一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体的制作方法

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的羰基还原酶突变体。

背景技术：

羰基还原酶(carbonylreductase，ec1.1.1.x)是氧化还原酶(oxidoreductases)家族中的成员之一，是指能够催化还原羰基生成相应的醇或其逆反应的一类氧化还原酶，其反应的本质为底物和供氢体之间氢或电子的转移。手性醇是一类重要的有机合成砌块，在医药、农业、食品和化工等行业都有很高的应用价值，而羰基还原酶能够催化羰基的不对称还原生成相应的手性醇。

随着工业生物技术和蛋白质工程技术的发展，目前羰基还原酶在手性醇工业生产中的应用已十分广泛。为了适应工业环境下的应用范围，对羰基还原酶的酶学性能提出了更高的要求。其中热稳定性是评价工业生物催化剂的一个重要指标，提高反应温度，可以提高转化率、提升底物可溶性、增加操作弹性等。由于天然蛋白质通常不能承受恶劣的工业环境，大多数只能在温和条件下发挥作用，因此提高酶的热稳定性以使其适应工业应用具有重要意义。分子改造、化学修饰和物理修饰成为目前提高酶热稳定性的三个主要策略。

其中，分子改造是提高酶热稳定性的有效手段之一。在了解酶蛋白结构与功能关系的基础上，通过理性设计，利用定点突变或饱和突变等手段可以快速改造酶蛋白。目前应用比较成功的理性设计方法主要包括同源比对、脯氨酸效应设计、基于二硫键设计和表面电荷优化等。已有许多学者运用这些技术成功地改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展。

羰基还原酶chkred12能够催化度洛西汀手性醇中间体(中国专利，cn104830924a)，以及手性单羟基衍生化的1,2-醇类化合物(中国专利，cn108753851a)等，且能够耐受较高的底物浓度、具有较高的催化效率，是一个很有潜力的酶，然而其热稳定性较差，限制了工业应用。因此，通过分子改造提高该酶的耐热性，具有重要的实际应用价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：羰基还原酶chkred12热稳定性差的问题。为此，本发明公开了一种羰基还原酶chkred12热稳定性提高的突变体。

该突变体具有如下特征：

以seqidno.2为出发序列，将第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(s79p)，或者将第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(l128m)，或者将第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v162i)，或者将第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(g163a)，或者以上四个位点的任意组合得到的突变体。

根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

本发明的技术方案为：

以理性设计的方法，识别羰基还原酶chkred12(氨基酸序列为seqidno.2)热稳定性相关的氨基酸位点，利用定点突变技术进行单点突变和组合突变，从而得到热稳定性提高的突变体酶。

本发明的具体步骤为：

(1)羰基还原酶chkred12热稳定性相关位点的预测：该酶的基因序列和氨基酸序列已公开(基因序列ncbi登录号为kc342012；氨基酸序列ncbi登录号为ahc30850.1，即seqidno.2)。

fireport预测热稳定性位点：将羰基还原酶chkred12的氨基酸序列提交至在线网站swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org)进行同源建模，获得羰基还原酶chkred12的三维模型，再将三维模型提交至fireport(https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprot/)进行热稳定性相关氨基酸位点预测。从预测的众多突变子中经过各参数的比较分析，最终选择了最有潜力的4个突变子(s79p，l128m，v162i和g163a，见说明书附图1)，构建热稳定性突变体。

(2)突变体构建和热稳定性验证：利用定点突变技术，以pet-28a-chkred12基因为模板，构建单点突变质粒。本发明也可以根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的基因序列为模板(基因序列见seqidno.1，氨基酸序列不变)，实施例中以优化后的序列seqidno.1为模板来详细说明本发明的具体方案。

将突变体质粒以化学法转入大肠杆菌dh5α，送于上海生工生物工程股份有限公司测序，将测序正确的质粒转入表达菌株大肠杆菌bl21(de3)，并挑取单克隆诱导表达蛋白，而后冷冻离心收集菌体，加入磷酸钾缓冲液(0.1m、ph8.0)重悬菌体，混匀后超声波破碎细胞。冷冻离心，取适量上清粗酶液用于生物催化反应，以3-氧-3-(2-噻吩)丙酰乙酯为底物，反应适当时间测定酶活。同时，另取等量的上清液于不同温度热处理一定时间，以相同的方法测定残余活性。再以未经过高温处理的粗酶液的酶活为参比，得到残余酶活百分比。详细方案见实施例1和2。

经上述理性设计获得了4个热稳定性提高的突变体，分别为s79p，l128m，v162i和g163a，其特征如下：

s79p：第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(dna序列由agc变为ccg)；

l128m：第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由tta变为atg)；

v162i：第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(dna序列由gtg变为att)；

g163a：第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(dna序列由ggg变为gca)。

以上4个突变体(s79p，l128m，v162i和g163a)热稳定性相比母本均有不同程度的提高。其中，s79p和l128m热稳定性提高最大，在50℃热处理1.5h，s79p和l128m仍保留80％以上的相对酶活性，而野生型在相同温度下热处理1.5h，仅保留37％的相对酶活性。s79p在50℃热处理3h，仍保留68％的相对酶活性，在4个突变体中热稳定性最好。

(3)4个位点的整合：

通过上述(1)突变获得的4个有益突变位点，分别为s79p，l128m，v162i和g163a，以热稳定性最好的s79p为模板，利用定点突变技术，构建多位点组合突变体。优选构建以下组合突变体：m722、m723、m7234，其特征如下：

m722：第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(dna序列由agc变为ccg)、第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由tta变为atg)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(dna序列由gtg变为att)。

m723：第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(dna序列由agc变为ccg)、第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由tta变为atg)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(dna序列由ggg变为gca)。

m7234:第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(dna序列由agc变为ccg)、第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由tta变为atg)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(dna序列由gtg变为att)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(dna序列由ggg变为gca)。

这3种组合突变体的热稳定性与单点突变体相比又有进一步提高。55℃热处理1.5h，m722的相对酶活为85％、m723的相对酶活为75％、m7234的相对酶活力保持在90％以上，而野生型在55℃热处理1.5h基本失活。m7234在55℃热处理3h，仍可保持高达90％的相对酶活性。

本发明有益效果：上述所有突变体与母本相比，热稳定性均有大幅度提高，且酶的活性基本未受到影响，这些突变体能够在较高温度下进行工业生产，利于生产工艺的灵活性，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1fireport热稳定性突变子预测结果。

图250℃条件下，单点突变体与野生型热稳定性比较。“◇”表示chkred12的热稳定性曲线，“■”表示s79p的热稳定性曲线，“▲”表示l128m的热稳定性曲线，“◆”表示v162i的热稳定性曲线，“●”表示g163a的热稳定性曲线。

图355℃条件下，多位点突变体热稳定性比较。“●”表示m722的热稳定性曲线，“■”表示m723的热稳定性曲线，“▲”表示m7234的热稳定性曲线，“◇”表示chkred12的热稳定性曲线。

具体实施方法

以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。

实施例14个单点突变体的构建

理性设计方法对潜在耐热性位点预测的结果见说明书附图1。单点突变体s79p，l128m，v162i和g163a均以羰基还原酶chkred12密码子优化后的基因seqidno.1为模板进行构建，所用引物：

s79p-f:5′–ggatgcgaatccgagcgccgtgg–3′

s79p-r:5′–ccacggcgctcgattcgcatcc–3′

l128m-f:5′–ctttatccagaaaatgctgcgtaac–3′

l128m-r:5′–gttacgcagcattttctggataaag–3′

v162i-f:5′–ggcgcgctgattggggcgacc–3′

v162i-r:5′–ggtcgccccaatcagcgcgcc–3′

g163a-f:5′–ggcgcgctggtggcagcgaccaaagc–3′

g163a-r:5′–gctttggtcgctgccaccagcgcgcc–3′

pcr条件为：5×hfbuffer10μl，mgcl2(1mm)1μl，引物(50ng/μl)各1.5μl，dntp(2.5mm)4μl，phu(1u)1μl，质粒50ng，超纯水补足50μl，条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共25个循环，再72℃延伸10min。pcr产物用1μldpni，37℃处理1h。取dpni消化的pcr产物10μl，化学法转入大肠杆菌dh5α。送于上海生工生物工程股份有限公司测序，测序正确后，提取质粒转入表达菌株大肠杆菌bl21(de3)。

实施例2粗酶液制备及酶活力的测定

2.1粗酶液的制备

将实施例1中各个突变体质粒，化学法转入大肠杆菌表达菌株bl21(de3)，涂布含有卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃过夜培养，挑取单克隆于10ml含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，180rpm，过夜培养。以1％的接种量接种于200ml含有卡那霉素(50μg/ml)的tb培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mmiptg，30℃诱导18h后，5000rpm、4℃离心10min，弃上清，菌体用生理盐水清洗两次，再加入15ml浓度为0.1m的磷酸钾缓冲液(ph8.0)重悬菌体，以超声波破碎细胞(工作条件：工作时间3s，间歇时间3s，工作次数99，功率200w)，细胞破碎液12000rpm，4℃离心20min，取上清粗酶液用于反应。

2.2粗酶活力的测定

粗酶活力测定反应条件见表1，以葡萄糖脱氢酶gdh进行辅酶循环。反应体系于40℃温浴5min，最后加入终浓度为10mg/ml(总蛋白浓度)的粗酶液，40℃、150rpm反应3h。

反应结束后，加入1ml的乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，gc检测。检测方法为：程序升温，柱温初始温度为110℃，保持5min，再以35℃/min升温速度至180℃，保持5min。底物保留时间5.719min，产物(s)-hees保留时间为11.152min。

表1粗酶反应体系

2.3热稳定性的测定

将总蛋白浓度50mg/ml的粗酶液100μl置于容量250μl的pcr管，在50℃条件下热处理1.5h，间隔一定时间取样，迅速放置冰上冷却，取热处理后的粗酶液测定残余活性，参照实施例2.2粗酶活力测定。再以未经过高温处理的粗酶液为参比，得到残余相对酶活性。

本轮突变获得4个突变体s79p，l128m，v162i和g163a。野生型与突变体对底物的转化率以及相对酶活性见表2和说明书附图2。50℃热处理1.5h，野生型仅保留37％的相对酶活性，而突变体s79p，l128m，v162i和g163a保留80％以上的相对酶活性。

表2野生型和突变体的转化率及相对酶活力

a所有数值均由粗酶液测定

实施例3构建多位点组合突变体

3.1突变体m722的构建

定点突变方法将突变体s79p的第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由tta变为atg)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(dna序列由gtg变为att)，构建突变体m722，所用的引物如下：

l128m-f:5′–ctttatccagaaaatgctgcgtaac–3′

l128m-r:5′–gttacgcagcattttctggataaag–3′

v162i-f:5′–ggcgcgctgattggggcgacc–3′

v162i-r:5′–ggtcgccccaatcagcgcgcc–3′

pcr条件以及操作同实施例1，得到新突变体m722。

3.2突变体m723的构建

定点突变方法将突变体s79p的第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由tta变为atg)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(dna序列由ggg变为gca),构建突变体m723，所用的引物如下：

l128m-f:5′–ctttatccagaaaatgctgcgtaac–3′

l128m-r:5′–gttacgcagcattttctggataaag–3′

g163a-f:5′–ggcgcgctggtggcagcgaccaaagc–3′

g163a-r:5′–gctttggtcgctgccaccagcgcgcc–3′

pcr条件以及操作同实施例1，得到新突变体m723。

3.3突变体m7234的构建

定点突变方法将突变体s79p的第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(dna序列由tta变为atg)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(dna序列由gtg变为att)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(dna序列由ggg变为gca)，所用的引物如下：

l128m-f:5′–ctttatccagaaaatgctgcgtaac–3′

l128m-r:5′–gttacgcagcattttctggataaag–3′

v162i-g163a-f:5′–gcgaaaggcgcgctgattgcagcgaccaaagctctgg–3′

v162i-g163a-r:5′–ccagagctttggtcgctgcaatcagcgcgcctttcgc–3′

pcr条件以及操作同实施例1，得到新突变体m7234。

3.4组合突变体热稳定性测定

将总蛋白浓度50mg/ml的粗酶液100μl置于容量250μl的pcr管，在55℃水浴处理1.5h，然后将样品管放置于冰上冷却，测定方法见2.2。以未经过高温处理的酶液为参比，得到酶相对活力。

与热稳定性最高的单点突变体s79p相比，组合突变体m722、m723和m7234热稳定性均有不同程度提高。其中，突变体m7234的热稳定性提高幅度最大。组合突变体对底物的转化率以及相对酶活性见表3和说明书附图-3。55℃热处理1.5h，m722的相对酶活为85％、m723的相对酶活为75％、m7234的相对酶活为90％)，而野生型在55℃热处理1.5h基本失活。

表3组合突变体和母本的相对酶活力及转化率

a所有数值均由粗酶液测定。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>732

<212>dna

<213>chryseobacteriumsp.

<400>1

atgaaatgcgcgataattaccggcggaagccgtggcattggccgtgcgatttgcattaag60

ctggcggaggaaaagaattatcatattctgattaactatacctcaaatgagactgccgct120

cgtgaaaccctggcgaaggtggaagagttaggcgcaacaggcgaaattctgaaatttgat180

gtgggtaacgcggaagagacgaaagcggtgctgaccgaatggcaggatgcgaatagcagc240

gccgtggtggaggtgatcgtgaataatgcgggcattacacgtgatggcctgtttatgtgg300

atgccgagcgaagattggaatagcgtcattaataccagcctgaatggcttcttcaacgtg360

acgaacttctttatccagaaattactgcgtaacaaatatggccgtattatcaatatggtg420

agcgtgagcggtgtaaagggcactgcgggtcaaaccaattatagcgcagcgaaaggcgcg480

ctggtgggggcgaccaaagctctggcgcaggaagtcgcgaaacgtaatatcactgtgaat540

gcggtggctccgggttttatcaaaacggatatgacccaggagtttaatgaagatgaactg600

aaaggcatgattccggcgaaccgtttcggggaagctgaggaggtggcggatttagtggcg660

tttctggcgagcaagaaagcgagctacataacgggcgaagtgatcaacataaatgggggc720

atttattcttaa732

<210>2

<211>243

<212>prt

<213>chryseobacteriumsp.

<400>2

metlyscysalaileilethrglyglyserargglyileglyargala

151015

ilecysilelysleualagluglulysasntyrhisileleuileasn

202530

tyrthrserasngluthralaalaarggluthrleualalysvalglu

354045

gluleuglyalathrglygluileleulyspheaspvalglyasnala

505560

glugluthrlysalavalleuthrglutrpglnaspalaasnserser

65707580

alavalvalgluvalilevalasnasnalaglyilethrargaspgly

859095

leuphemettrpmetprosergluasptrpasnservalileasnthr

100105110

serleuasnglyphepheasnvalthrasnphepheileglnlysleu

115120125

leuargasnlystyrglyargileileasnmetvalservalsergly

130135140

vallysglythralaglyglnthrasntyrseralaalalysglyala

145150155160

leuvalglyalathrlysalaleualaglngluvalalalysargasn

165170175

ilethrvalasnalavalalaproglypheilelysthraspmetthr

180185190

glnglupheasngluaspgluleulysglymetileproalaasnarg

195200205

pheglyglualaglugluvalalaaspleuvalalapheleualaser

210215220

lyslysalasertyrilethrglygluvalileasnileasnglygly

225230235240

iletyrser