定的培养乳腺癌类器官，其培养成功率可以达到85%~95%.

进一步地，将乳腺癌原代细胞与类器官培养基混合时，按照细胞密度为1～5×10⁶细胞/ml、每1μl类器官培养基加入10μl乳腺癌类器官培养液进行培养时，乳腺癌类器官的成活率最高。

进一步地，培养7-28天后可以进行传代，按1~5×10⁴细胞/微升接种，传代后即获得所述的乳腺癌类器官。

进一步地，所述类器官培养基为growthfactorreducedbmetype2培养基。

进一步地，所述胶原酶消化为在所述组织块中加入含有0.2~2mg/ml胶原蛋白酶酶的乳腺癌类器官培养液-1，在37℃摇床孵育60~120分钟。

进一步地，所述胶原酶消化之后，用5~10毫升一次性塑料移液管吹打30次，将细胞团块吹打开，用100μm孔径的过滤网过滤，离心收集乳腺癌原代细胞，并用乳腺癌类器官培养液-1洗涤和重悬。

采用本发明的获得体外培养的乳腺癌类器官的方法，具有操作简便、培养时间短、细胞生长稳定、原代培养成功率高的优势。可以利用来源于患者的乳腺癌活检组织样本、手术中切除的乳腺癌组织，在较短时间内获得乳腺癌类器官。

其中，特定的乳腺癌类器官培养液、特点的类器官培养基成分及乳腺癌原代细胞与类器官培养基混合时的细胞密度，能有效提高类器官培养成功率，成功率达到85%~95％以上。得到的乳腺癌类器官具有三维结构，极大保留了患者肿瘤组织特有的形态学特征，与患者乳腺癌活检组织的病理学特征高度一致。在体外培养环境下，所得到的乳腺癌类器官可以进行扩增和传代。产生的新一代类器官仍然保持原有肿瘤细胞的遗传特征和组织结构特征。

因此，本发明为乳腺癌基础研究和临床研究、化疗方案筛选、药物反应的预测、建立基于患者的类器官样本库和开展高通量抗肿瘤药物筛选提供了新的基础。

以下将结合实施例对本发明进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。

本实施例实验操作条件均为室温操作(20-25℃)。实施例中使用的试剂原料及原料配置如下：

3)life^òegf：使用pbs溶至100μg/ml浓度原液，-20℃保存；

4)sigma^òsb202190，2～8℃保存，使用dmso溶至10mg/ml浓度；

5)r&dsystem^òrecombinanthumanr-spondin3，-20～-70℃保存，使用时用pbs配置浓度0.1mg/ml；

6)gibco^òadvanceddmem/f12培养液，4℃保存；

7)gibco^òfbs（胎牛血清），4℃保存，使用前与类器官培养液按比例混合；

8)gibco^òb-27^tmsupplement（50x），4℃保存，使用前加至培养液到终浓度1x；

9)gibco^òhepes缓冲液，2～8℃保存，终浓度为25mm；

10)gibco^òglutamax^tm-i（100x），200mm浓度原液，4℃保存；

11)peprotech^ònoggin：使用pbs溶至50μg/ml浓度原液，-20℃保存；

12)abmole^òy-27632，调整浓度为10mm，-20℃保存；

13)tocris^òa83-01，-20℃保存，使用dmso调整浓度为50mm；

14)invitrogen^òpenicillin-streptomycin，1000x浓度原液用时加至培养液到1x。

乳腺癌类器官的体外培养方法，包括：

3)患者来源乳腺癌组织的处理：

来源于乳腺癌患者的手术切除癌症组织或活检获取的样本组织，使用pbs清洗样本组织，用组织剪剪切成1～3mm³大小的组织块，加入含有2mg/ml胶原蛋白酶酶的乳腺癌类器官培养液-1，在37℃摇床孵育60~120分钟，用10毫升一次性塑料移液管上下吹打30次以上，尽量将细胞团块吹打开。过滤后获得乳腺癌原代细胞，重悬在乳腺癌类器官培养液-1中。

4)乳腺癌原代细胞体外培养

将乳腺癌原代细胞与bme类器官培养基混合，固化后加入乳腺癌类器官培养液-2进行培养，培养7～28天后进行传代，稳定传代即获得所述的乳腺癌类器官。

优选地，所述类器官培养基为cultrex^ògrowthfactorreducedbmetype2培养基，将1～5x10⁴个乳腺癌原代细胞与40微升类器官培养基混合；于37℃培养箱10-20分钟。

乳腺癌类器官培养液-1、2至少包括有丝分裂生长因子、wnt信号通路相关分泌蛋白家族、rock抑制剂、bmp抑制剂、p38激酶抑制剂；有丝分裂生长因子为egf、fgf中的一种或两种；wnt激动剂为r-spondin1-4中的一种或多种；alk抑制剂为a8301、y-27632中的一种或两种；bmp抑制剂为noggin；p38激酶抑制剂是sb202190。

优选地，乳腺癌类器官培养液-1、2为含有有丝分裂生长因子、wnt激动剂、alk抑制剂、bmp抑制剂、p38激酶抑制剂、b27、hepes、glutamax、青霉素-链霉素、fbs的advanceddmem/f12培养液；

更优选地，乳腺癌类器官培养液-1为含有0.1-1.0%hepes、0.1-1.0%glutamax、500u/ml青霉素-链霉素的advanceddmem/f12培养液，所述乳腺癌类器官培养液-2为含有0.1~1%青霉素、0.1~1%链霉素、0.5~50ng/mlegf、0.5~50ng/mlfgf、0.5~50ng/mlnoggin、0.2~20mmhepes、50~500nma8301、0.1~1.0μg/mlr-spondin3、0.5~5μmy-27632、0.5~5μmsb202190、b27、1~3mmglutamax的advanceddmem/f12培养基。

实施例1

1)患者来源乳腺癌组织的处理：

来源于乳腺癌患者的手术切除癌症组织或活检获取的样本组织，使用预冷到4℃的pbs清洗样本组织，至上清液清澈干净后，在培养皿中用组织剪将样本剪切成1～3mm³大小的组织块，加入5～15ml含有2mg/ml胶原蛋白酶酶的乳腺癌类器官培养液-1，在37℃摇床孵育60~120分钟，用10毫升一次性塑料移液管上下吹打30次以上，尽量将细胞团块吹打开。用100微米孔径的过滤网过滤，获得乳腺癌原代细胞。

400rcf离心10分钟后，小心移除上清液，加入10ml乳腺癌类器官培养液-1，上下吹打5～10次，细胞计数，即获得可以用于类器官培养的乳腺癌原代细胞，以进入下一步乳腺癌类器官培养。

2)乳腺癌原代细胞体外培养

提起将-20℃冻存的类器官bme培养基放置于冰上，等其融化后，将乳腺癌原代细胞与bme类器官培养基混合，按照5x10⁴个细胞/40微升类器官培养基的比例混合，取40微升混合好的细胞种入24孔细胞培养皿中，此过程保持在冰上操作。

将培养皿放入37℃培养箱20分钟，固化后加入新鲜配制的200微升乳腺癌类器官培养液-2进行培养，放入37℃培养箱培养。乳腺癌类器官培养液-2为含有1%青霉素、1%链霉素、50ng/mlegf、50ng/mlfgf、50ng/mlnoggin、20mmhepes、500nma8301、1.0μg/mlr-spondin3、5μmy-27632、5μmsb202190、b27、3mmglutamax、8%fbs的advanceddmem/f12培养基。培养7～28天后进行传代，稳定传代即获得所述的乳腺癌类器官。

培养7-10天后进行传代，按5000～20000细胞/孔/每40μl培养基种入24孔板内，稳定传代即获得所述的乳腺癌类器官。

乳腺癌原代细胞在经过1-4周的培养后，可在4x10显微镜下看到类器官生成（图1）。通过该方法，培养的成功率可以达到95％以上（图7），极大保留了患者肿瘤组织特有的形态学特征。

实施例2

1)患者来源乳腺癌组织的处理：

来源于乳腺癌患者的手术切除癌症组织或活检获取的样本组织，使用预冷到4℃的pbs清洗样本组织，至上清液清澈干净后，在10cm培养皿中用组织剪将样本剪切成3mm³大小的组织块，加入20ml含有2mg/ml胶原蛋白酶酶的乳腺癌类器官培养液-1，在37℃摇床孵育120分钟，用10毫升一次性塑料移液管上下吹打30次以上，尽量将细胞团块吹打开。用100微米孔径的过滤网过滤，获得乳腺癌原代细胞。

400rcf离心10分钟后，小心移除上清液，加入10ml乳腺癌类器官培养液-1，上下吹打10次，细胞计数，即获得可以用于类器官培养的乳腺癌原代细胞，以进入下一步乳腺癌类器官培养。

2)乳腺癌原代细胞体外培养

提起将-20℃冻存的类器官bme培养基放置于冰上，等其融化后，将乳腺癌原代细胞与bme类器官培养基混合，按照2x10⁴个细胞/40微升类器官培养基的比例混合，取40微升混合好的细胞种入24孔细胞培养皿中，此过程保持在冰上操作。

将培养皿放入37℃培养箱15分钟，固化后加入新鲜配制的200微升乳腺癌类器官培养液-2进行培养，放入37℃培养箱培养。乳腺癌类器官培养液-2为含有1%青霉素、1%链霉素、50ng/mlegf、50ng/mlfgf、50ng/mlnoggin、20mmhepes、500nma8301、1.0μg/mlr-spondin3、5μmy-27632、5μmsb202190、b27、3mmglutamax、8%fbs的advanceddmem/f12培养基。培养14天后进行传代，稳定传代即获得所述的乳腺癌类器官。

培养14天后进行传代，按20000细胞/孔/每40μl培养基种入96孔板内，稳定传代即获得所述的乳腺癌类器官。

乳腺癌原代细胞在经过1-4周的培养后，可在4x10显微镜下看到类器官生成且具有明显的三维结构（图1）。通过该方法，培养的成功率可以达到90％以上（图7），极大保留了患者肿瘤组织特有的形态学特征(图2)。经过荧光染色观察，可以看到所得所得到的乳腺癌类器官具有三维结构，并且与原发肿瘤组织结构和蛋白表达高度一致（图3-6）。

对比例

使用常规的乳腺癌类器官培养方法，即：将乳腺癌活检组织样本用pbs漂洗直至上清液干净。用含有dmem、2.5％fbs、1%青霉素/链霉素、胶原蛋白酶的消化液在37℃消化60分钟，离心后弃上清液，即获得原代细胞，将原代细胞用dmem培养夜重悬至1x10⁶/毫升，包埋在25μlmatrigel中。所用细胞培养液是含有、n-乙酰半胱氨酸、egf、r-spondin-3、a8301、noggin、sb202190的dmem/f12培养液，一般在15天左右传代。

上述技术的类器官培养成功率不到80％（图7）。实施例1、2中的方法至少将乳腺癌类器官的培养成功率提高了10～15％。

本专利的体外物质为细胞团，本专利的器官的二字表述能够替换为类器官或者是细胞团物质。

开创性地，以上各个效果独立存在，还能用一套结构完成上述结果的结合。

需要说明的是，本专利提供的多个方案包含本身的基本方案，相互独立，并不相互制约，但是其也可以在不冲突的情况下相互组合，达到多个效果共同实现。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。